楊燕瀾，武宇輝，黃雀蘭，李成榮，王國兵，馬偉科

(深圳市兒童醫(yī)院內(nèi)二科，廣東 深圳 518026)

前列腺素E2在川崎病患者血漿中的表達(dá)及臨床意義

楊燕瀾，武宇輝，黃雀蘭，李成榮，王國兵，馬偉科

(深圳市兒童醫(yī)院內(nèi)二科，廣東 深圳 518026)

目的 觀察前列腺素E2(PGE2)在川崎病(KD)患兒血漿中的表達(dá)水平并探討其臨床意義。方法選擇2013年5月至2014年10月在我院住院的35例KD急性期患兒，在靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)治療前后采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血漿PGE2水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定外周血CD14+單核/巨噬細(xì)胞(MC)環(huán)氧化酶-1(COX-1)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平。另選15例健康同齡兒童作為對(duì)照組，測(cè)定上述指標(biāo)。結(jié)果KD急性期患兒血漿PGE2、COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；KD患兒中的冠狀動(dòng)脈病變組PGE2、COX-2水平高于無冠狀動(dòng)脈病變組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但COX-1、TNF-α、IL-6比較則差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IVIG治療后PGE2、COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平較治療前均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論KD急性期患兒血漿PGE2水平升高，其可能在KD的炎癥免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。

川崎病；前列腺素E2；環(huán)氧化酶-2

川崎病(Kawasaki disease，KD)又被稱為黏膜皮膚淋巴結(jié)綜合征(Mucocutaneous lymphnode syndrome，MCLS)，是兒科常見的全身血管炎性疾病。少部分未經(jīng)治療的患兒可發(fā)生冠狀動(dòng)脈損害甚至形成動(dòng)脈瘤。目前發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，流行病學(xué)及臨床研究提示KD可能為感染引起的急性免疫調(diào)節(jié)紊亂，進(jìn)一步導(dǎo)致血管壁損傷[1]。近年來，前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)在炎癥反應(yīng)和免疫中的作用得到越來越多的關(guān)注，在炎癥急性期的血管病變可能與PGE2有關(guān)[2-3]。已經(jīng)有學(xué)者關(guān)注到PGE2在川崎病患者血液中表達(dá)的改變[4-5]。本文旨在觀察PGE2在KD患兒血漿中的表達(dá)水平并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按照國內(nèi)川崎病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，收集2013年5月至2014年10月在我院住院的35例初次發(fā)病的KD患兒，年齡1～7歲，平均3.72歲，男性20例，女性15例，漢族。治療過程中心臟彩超動(dòng)態(tài)觀察患者冠狀動(dòng)脈的改變情況。若5歲以下兒童冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑>3 mm，5歲或5歲以上兒童冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑>4 mm；或者冠狀動(dòng)脈局部內(nèi)徑較鄰近處大于或等于1.5倍者，考慮合并冠脈損傷[6]。依據(jù)心臟彩超結(jié)果把患者分為有冠脈病變組14例和無冠脈病變組21例。另外收集15例健康兒童作為對(duì)照組，年齡1～6歲，平均3.94歲，男性9例，女性6例。KD組和對(duì)照組的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有受試者家屬對(duì)試驗(yàn)知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血標(biāo)本收集及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 在靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)治療前(病程10 d內(nèi))和治療后第3天(且體溫正常)分別肝素抗凝管留取KD患兒外周血標(biāo)本2 ml，并立刻送檢。800 rpm離心10 min分離上層血漿，雙抗體夾心ELISA(Bender MedSystem公司試劑盒)測(cè)定前列腺素E2水平，具體按照試劑盒說明書步驟操作。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)(1)單核/巨噬細(xì)胞(MC)總RNA的提取與定量：乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·Na2)抗凝管留取靜脈血3 ml，聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(P=1.077)密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞。免疫磁珠(美國Invitrogen公司，111.49 D)分離外周血CD14+MC。進(jìn)一步分離總RNA(Ambion公司試劑盒，AM1912)，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量，-80℃冰箱保存。(2)RT-PCR：參照說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(立陶宛MBI公司試劑盒，K1632)，取1 μl cDNA為模板，所需引物向上海英駿生物技術(shù)有限公司訂購合成(引物序列及PCR參數(shù)見表1)，PCR擴(kuò)增30～40循環(huán)。(3)RT-PCR產(chǎn)物鑒定：取COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6等及β-action擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl在2%瓊脂糖凝膠中，90 V電泳30 min，回收純化，送交invitrogen公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Genebank中目的基因mRNA序列比較，擴(kuò)增產(chǎn)物與目的基因序列完全一致。(4)Real-Time PCR：使用羅氏LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀(德國QIAGen公司SYBRGreen試劑盒，204143)，采用Relative Quantification Software Ver1.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以待測(cè)基因/β-action的CT比值表示結(jié)果。

表1 RT-PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，方差齊性檢驗(yàn)后用t檢驗(yàn)比較兩組之間的差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性使用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 IVIG治療前后和對(duì)照組血漿PGE2水平 KD急性期患兒IVIG治療前血漿PGE2水平顯著高于對(duì)照組[(18.48±3.57)pg/ml vs(6.90±1.77)pg/ml，t=11.89，P=0.000]；IVIG治療后下降[(9.74±2.71)pg/ml vs(18.48±3.57)pg/ml，t=12.73，P=0.000]，見圖1。KD-有冠狀動(dòng)脈病變組患兒血漿PGE2水平高于KD-無冠狀動(dòng)脈病變組[(19.95±3.74)pg/ml vs (17.50±3.17)pg/ml，t=2.09，P=0.045]，見圖2。

2.2 KD患兒治療前后外周血MC COX-1、COX-2、IL-6、TNF-α水平 KD患兒IVIG治療前COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平均較對(duì)照組兒童上升，IVIG治療后COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平均較治療前降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。KD患兒中的冠狀動(dòng)脈病變組COX-2水平高于無冠狀動(dòng)脈病變組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而兩組TNF-α、IL-6、COX-1水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.3 IVIG治療前血漿PGE2水平和COX-2、TNF-α水平的相關(guān)性 KD急性期患兒IVIG治療前PGE2水平和CD14+MC的COX-2、TNF-α水平均較正常對(duì)照組升高，血漿PGE2水平與COX-2、TNF-α水平均呈正相關(guān)(r=0.652，P=0.000；r=0.648，P=0.000)，見圖3。

圖1 KD患兒IVIG治療前后和對(duì)照組血漿PGE2水平(±s)

圖2 KD有冠脈病變和無冠脈病變組患兒血漿PGE2水平(±s)

表2 KD組IVIG治療前后和對(duì)照組樣本基因表達(dá)相對(duì)定量比較(±s)

表2 KD組IVIG治療前后和對(duì)照組樣本基因表達(dá)相對(duì)定量比較(±s)

注：均采用熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果以待測(cè)基因/β-action的比值表示。aKD組IVIG治療前后比較，P＜0.05；bKDIVIG前與對(duì)照組比較，P＜0.05；cKDIVIG后與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別KDIVIG前組KDIVIG后組對(duì)照組COX-1(×10-4) 23.82±6.90ab13.24±5.63 14.87±6.72 COX-2(×10-2) 25.09±11.31ab14.20±5.54 11.67±4.50 IL-6(×10-4) 46.65±25.04ab24.95±16.69c2.74±1.07 TNF-α(×10-3) 113.69±46.11ab76.74±27.15c5.87±2.42

表3 KD組IVIG治療前樣本基因表達(dá)相對(duì)定量比較(±s)

表3 KD組IVIG治療前樣本基因表達(dá)相對(duì)定量比較(±s)

組別KD-有冠狀動(dòng)脈病變組KD-無冠狀動(dòng)脈病變組t值P值COX-1(×10-4) 22.15±5.03 23.37±5.79 0.641 0.864 COX-2(×10-2) 28.00±14.56 22.29±8.67 1.458 0.015 IL-6(×10-4) 47.21±18.51 46.91±23.72 0.041 0.572 TNF-α(×10-3) 118.86±56.52 103.52±33.80 1.006 0.215

圖3 KD組IVIG治療前血漿PGE2水平和CD14+MC COX-2、TNF-α水平的關(guān)系

3 討 論

川崎病是一種急性自身免疫性血管炎綜合征，以亞裔人發(fā)病率為高，常見于＜5歲兒童[7]。本病為自限性疾病，多數(shù)預(yù)后良好，但部分患兒可引起全身多系統(tǒng)受累，最嚴(yán)重的就是冠狀動(dòng)脈損害，是兒童獲得性心臟病常見的病因之一，甚至成年后遺留嚴(yán)重后遺癥[8]。目前研究認(rèn)為，感染導(dǎo)致T細(xì)胞、MC等免疫活性細(xì)胞異常活化并產(chǎn)生的一系列炎癥細(xì)胞因子，可能在KD患兒的血管內(nèi)皮損傷過程中發(fā)揮重要作用并干擾自身免疫耐受[9]。我們課題組前期的研究也證實(shí)了川崎病急性期外周血單核細(xì)胞大量分泌NF-κB，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子過度產(chǎn)生[10]。此外，近年來研究顯示，氧化應(yīng)激因素可能參與了KD患者血管內(nèi)皮損傷的發(fā)生發(fā)展[11-13]。

PGE2是產(chǎn)花生四烯酸環(huán)氧化酶途徑的代謝產(chǎn)物之一，主要由MC產(chǎn)生，是機(jī)體應(yīng)激條件下參與免疫調(diào)節(jié)的重要介質(zhì)。PGE2通過受體的相互協(xié)同及拮抗作用，參與機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，如調(diào)控T細(xì)胞、引起血小板聚集。PGE2在炎癥發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同的作用，可以在致炎和抗炎兩個(gè)方向上參與整個(gè)調(diào)節(jié)過程[14-15]。研究數(shù)據(jù)顯示，在早期炎癥反應(yīng)階段，通過EP2受體，前列腺素E2在人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)β1-整合素活化，發(fā)揮促炎作用[5]。炎癥過程中PGE2通過與緩激肽、5-羥色胺、組胺等介質(zhì)在炎癥部位相互作用，引起血管尤其是冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張，增加血管通透性，并產(chǎn)生致熱源引起發(fā)熱，參與炎癥急性期的血管反應(yīng)。此外，氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中也有PGE2的參與[16]。

本研究的結(jié)果顯示，KD急性期患兒外周血中PGE2水平高于健康同齡對(duì)照組兒童(P＜0.05)，與CD14+MC中的炎癥因子TNF-α水平正相關(guān)，而且急性期存在冠狀動(dòng)脈病變的KD患者較未發(fā)生冠狀動(dòng)脈病變的KD患兒血漿中PGE2水平升高(P＜0.05)，患兒在IVIG治療后PGE2水平較治療前下降(P＜0.05)，提示PGE2參與了KD的發(fā)病機(jī)制并發(fā)揮著促炎作用，KD患兒血管炎的發(fā)生可能和其有關(guān)。大劑量IVIG通過降低急性期KD患兒PGE2水平，減少了氧化應(yīng)激所致的冠脈損傷[17]。

環(huán)氧化酶(COX)是合成PGE2的主要限速酶，分為環(huán)氧酶-1(COX-1)和環(huán)氧酶-2(COX-2)二種異構(gòu)酶。COX-1在體內(nèi)呈生理性表達(dá)，催化PGE2合成，臨床上常在KD急性期廣泛使用COX-1抑制劑阿司匹林對(duì)抗血小板聚集[18-19]。本組中KD患兒在IVIG治療后COX-1水平明顯下降，考慮可能與KD組患兒在IVIG治療后已經(jīng)使用了數(shù)天大劑量阿司匹林有關(guān)。COX-2是COX-1的異構(gòu)體，存在于多種類型細(xì)胞中，通常在正常生理狀態(tài)下沒有活性，在病理狀態(tài)或應(yīng)激狀態(tài)下受NF-κB等炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)激活，參與炎癥、腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20-21]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在KD急性期患兒外周血MC的COX-2顯著升高，有冠狀動(dòng)脈病變的KD患兒COX-2和PGE2均水平高于無冠狀動(dòng)脈病變患者，且PGE2水平和CD14+MC的COX-2水平呈正相關(guān)。

總之，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)KD急性期血漿PGE2水平升高，可能參與了KD冠脈病變過程，而IVIG治療可下調(diào)COX-2表達(dá)，從而降低PGE2水平，在KD治療過程中發(fā)揮抗血管炎、抗氧化應(yīng)激等作用。

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Changes and significance for prostaglandin E2level in plasma of patients with Kawasaki disease.

YANG Yan-lan, WU Yu-hui,HUANG Que-lan,LI Cheng-rong,WANG Guo-bing,MA Wei-ke.The Second Department of Medicine, Shenzhen Children's Hospital,Shenzhen 518026,Guangdong,CHINA

Objective To observe the prostaglandin E2(PGE2)level in plasma of patients with Kawasaki disease(KD)and discuss the clinical significance.MethodsThirty-five patients with KD which treated in our hospital from May 2013 to October 2014 were selected.The plasma concentrations of PGE2were analyzed by ELISA technique.Real-time quantitative PCR was used to evaluate the expression level of cyclooxygenases-1(COX-1),cyclooxygenases-2(COX-2),tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-6(IL-6)on CD14+monocyte/macrophage cells (MC)before and after intravenous immunoglobulin(IVIG).Fifteen healthy children were selected as the control group,with the above indicators measured.ResultsThe levels of PGE2,COX-1,COX-2,TNF-αand IL-6 in acute KD patients were significantly higher than those in the control group(P＜0.05),and they were down-regulated after IVIG(P＜0.05).The level of PGE2and COX-2 in KD patients with coronary artery lesion were significantly higher than those without coronary artery lesion(P＜0.05),and there were no statistically significant difference in COX-1, TNF-αand IL-6 between the two groups(P>0.05).ConclusionProstaglandin E2level in plasma of patients with KD is up-regulated and may play an important role in inflammatory and immune response and oxidative stress.

Kawasaki disease;Prostaglandin E2;Cyclooxygenases-2

R442.8

A

1003—6350（2015）18—2675—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0973

2015-03-15)

2013年深圳市醫(yī)療衛(wèi)生類科研項(xiàng)目(編號(hào)：201303057)

李成榮。E-mail：418027143@qq.com