王 娜，王棟梁，范會平，石聚領(lǐng)，李 璽，宋一諾，艾志錄

(1.好想你棗業(yè)股份有限公司，河南鄭州451161;2.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，河南鄭州450002;3.鄭州春之蘭商貿(mào)有限公司，河南鄭州450002)

紅棗是中國的特產(chǎn)果品［1］，屬于鼠李科棗屬植物的成熟果實，是兼具藥食功能的滋補佳品［2］，含有許多生物活性物質(zhì)，如環(huán)磷酸腺苷、蘆丁、多糖、黃酮類化合物等［3］。黃酮類化合物具有鎮(zhèn)痛止瀉、清除羥自由基、防治潰瘍、抗氧化、抑制脂肪酶及抗過敏、抗菌、抗突變、抗癌、抗腫瘤、消炎及保肝等生理活性［4-5］，所以紅棗不僅具有豐富的營養(yǎng)，而且還有很強的醫(yī)療保健功能，常有“每日三棗，長生不老”的美譽［6］。隨著科技的發(fā)展，紅棗的提取工藝及檢測方法也有顯著性的改善，對紅棗中黃酮類化合物的研究也越來越深入。有關(guān)紅棗黃酮提取方法的研究很多，衡量標準多以黃酮得率為主;但在諸多研究中［7-9］并沒有考慮不同提取方法對大棗黃酮抗氧化活性的影響;由于紅棗在加工過程中，其皮渣大部分都被當做廢物處理掉，并沒有得到合理有效的利用，造成資源的浪費和環(huán)境的污染。因此，本研究以紅棗棗渣為試驗原料，研究不同提取工藝對棗渣黃酮的得率和抗氧化活性的影響，旨在得出既能保持棗渣黃酮的抗氧化活性又能提高棗渣黃酮得率的最適宜提取條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

棗渣，河南省好想你棗業(yè)股份有限公司;蘆丁標準品，北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司;DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)，日本東京化成工業(yè)株式會社;ABTS，美國Amresco公司;亞硝酸鈉、水楊酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、硝酸鋁、雙氧水、無水乙醇均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

T6新世紀可見紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;FA2104A型電子天平，上海精天電子儀器廠;RQ-700B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海朗儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;MG08S-2B微波試驗儀，南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司;冷凝回流裝置，北京九二零科技有限公司;水浴鍋，北京恒久科學儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 棗渣黃酮提取方法的選擇 根據(jù)文獻［10］的方法，在此基礎(chǔ)上稍作修改進行提取，m(料)∶V(液)=1 g ∶25 mL，提取液抽濾，得到的濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適量，最后用體積分數(shù)70%乙醇定容，此為棗渣總黃酮的提取液。

水浴回流法:放入80℃的水浴鍋中，連接好冷凝管，打開水流，冷凝回流2.5 h。

超聲波提取法:放入設(shè)定溫度為80℃的超聲波清洗器中，連接好冷凝管，打開水流，冷凝回流2.5 h。

微波提取法:放入溫度為50℃，微波功率為200 W的微波爐中提取90 s。

1.3.2 黃酮得率的測定 標準曲線的繪制根據(jù)文獻［11］的方法進行，在此基礎(chǔ)上稍作修改，將具塞試管改用為25 mL容量瓶，在各容量瓶中加入質(zhì)量分數(shù)5%的NaNO2溶液1 mL，加入質(zhì)量分數(shù)10%的Al(NO3)31 mL，加入質(zhì)量分數(shù)4%NaOH 10 mL，然后用蒸餾水定容至25 mL，做空白對照。

1.3.3 棗渣黃酮抗氧化活性的測定

1.3.3.1 棗渣黃酮對·OH清除效果的測定

根據(jù)文獻［12］的方法進行測定，并作適當修改，取0.6 mL 20 mmol·L-1水楊酸鈉于10 mL 試管中，加入 1.5 mmol·L-1FeSO42 mL，加入 2 mL的樣品溶液，最后以1.4 mL 6 mmol·L-1H2O2啟動反應(yīng)，迅速混勻，37℃恒溫水浴1 h，使用1 cm比色皿，以蒸餾水作空白對照，在510 nm處測其吸光度值，并排除自身吸光度值干擾。樣品、底液、空白的吸光度值分別設(shè)定為A樣、A底、A空，清除率計算公式如下:

1.3.3.2 棗渣黃酮對 DPPH自由基清除效果的測定

根據(jù)文獻［13］的方法進行測定，并對加樣量適當修改。試驗加樣量如表1所示。

表1 DPPH試驗加樣量Table 1 The reagent amount of DPPH test

1.3.3.3 棗渣黃酮對 ABTS(2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-奔并噻唑-6磺酸)二銨鹽)自由基清除效果的測定

ABTS自由基工作液的配置參照文獻［14］，配置 2.45 mmol·L-1的 K2S2O8及 7 mmol·L-1的ABTS自由基，兩者以1∶1的比例配比，置于室溫、避光條件下12～16 h，配置ABTS自由基工作液，將ABTS自由基母液用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處的吸光度值為0.700±0.020。試驗操作步驟參照文獻［15］，試驗樣品加樣量如表2所示，室溫避光放置6 min，使用1 cm比色皿，以無水乙醇作空白對照，在734 nm處測其吸光度值，并排除自身吸光度值干擾。清除率計算公式按(1)式計算。

1.3.4 微波提取工藝研究及試驗設(shè)計

1.3.4.1 單因素影響試驗

(1)微波提取時間對黃酮得率的影響 將樣品放入溫度為50℃，微波功率為200 W的微波爐中，分別提取 20、40、60、90、120、180 s后測定吸光度值，用回歸方程算出黃酮得率并作圖，得出最佳提取時間。

表2 ABTS自由基試驗加樣量Table 2 The reagent amount of ABTS·test

(2)微波功率對黃酮得率的影響 將樣品放入溫度為50℃的微波爐中，按最佳時間在150、200、250、300、350、450 W 的微波功率下提取，然后測定吸光度值，用回歸方程算出黃酮得率并作圖，得出最佳微波功率。

(3)料液比對黃酮得率的影響 將樣品放入溫度為50℃，在最佳功率，最佳提取時間條件下，按 m(料)∶V(液)為 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40分別提取，然后測定吸光度值，用回歸方程算出黃酮得率并作圖，得出最佳料液比。

1.3.4.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計

以提取時間(A)、功率(B)、料液比(C)為影響因素，根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果，設(shè)計本試驗自變量因素編碼及水平，自變量編碼值1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平。黃酮得率為響應(yīng)值［16-17］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)用 Design-Expert 7.0.0軟件，SPSS軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對棗渣黃酮抗氧化活性和得率的影響

不同提取方法所得棗渣黃酮抗氧化活性和得率見表3。由表3可知，微波提取法所得的黃酮得率均比水浴提取法和超聲波提取法獲得的黃酮得率高。對OH自由基和ABTS自由基清除率，2種方法呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，微波和水浴提取所得的黃酮對DPPH自由基清除率呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，微波提取與超聲波提取所得的黃酮對于DPPH自由基清除率雖沒有顯著性差異，但微波提取所得黃酮對DPPH自由基清除率高于超聲波提取所得黃酮對DPPH自由基清除率，由此可以看出，提取方法的不同，對黃酮的得率和抗氧化活性均有顯著性影響，抗氧化活性的差異，可能與提取方法、反應(yīng)體系等有關(guān)系。

表3 不同提取方法對黃酮的抗氧化活性和得率的影響Table 3 different extraction technology of flavonoids on antioxidant activity and yield %

2.2 微波提取對棗渣黃酮抗氧化活性和得率影響的單因素試驗

研究表明，微波提取棗渣黃酮時，微波時間、功率及料液比等都會對黃酮的得率和抗氧化活性有一定的影響。為了確定對棗渣黃酮抗氧化活性和得率的關(guān)鍵影響因素，進行單因素試驗。

2.2.1 微波時間對棗渣黃酮得率和ABTS自由基清除率的影響 固定微波溫度50℃，m(料)∶V(液)為1 g∶25 mL，功率200 W，研究不同微波時間對試驗指標的影響。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，當微波時間為90 s時，黃酮的得率及對ABTS自由基清除率達到最高值;而后隨著時間的增加，黃酮的得率又呈現(xiàn)減小的趨勢，這可能是因為長時間的處理可產(chǎn)生暴沸現(xiàn)象，并且隨著微波時間的延長，料液溫度增高，棗渣黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞［18］。因此選取微波時間為60、90、120 s為優(yōu)化試驗的因素水平。

圖1 微波時間對棗渣黃酮得率和ABTS自由基清除率的影響Fig.1 Effect of microwave time on jujube residues flavonoids yield and ABTS

2.2.2 微波功率對棗渣黃酮得率和ABTS自由基清除率的影響 由圖2可以看出，在功率為250 W的時候，棗渣黃酮的得率及對ABTS自由基清除率相對較高。這可能是因為隨著微波功率的增高，加熱速率會增大，導致分子的運動速度加快，溶解、擴散滲透的速度也會加快，使棗渣黃酮類化合物較易轉(zhuǎn)移到溶劑中［19］，所以棗渣黃酮的得率隨著功率的升高也有所升高，但當微波功率過高時，料液溫度會升高，影響黃酮結(jié)構(gòu)，進而使黃酮的得率又下降。因此選取微波功率為200、250、300 W為優(yōu)化試驗的因素水平。

2.2.3 料液比對棗渣黃酮得率和ABTS自由基清除率的影響 由圖3可以看出，在料液比達到1∶35時，棗渣黃酮的得率達到最高;隨著液料比的增大，棗渣黃酮對ABTS自由基清除率呈現(xiàn)增加的趨勢;但隨著液料比的繼續(xù)增加，棗渣黃酮的得率又減小，這可能是因為大量溶劑水吸收了溫度導致提取溫度降低的緣故。因此選取料液比為1∶30、1∶35、1∶40為優(yōu)化試驗的因素水平。

圖2 微波功率對棗渣黃酮得率和ABTS自由基清除率的影響Fig.2 Effect of microwave power on jujube residues flavonoids yield and ABTS

2.2.4 不同提取工藝下黃酮得率和ABTS+·清除率相關(guān)性分析 由表4可知，在不同微波時間下，棗渣黃酮得率和ABTS自由基清除率之間相關(guān)系數(shù)是0.89，為高度線性相關(guān);不同微波功率和不同液料比條件下，棗渣黃酮得率和ABTS自由基清除率之間相關(guān)系數(shù)分別為 0.56、0.59，為中度相關(guān)［20］，由此以棗渣黃酮得率為指標，研究微波提取棗渣黃酮的最佳工藝。

圖3 液料比對棗渣黃酮得率和ABTS自由基清除率的影響Fig.3 Effect of ratio of solvent to material on jujube residues flavonoids yield and ABTS

表4 不同提取工藝下黃酮得率與ABTS自由基清除率的相關(guān)性Table 4 The correlation of extraction process and ABTS

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對試驗進行了3因素3水平響應(yīng)面分析。見表5，結(jié)果見表6。

表5 中心組和試驗Box-Behnken方案設(shè)計的因素與水平Table 5 Factors and levels in the Box-Behnken central composite design

表6 Box-Behnken設(shè)計試驗方案與試驗結(jié)果Table 6 Box-Behnken central composite design arrangement and experimental result

利用Design Expert軟件中box-behnken方法對表6中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到模型為:

Y=1.70+0.044A+0.068B+0.021C-0.03AB-0.03AC+0.020BC-0.082A2-0.019B2-0.042C2

從回歸方程的一次項系數(shù)可以看出，3因素影響棗渣黃酮得率的大小順序為:功率＞時間＞液料比。對該模型進行顯著性和回歸模型系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表7。由表7可知，模型P=0.008 6＜0.01，表明該試驗所選取的回歸模型極其顯著，失擬項P=0.667 7為不顯著以及信噪比為8.840遠大于4，而且預測值與試驗值之間有較好的相關(guān)性(R2=0.901 0=0.773 6)，由此可知，回歸方程擬合度和可信度均很高，能夠很好地對棗渣黃酮的得率進行預測。由表7回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知，模型C項不顯著，A、B項顯著;交互項 AB、AC、BC 均不顯著，二次項 A2極顯著，B2、C2項不顯著;表明各個影響因素與響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。

表7 棗渣黃酮得率二次多項模型方差分析表Table 1 Quadratic model variance analysis of the jujube residues flavonoids yield

經(jīng)過Design Expert 7.0.0軟件得到的各因素響應(yīng)面圖，見圖4～圖6。

由圖5～圖6可知，當料液比一定時，隨著微波功率的上升，棗渣黃酮的得率先增加后減小，但減小趨勢不明顯;隨著微波時間的增加，棗渣黃酮的得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當微波功率一定時，隨著料液比上升，棗渣黃酮的得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢;隨著微波時間的增加，棗渣黃酮的得率也呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當微波時間一定時，隨著液料比的上升，棗渣黃酮的得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢;隨著微波功率的上升，棗渣黃酮的得率先增加后減小，但減小趨勢不明顯。以上分析與單因素結(jié)果趨于相同。

圖4 微波功率、時間對棗渣黃酮得率的影響Fig.4 Effect of microwave power and time on jujube residues flavonoids yield

圖5 料液比、時間對棗渣黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ratio of material to solvent and time on jujube residues flavonoids yield

圖6 料液比、功率對棗渣黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ratio of solvent to material and microwave power on jujube residues flavonoids yield

總體分析，此回歸方程擬合試驗結(jié)果較理想，且呈現(xiàn)較好的顯著性，利用Design Expert 7.0.0軟件綜合分析，微波時間97.82 s，微波功率 300.00 W，料液比 1∶37.58(g∶mL)，在此條件下的理論結(jié)果黃酮得率為1.760 0%。為了實際操作的方便，將此條件修正為料液比1∶38(g∶mL)，微波功率300 W，時間98 s。

2.4 驗證試驗

為了檢驗此模型預測的準確性，按照最佳提取條件進行提取，試驗重復操作3次。試驗結(jié)果見表8。試驗的平均相對標準偏差為3.13，精密度較好［21］，證明本次的試驗誤差較小，因此，優(yōu)化得到的微波提取條件參數(shù)準確、可靠，具有實用價值。在此試驗條件下所得的ABTS自由基清除率為66.09%。

3 結(jié)論

提取工藝對棗渣黃酮的得率和抗氧化活性均有影響，尤其抗氧化活性。同水浴提取法、超聲波提取法相比，微波提取法黃酮得率和抗氧化活性最高，微波提取法經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得出最優(yōu)工藝條件:料液比1∶38(g∶mL)，微波功率 300 W，提取時間98 s，黃酮得率為1.8%，ABTS自由基清除率為66.09%。

表8 驗證試驗結(jié)果Table 8 The results of verification testing

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