林 朔，李京向，陳寶元

(1.臨沂大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東臨沂 276000;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院肛腸科，北京 100700; 3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)外科，天津 300150)

象皮對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞作用研究

林 朔1，李京向△2，陳寶元3

(1.臨沂大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東臨沂 276000;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院肛腸科，北京 100700; 3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)外科，天津 300150)

目的:通過(guò)鼠成纖維細(xì)胞株L-929體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究象皮對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)作用的影響。方法:通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞株L-929，并加入生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏的提取液，檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖和膠原分泌的影響。結(jié)果:生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物在較高濃度下都能顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，生肌象皮膏相對(duì)于無(wú)象皮的生肌象皮膏促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用更為明顯。結(jié)論:象皮可明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，證明象皮在生肌象皮膏中有重要作用。

象皮;生肌象皮膏;成纖維細(xì)胞;體外培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)研究

為從細(xì)胞分子生物學(xué)水平考察生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏兩種膏藥對(duì)瘡瘍愈合的療效，有必要建立體外研究模型。本實(shí)驗(yàn)引入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的方法，通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞株L-929并加入生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏的提取液，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和膠原分泌的影響，從而判斷生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏對(duì)傷口愈合的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器

多功能微孔板分析儀，F(xiàn)lexStation 3，Molecular Devices公司，美國(guó);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo，美國(guó);一次性針頭式濾器，0.22 μm孔徑，Millipore公司，美國(guó);細(xì)胞培養(yǎng)瓶，96孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，50 ml離心管，Corning公司，美國(guó)。

1.2 材料

小鼠成纖維細(xì)胞株L-929自中國(guó)藥品生物制品檢定所引入;培養(yǎng)基采用含有L-谷氨酰胺及丙酮酸鈉配方的 DMEM高糖液體培養(yǎng)基(SH30243.01B，Hyclone公司，北京)，加入100 U/L青霉素，100 μg/ ml鏈霉素，10%胎牛血清(Bioind公司，以色列)，培養(yǎng)條件為37°C，5%CO2;2-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)，SigmaAldrich公司，美國(guó);dimetylsulfoxide(DMSO)，Amresco公司，美國(guó);Trypsin-EDTA溶液，SigmaAldrich公司，美國(guó);羥脯氨酸測(cè)試試劑盒(酶消化法)，南京建成生物工程研究所;生肌象皮膏藥粉(批號(hào)0903026)，天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥制劑室;無(wú)象皮的生肌象皮膏藥粉(批號(hào)0903027)，天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥制劑室。

1.3 方法

1.3.1 生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提取物制備 稱(chēng)取生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏藥物粉末各10 g，加入100 ml超純水室溫超聲提取1 h，連續(xù)2次，合并提取液，4℃、12000 rpm冷凍離心30 min，合并上清液，-20℃冷凍8 h，然后在冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥，得到生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提取物。實(shí)驗(yàn)前精密稱(chēng)取適量，用MilliQ級(jí)超純水溶解，0.22 μm孔徑的一次性針頭式濾器過(guò)濾除菌備用。

1.3.2 成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出含有L-929細(xì)胞株的凍存管，迅速投入裝有37℃溫水的密封不銹鋼杯中，蓋上蓋子輕輕振搖使凍存液溶化，75%乙醇消毒凍存管表面后擰開(kāi)蓋子，將含細(xì)胞的凍存液倒入50 ml聚丙烯離心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，輕搖混勻、密封，1000 r/ min離心5 min。倒掉上清液留下底部沉淀的細(xì)胞，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹動(dòng)培養(yǎng)基使細(xì)胞成均勻懸液，將細(xì)胞懸液種植在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每48 h換液1次，培養(yǎng)72 h后細(xì)胞達(dá)到80%融合、傳代。

傳代方法為倒掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，少量Trypsin-EDTA溶液快速洗滌貼壁細(xì)胞表面，倒掉。加入2 ml Trypsin-EDTA溶液，37℃孵育3 min，待細(xì)胞成片脫落成流沙狀時(shí)，加入10 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液倒入50 ml聚丙烯離心管中密封，1000 r/min離心5 min。倒掉上清液，留下底部沉淀細(xì)胞，加入適量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吸管輕吹培養(yǎng)基使細(xì)胞成均勻懸液，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液種植到細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞板中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將消化后重懸的 L-929細(xì)胞配成密度為1×105/ml的細(xì)胞懸液種植于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液，換入含有生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物的培養(yǎng)基。設(shè)置空白對(duì)照孔1組，6個(gè)平行孔。每組藥物濃度設(shè)置6個(gè)平行孔，在培養(yǎng)基中分別給予125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L、1000 mg/ L濃度的生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT PBS溶液10 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h吸出培養(yǎng)液，以PBS洗滌細(xì)胞表面1次，棄去液體計(jì)算加入100 μL的DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)生成的甲臜。在多功能微孔板分析儀上測(cè)定吸光度，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm。在L-929細(xì)胞培養(yǎng)液中加入生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物，培養(yǎng)24 h后對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。

1.3.4 成纖維細(xì)胞分泌總膠原含量測(cè)定 將消化后重懸的L-929細(xì)胞配成密度為1×105/ml的細(xì)胞懸液，種植于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入1 ml的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液，換入含生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物的培養(yǎng)基。設(shè)置空白對(duì)照孔1組，4個(gè)平行孔。每組藥物濃度設(shè)置4個(gè)平行孔，在培養(yǎng)基中分別給予125、250、500 mg/L濃度的生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物。培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，使用羥脯氨酸測(cè)試試劑盒，用消化法檢測(cè)L-929細(xì)胞總膠原的分泌量(以總膠原中的羥脯氨酸計(jì)算)。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用FlexStation 3型酶標(biāo)儀在550 nm處檢測(cè)吸光度A值，通過(guò)下列公式計(jì)算樣品中羥脯氨酸及總膠原含量。樣品中羥脯氨酸濃度(mg/L)=(測(cè)定孔A值-空白孔A值)/(標(biāo)準(zhǔn)孔A值-空白孔A值)。樣品中總膠原濃度(mg/L)=樣品羥脯氨酸濃度×7.46×稀釋倍數(shù)(7.46為從羥脯氨酸換算為膠原的計(jì)算常數(shù))。

1.3.5 對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞總膠原分泌量的影響 通過(guò)木瓜蛋白酶消化成纖維細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)，可以將細(xì)胞分泌總膠原中的羥脯氨酸游離出來(lái)。由于膠原中的羥脯氨酸含量固定，因此通常用測(cè)定羥脯氨酸含量的方法簡(jiǎn)單間接測(cè)定膠原含量。在L-929細(xì)胞培養(yǎng)液中加入生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物，培養(yǎng)48 h后用木瓜蛋白酶消化細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞消化液中羥脯氨酸的濃度。利用羥脯氨酸與膠原的計(jì)算常數(shù)，計(jì)算出生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物對(duì)L-929細(xì)胞總膠原蛋白分泌量的影響。

2 結(jié)果

2.1 生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖的影響

表1顯示，生肌象皮膏水提物在500 mg/L和1000 mg/L濃度下，能顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖(P＜0.05)。無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物在1000 mg/ L的濃度下，也能顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。在250 mg/L和500 mg/L的濃度下，生肌象皮膏水提物組的細(xì)胞活性明顯高于無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物組的細(xì)胞活性(P＜0.05)。

表1 生肌象皮膏與無(wú)象皮生肌象皮膏對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 生肌象皮膏與無(wú)象皮生肌象皮膏對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:*P＜0.05;與同劑量無(wú)象皮的生肌象皮膏藥物水提物組比較:#P＜0.05

組 別 藥物濃度(mg/L) 細(xì)胞增殖活性O(shè)D(A570nm) 125 250 500 1000給藥組 生 肌 象 皮 膏 藥 物 水 提 物 0.8053±0.0135 0.8141±0.016# 0.8263±0.0111#* 0.8354±0.0128*無(wú)象皮的生肌象皮膏藥物水提物 0.7943±0.0125 0.7802±0.0093 0.7981±0.0139 0.8384±0.0095*對(duì)照組 空 白 組0.8164±0.0134

2.2 生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞總膠原分泌量的影響

表2顯示，生肌象皮膏水提物在125 mg/L和250 mg/L的濃度下，能顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞的膠原分泌(P＜0.05)。生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物在500 mg/L的濃度下，由于作用于L-929細(xì)胞的時(shí)間較長(zhǎng)(48 h)，可能對(duì)細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，因此膠原的分泌量相對(duì)于空白對(duì)照組和低濃度給藥組反而有所降低。

表2 生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物對(duì)L-929細(xì)胞總膠原分泌量的影響(±s)

表2 生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏水提物對(duì)L-929細(xì)胞總膠原分泌量的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:*P＜0.05

組別 羥脯氨酸(μg/ml)總膠原蛋白(μg/10000個(gè)細(xì)胞)空 白 對(duì) 照 組3.5451±0.3283 0.7934±0.0735無(wú)象皮生肌象皮膏125mg/L 3.4357±0.6039 0.7689±0.1352無(wú)象皮生肌象皮膏250mg/L 3.8203±0.4906 0.8550±0.1098無(wú)象皮生肌象皮膏500mg/L 2.5603±0.4016 0.5730±0.0899生肌象皮膏1 2 5 mg/L 4.3143±0.3080*0.9656±0.0689*生肌象皮 膏2 5 0 mg/L 4.2082±0.2769*0.8609±0.1695*生肌象皮膏5 0 0 mg/L 2.7670±0.4998 0.6917±0.1713

3 討論

中醫(yī)外用藥物有著悠久的歷史。清代名醫(yī)徐靈胎曾謂:“用膏貼之，閉塞其氣，使藥性從毛孔而入其腠理，通經(jīng)貫絡(luò)或提而出之，或攻而散之，較之服藥尤有力，此至妙之法也。”生肌象皮膏是中醫(yī)外科最具有生肌長(zhǎng)皮作用的外用藥代表之一，最早出自于張山雷的《瘍科綱要》一書(shū)，由象皮粉、當(dāng)歸、血余炭、龜板、生地、生爐甘石、生石膏、香油、白蠟組成。方中以象皮粉、生石膏、爐甘石、血余炭為主藥，配以滋陰養(yǎng)血、活血化瘀收斂之品，共奏生肌長(zhǎng)皮、活血養(yǎng)血之功。

生肌象皮膏用于治療各種瘡瘍疾病，在潰瘍期膿腐基本已凈而皮不生肉不長(zhǎng)時(shí)應(yīng)用最佳，多年來(lái)生肌象皮膏廣泛治療各種疾病療效確切，如有效治療各種慢性潰瘍、皮膚損傷、感染傷口及骨髓炎、褥瘡、燒傷、糖尿病足病等都有很好的療效。

因生肌象皮膏的主藥象皮來(lái)自于亞洲大象的皮膚故正品缺貨?！吨腥A人民共和國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)法》2004年修正版明確規(guī)定，禁止獵捕、殺害與交易大象。此外我國(guó)2005版《中藥大詞典》已明確將象皮從該藥物中剔除，所以造成臨床生肌象皮膏無(wú)象皮可用的局面，故象皮在生肌象皮膏中的作用和地位及其代用品研究就顯得十分迫切和重要。如臨床與實(shí)驗(yàn)證實(shí)，象皮在生肌象皮膏中具有重要的作用和地位，那么就可進(jìn)一步開(kāi)展象皮的代用品研究。

成纖維細(xì)胞的增殖及細(xì)胞分泌膠原的能力，一直是學(xué)術(shù)界評(píng)價(jià)皮膚再生及修復(fù)重建的通用標(biāo)準(zhǔn)。所以本實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證象皮在生肌象皮膏中具有重要的作用和地位，故引入成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的方法，通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞株L-929，并加入生肌象皮膏與無(wú)象皮的生肌象皮膏提取液，檢測(cè)兩者對(duì)細(xì)胞增殖和膠原分泌的影響。研究證實(shí)，生肌象皮膏促進(jìn)細(xì)胞增殖、成纖維細(xì)胞分泌膠原的作用更為明顯，進(jìn)一步證明對(duì)于促進(jìn)皮膚的正常結(jié)構(gòu)修復(fù)，象皮起到了必不可少的重要作用，說(shuō)明象皮在生肌象皮膏中確實(shí)具有重要作用和地位。因此，尋找療效相當(dāng)且能替代象皮的中藥、研發(fā)象皮代用品、保證生肌象皮膏繼續(xù)為患者解除疾苦迫在眉睫。

Research of Elephant Skin Effect on Fibroblasts in Vitro

Objective:Study the Elephant Leather effect on fibroblast growth by the culture of Mouse fibroblast cell line L-929.Methods:Having vitro cultured mouse fibroblast cell line L-929，studied on the cell proliferation and collagen secretion by joined extract drugs of Sheng Ji Xiang Pi Ointment and Sheng Ji Xiang Pi Ointment without elephant leather respectively.Result:The water extract drugs of Sheng Ji Xiang Pi Ointment showed better in promoting the proliferation of fibroblasts than the Sheng Ji Xiang Pi Ointment without elephant leather at higher concentrations，and then Sheng Ji Xiang Pi Ointment can promote to proliferate more quickly than the Sheng Ji Xiang Pi Ointment without elephant leather. Conclusion:Elephant Leather significantly promote the growth of fibroblasts，promote wound healing，thereby Elephant leather had an important role in Sheng Ji Xiang Pi Paste.

Elephant Leather;Sheng Ji Xiang Pi Ointment;Fibroblast Cell;Vitro Culture;Experimental Study

R961

:B

:1006-3250(2015)09-1102-03

2015-03-08

林 朔(1971-)，女，醫(yī)學(xué)本科，從事中藥外用對(duì)動(dòng)物創(chuàng)面愈合的影響研究。

△通訊作者:李京向(1970-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)外科、肛腸疾病、瘡瘍病的臨床與應(yīng)用研究，Tel: 13436387039，E-mail:bjbjljx2011@126.com。

LIN Shuo1，LI Jing-xiang2△，CHEN Bao-yuan3

(1．Experimental Center，Linyi University，Shandong，Linyi 276000，China;2．Dongzhimen Hospital Affilicated to the Beijing University of Traditional Chinese Medicine，surgery department of Anal，Beijing 100700，China; 3．The Second Hospital affiliated to Tianjin University of TCM，surgery department of TCM，Tianjin 300150，China)