周忠義，謝曉紅，田 佳，魏曉芬

(海南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，海南 海口 570311)

檢驗(yàn)性失血對MODS大鼠血清促紅細(xì)胞生成素、血紅蛋白和器官功能的影響

周忠義，謝曉紅，田 佳，魏曉芬

(海南省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570311)

目的 探討不同檢驗(yàn)性失血量對多器官功能障礙綜合征(MODS)大鼠血紅蛋白(Hb)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、器官功能及腎臟炎癥介質(zhì)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的影響。方法120只SD大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)術(shù)后按照隨機(jī)數(shù)表法均分為四組：MODS組(M組)、MODS+檢驗(yàn)性失血組1(ML1組)、MODS+檢驗(yàn)性失血組2 (ML2組)、MODS+檢驗(yàn)性失血組3(ML3組)，每組各30只。ML1組手術(shù)關(guān)腹后立即尾靜脈切開放血1 ml后壓迫止血，ML2組手術(shù)關(guān)腹后立即及術(shù)后24 h尾靜脈切開各放血1 ml后壓迫止血，ML3組手術(shù)關(guān)腹后立即、術(shù)后24 h及48 h尾靜脈切開各放血1 ml后壓迫止血。72 h統(tǒng)計(jì)各組病死率，每組取10只心臟取血2 ml，檢測Hb、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、EPO、腫瘤壞死因子(TNF-α)，取腎臟組織檢測核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、丙二醛(MDA)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口標(biāo)記(TUNEL)陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果制模72 h，M組死亡10只，病死率為33.3%，ML1組死亡13只，病死率為40%，ML2組死亡15只，病死率為50%，ML3組死亡18只，病死率為60%，兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與M組比較，ML1、ML2、ML3組大鼠72 h Hb明顯下降，CK-MB、ALT、BUN、Cr、TNF-α、腎臟NF-κB、MDA和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ML1組腎臟EPO濃度比M組略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，ML2、ML3組腎臟EPO濃度比M組明顯增高(P＜0.05)。結(jié)論檢驗(yàn)性失血可能通過貧血、上調(diào)EP0水平、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和促進(jìn)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致MODS大鼠器官功能障礙加重并影響預(yù)后。

盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)；多器官功能障礙綜合征；檢驗(yàn)性失血；促紅細(xì)胞生成素；細(xì)胞凋亡

盡管醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)步，但是膿毒癥(Sepsis)及其相關(guān)的多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)仍然是急危重癥患者的主要死亡原因。MODS患者因?yàn)閮?nèi)環(huán)境紊亂、病情復(fù)雜多變，需要頻繁抽血化驗(yàn)，由此引起的檢驗(yàn)性失血性貧血及其對病情的影響未引起臨床足夠的重視。姜東輝等[1]觀察到ICU患者抽血化驗(yàn)用血量很大，每例患者總檢驗(yàn)性失血量中位數(shù)為134.50 ml(32.5～751.5 ml)，患者的檢驗(yàn)性失血與患者治療過程中器官功能障礙數(shù)目、Marshall評(píng)分、ICU住院日相關(guān)，我們認(rèn)為檢驗(yàn)性失血已成ICU中的一個(gè)潛在危機(jī)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床檢驗(yàn)失血觀察不同檢驗(yàn)性失血量對盲腸結(jié)扎穿孔MODS大鼠血紅蛋白、促紅細(xì)胞生成素、器官功能、腎臟炎癥介質(zhì)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響，為臨床防治多器官功能障礙綜合征提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 健康清潔級(jí)Sprague Dawley雄性大鼠120只、體重250～280 g，由海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。所有動(dòng)物均自由覓食和覓水。按隨機(jī)數(shù)表法分為4組：MODS組(M組)、MODS+檢驗(yàn)性失血組1(ML1組)、MODS+檢驗(yàn)性失血組2(ML2組)、MODS+檢驗(yàn)性失血組3(ML3組)，每組各30只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前夜禁食，自由飲水。10%水合氯醛(0.3 g/kg體重)腹腔注射麻醉，腹部正中線切開腹壁進(jìn)入腹腔，行盲腸遠(yuǎn)端起至回盲瓣50%處結(jié)扎，用9#針頭在盲腸結(jié)扎的中間位置全層穿透，并輕擠出少許糞便以保證穿孔處的開放性。盲腸放回腹腔，連續(xù)縫合關(guān)腹。各組均于術(shù)畢皮下注射生理鹽水30 ml/kg，以補(bǔ)充術(shù)中液體的丟失。所有動(dòng)物手術(shù)在10 min之內(nèi)完成，保持一致性，術(shù)后分籠飼養(yǎng)。ML1手術(shù)關(guān)腹后立即尾靜脈切開放血1 ml后壓迫止血；ML2手術(shù)關(guān)腹后立即及術(shù)后24 h尾靜脈切開各放血1 ml后壓迫止血；ML3手術(shù)關(guān)腹后立即、術(shù)后24 h及48 h尾靜脈切開各放血1 ml后壓迫止血。于72 h每組取10只經(jīng)心臟取血2 ml并迅速放血處死，檢測大鼠血液中血紅蛋白(Hb)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、腫瘤壞死因子(TNF-α)，取腎臟組織用10%甲醛固定，做組織病理切片，部分用于檢測核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、丙二醛(MDA)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口標(biāo)記(TUNEL)陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及72 h病死率比較 四組大鼠12 h后出現(xiàn)病態(tài)，蜷縮，豎毛，呼吸急促，鼻腔溢出分泌物，眼角出現(xiàn)滲出物，活動(dòng)、覓食、飲水減少，陸續(xù)有大鼠死亡。隨時(shí)間推移檢驗(yàn)性失血組(ML1、ML2、ML3)大鼠精神萎靡，倦臥少動(dòng)嗜睡，皮毛膨松枯槁，呈淺黃色，鼻唇淡白失澤，耳尾蒼白發(fā)涼，團(tuán)縮拱背，病死數(shù)目增加，以ML3組最明顯，而M組大鼠48 h后一般情況有所好轉(zhuǎn)。制模72 h，M組死亡10只，病死率為33.3%；ML1組死亡13只，病死率為40%；ML2組死亡15只，病死率為50%；ML3組死亡18只，病死率為60%，兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 檢驗(yàn)性失血72 h對MODS大鼠Hb、CK-M0B、ALT、BUN、Cr的影響 檢驗(yàn)性失血組大鼠Hb明顯下降，CK-MB、ALT、BUN、Cr比M組明顯增高，兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

2.3 檢驗(yàn)性失血72 h對MODS大鼠血清TNF-α、EPO、腎臟NF-κB、MDA、TUNEL細(xì)胞凋亡的影響 檢驗(yàn)性失血組大鼠血清中TNF-α、EPO及腎臟NF-κB、MDA、TUNEL數(shù)目逐漸增高，兩兩比較除了ML1與M組血清EPO差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，余差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表1 檢驗(yàn)性失血72 h對MODS大鼠Hb、CK-MB、ALT、BUN、Cr的影響(±s)

表1 檢驗(yàn)性失血72 h對MODS大鼠Hb、CK-MB、ALT、BUN、Cr的影響(±s)

注：與M組比較，aP＜0.05；與ML1組比較，bP＜0.05；與ML2組比較cP＜0.05。

組別Hb(g/L)CK-MB(pg/ml)ALT(U/L)BUN(mmol/L)Cr(μmol/L) M組(n=10) ML1組(n=10) ML2組(n=10) ML3組(n=10) 106.7±7.7 91.1±6.4a82.7±3.6ab70.9±1.9abc35.70±4.85 67.16±6.41a95.73±4.85ab108.17±5.37abc443.42±5.35 72.69±6.57a103.44±5.35ab143.29±6.98abc7.6±3.6 10.4±2.4a15.6±4.6ab25.5±6.2abc69.7±5.4 85.1±6.7a129.7±9.4ab188.2±11.8abc

表2 檢驗(yàn)性失血72 h對MODS大鼠血清TNF-α、EPO、腎臟NF-κB、MDA、TUNEL細(xì)胞凋亡的影響(±s)

表2 檢驗(yàn)性失血72 h對MODS大鼠血清TNF-α、EPO、腎臟NF-κB、MDA、TUNEL細(xì)胞凋亡的影響(±s)

注：與M組比較，aP＜0.05；與ML1組比較，bP＜0.05；與ML2組比較，cP＜0.05。

組別TNF-α(pg/ml)EPO(ng/ml)NF-κB(IOD)MDA(nmol/mg)TUNEL M組(n=10) ML1組(n=10) ML2組(n=10) ML3組(n=10) 56.503±4.30 67.141±6.52a86.503±4.38ab98.033±7.79abc1.86±0.49 1.91±0.51 2.34±0.62ab2.95±0.78abc8857.026±1217.827 9253.572±3114.180a11026.639±3256.705ab16256±5802.634abc8.56±0.46 9.82±0.82a11.79±1.05ab15.03±1.92abc4.67±2.03 9.46±1.52a14.37±2.68ab24.03±3.25abc

3 討 論

膿毒癥及其相關(guān)的多器官功能障礙綜合征(MODS)是ICU患者常見的合并癥，目前仍然缺乏有效的防治方法，是住院急危重癥患者的主要死亡原因，病死率高達(dá)50%～100%，嚴(yán)重威脅人類健康[2]。

MODS患者因?yàn)椴∏閺?fù)雜多變、內(nèi)環(huán)境紊亂，需要頻繁地抽血化驗(yàn)以指導(dǎo)診斷和治療，由此導(dǎo)致的檢驗(yàn)性貧血和器官功能損害卻未引起臨床醫(yī)師足夠的重視。Shaffer[3]觀察了43例機(jī)械通氣時(shí)間>24 h的ICU患者結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者住院期間平均被采血(69±59)次，采血總量為(57±1120)ml，人均采血量為(245±213)ml，日均采血量為(16±7)ml，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出患者檢驗(yàn)性失血與病情嚴(yán)重程度、每天采血次數(shù)、采血量相關(guān)。進(jìn)一步研究證明當(dāng)人體每日失血量> 50 ml時(shí)就可能出現(xiàn)貧血，而且檢驗(yàn)性失血不僅與貧血和輸血率的增加有關(guān)，還可能加重組織器官缺氧，使MODS患者雪上加霜，增加患者病死率和醫(yī)療費(fèi)用[4]。本次動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)M臨床檢驗(yàn)失血觀察從少到多檢驗(yàn)性失血量對MODS大鼠72 h的影響發(fā)現(xiàn)Hb顯著下降，CK-MB、ALT、BUN、Cr顯著增高，病死率增加，證明檢驗(yàn)性失血可導(dǎo)致貧血并加重多器官功能障礙和影響預(yù)后，失血量越大越明顯。

膿毒癥所致MODS是機(jī)體炎癥反應(yīng)失控的結(jié)果，其核心是全身炎癥反應(yīng)與代償性抗炎反應(yīng)失衡[5]。TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)相互調(diào)控的核心部分，可促進(jìn)其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，產(chǎn)生炎癥的瀑布效應(yīng)，啟動(dòng)后續(xù)的一系列病理生理改變[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制模膿毒癥相關(guān)性MODS大鼠72 h血清TNF-α含量較低[(56.503±4.30)pg/ml]，從少到多檢驗(yàn)性失血盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)MODS大鼠血清中TNF-α顯著增高，表明MODS大鼠炎癥反應(yīng)加重與檢驗(yàn)性失血量相關(guān)，失血量越大炎癥反應(yīng)越明顯。

臨床上膿毒癥相關(guān)性MODS合并腎臟損害常見，而且治療難度明顯增加。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)和調(diào)控一系列炎性因子的基因表達(dá)，介導(dǎo)腎臟等臟器損傷[7]。采用免疫組化法檢測大鼠腎組織NF-κB表達(dá)，衡量大鼠腎臟炎癥反應(yīng)水平；采用硫代巴比妥酸反應(yīng)方法測定大鼠腎臟丙二醛(MDA)含量，評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化水平；采用TUNEL染色方法測定大鼠腎臟細(xì)胞凋亡數(shù)目。目前認(rèn)為膿毒癥腎損傷發(fā)病機(jī)制與血流動(dòng)力學(xué)的變化、內(nèi)毒素與炎性介質(zhì)、細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥相關(guān)性MODS大鼠檢驗(yàn)性失血量從少到多72 h腎臟NF-κB、MDA、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；提示檢驗(yàn)性失血通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和促進(jìn)細(xì)胞凋亡加重腎損傷。

EPO的作用是維持紅細(xì)胞造血前體細(xì)胞的存活并促進(jìn)其分裂，誘導(dǎo)晚期紅系祖細(xì)胞生長成為成熟的紅細(xì)胞[9]。本次研究結(jié)果顯示，單次檢驗(yàn)性失血MODS組大鼠72 h腎臟EPO濃度與對照組比較升高不明顯(P>0.05)，兩次以上檢驗(yàn)性失血MODS組大鼠72 h腎臟EPO濃度明顯增高(P＜0.05)，表明檢驗(yàn)性失血誘導(dǎo)MODS大鼠腎臟損傷時(shí)存在EPO高表達(dá)，提示多次檢驗(yàn)性失血可能是EPO生成的主要刺激因素。

綜上所述，檢驗(yàn)性失血可能通過貧血、上調(diào)EPO水平、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和促進(jìn)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致膿毒癥相關(guān)性MODS大鼠器官功能障礙加重和影響預(yù)后。

[1]姜東輝,萬獻(xiàn)堯.實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)失血與醫(yī)源性貧血——ICU的潛在危機(jī)[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版),2007,28(6):50-52.

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Impacts of different amounts of laboratory-testing blood loss on the hemoglobin,erythropoietin and organ function of rats with septic multiple organ dysfunction syndrome.

ZHOU Zhong-yi,XIE Xiao-hong,TIAN Jia, WEI Xiao-fen.Intensive Care Unit,People`s Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo discuss the impacts of different amounts of laboratory-testing blood loss on the hemoglobin(Hb),erythropoietin(EPO),organ function,renal inflammatory medium,oxidative stress and cell apoptosis of the rats with septic multiple organ dysfunction syndrome(MODS).MethodsOne hundred and twenty SD rats were averaged into four groups through the random number table after CLP:MODS group(M),MODS+laboratory-testing blood loss group 1(ML1),MODS+laboratory-testing blood loss group 2(ML2),MODS+laboratory-testing blood loss group 3(ML3),with 30 rats in each group.When the surgery was finished and the abdomen was closed,1 ml of blood was drawn immediately after the tail vein phlebotomy in group ML1,then compression was performed to stop bleeding.In group ML2,1 ml of tail vein blood was taken respectively immediately after the surgery and 24 h after surgery,while in group ML3,blood samples was collected 24 h after surgery and 48 h after surgery.Fatality rate was calculated 72 h after the surgery.Ten rats in each group was selected and 2 ml of blood was taken from the heart for detecting Hb,creatine kinase MB(CK-MB),alanine aminotransferase(ALT),urea nitrogen(BUN),creatinine (Cr),EPO,tumor necrosis factorα(TNF-α).Malondialdehyde(MDA),nuclear factor-κB(NF-κB)in the kidney tissue,as well as the amount of TUNEL positive cells were also detected.ResultsAfter 72 h of moulding,10 rats died in the group M and the fatality rate was 33.3%,with 13(40%)died in group ML1,15(50%)died in group ML2 and 18 (60%)died in group ML3.The differences between each two groups were statistically significant(P＜0.05).Compared with group M,the Hb of group ML1,ML2 and ML3 all declined significantly,while the levels of CK-MB,ALT,BUN, Cr,TNF-α,MDA,NF-κB,and the amount of TUNEL positive cells all increased significantly(P＜0.05).EPO concentration in group ML1 was slightly higher than that in group M,but with no statistical difference(P>0.05).The EPO concentration in the group ML2 and ML3 was significantly higher than that in group M(P＜0.05).ConclusionLaborato-ry-testing blood loss could aggravate the organ function disorder and affect the prognosis of rats with septic MODS by anemia,EPO level up-regulation,inflammatory reaction,oxidative stress and cell apoptosis promotion.

Cecal ligation and puncture;Multiple organ dysfunction syndrome;Laboratory-testing blood loss;Erythropoietin(EPO);Apoptosis

R-332

A

1003—6350（2015）18—2665—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0970

2015-04-14)

海南省衛(wèi)生廳科研立項(xiàng)課題(編號(hào)：瓊衛(wèi)2012PT-02)

周忠義。E-mail：adslzhouzy@sina.com