楊 益，阿不都·熱扎克，木拉提·熱夏提，王文光，哈木拉提·吐送，閆昆吾，王玉杰

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 烏魯木齊 830054)

腎癌患者手術前后血清miRNA-21的差異表達及意義

楊 益，阿不都·熱扎克，木拉提·熱夏提，王文光，哈木拉提·吐送，閆昆吾，王玉杰

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的 觀察血清miRNA-21在腎癌患者中表達的差異，以篩選腎癌術后檢測指標。方法提取32例腎癌患者(術前一次，術后6個月一次)、20例健康人群(對照組)及15例腎臟良性腫瘤患者血清，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）測量miRNA-21在各組的差異表達。結(jié)果不同民族、性別和年齡水平的腎癌術前患者，其血清miRNA-21的表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而血清miRNA-21在腎癌術前組、對照組及腎臟良性腫瘤組之間比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=27.658，P=0.001)，兩兩比較結(jié)果顯示：腎癌術前組與對照組比較(Z=腎細胞癌；微小RNA；血清；生物標志物5.072，P=0.000)、腎癌術前組與良性腫瘤組比較(Z=-2.5，P=0.012)、良性腫瘤與對照組比較(Z=-2.439，P=0.014)差異均有統(tǒng)計學意義；血清miRNA-21在腎癌術前和術后6個月之間比較差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.674，P=0.007)；血清miRNA-21在腎癌術前組中高表達(術前組中位數(shù)0.34，良性腫瘤組中位數(shù)0.15，對照組中位數(shù)0.06)，血清miRNA-21在腎癌術后6個月的表達呈下調(diào)趨勢(術前中位0.34，術后6個月中位數(shù)0.15)。miRNA-21篩查腎癌的敏感度為90%、特異度為84.4%，ROC曲線下面積(AUC)為0.92。結(jié)論血清miRNA-21在腎癌患者中高表達，其有可能成為腎癌診斷、術后檢測的生化標志物。

腎細胞癌；微小RNA；血清；生物標志物

微小RNA(miRNA)是一類新的、非蛋白編碼的單鏈RNA，通過與靶基因mRNA非翻譯區(qū)(3'UTR)完全互補或部分互補結(jié)合達到靶基因翻譯抑制或降解作用[1]。1993年，miRNA被首次發(fā)現(xiàn)。經(jīng)過多年努力，miRNA作用機制及功能研究方面取得重大突破，成為生命科學領域重大前沿之一。多項研究表明[2-7]，miRNA在生理、病理過程中尤其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均起到調(diào)節(jié)作用，其在腫瘤組織中異常表達已廣泛報道：miRNA成為腫瘤重要的調(diào)節(jié)因子，對細胞增殖、細胞周期控制、逃避細胞凋亡、組織侵襲及轉(zhuǎn)移、血管形成及無限復制潛力均起到重要的調(diào)節(jié)作用，并且據(jù)報道，miRNA可能成為多種癌癥的腫瘤標志物[8-9]。迄今已在包括腎癌等的多種癌癥中發(fā)現(xiàn)特定的miRNA表達譜，其表現(xiàn)為高、低表達[1，10-11]。但上述這些研究主要局限在通過有創(chuàng)的穿刺或者手術得到癌癥組織與癌旁正常組織，分析其miRNA情況，而對于血清、血液miRNA研究比較少見。已有報道稱，miRNA在血漿、血清和其他體液中表達有一定豐度，此外，血液中miRNA的表達量在男性、女性以及不同年齡階段相似[12]。miRNAs不僅在血清中具有可測量的豐度，而且具有非常良好的穩(wěn)定性，不易受溫度、酸堿度、放置時間長短影響[13]。這些血清miRNA作為一種新的生物標志物，表現(xiàn)出極大的潛力。因此我們應用RT-qPCR分析比較血清miRNA-21在腎癌患者術前與術后6個月的差異，初步探討miRNA-21能否成為腎癌術后的檢測指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采取隨機數(shù)表法，抽取2011年11月至2012年12月新疆重大疾病資源生物樣本庫保存的原發(fā)性腎癌患者術前及術后6個月血清標本各32例以及腎臟良性腫瘤患者血清標本15例(所取標本均經(jīng)新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得患者知情同意)。腎癌患者術前組、腎臟良性腫瘤組抽血前均未行放化療、手術切除和介入等任何相關治療。腎癌患者男性18例，女性14例；漢族20例，維吾爾族12例；年齡34～72歲，中位年齡65歲；＞50歲19例，≤50歲13例。腎臟良性腫瘤組男9例，女6例；年齡22～43歲，中位年齡33歲。健康對照組來源于本院體檢中心，名族、年齡、性別比例均與腎癌組相匹配。

1.2 方法 (1)使用一次性真空采血管采集血清，收集受試者空腹外周血3～5 ml，室溫靜置15～30 min，4℃離心10 min，小心吸取上清液到潔凈1.5 ml離心管，3 h內(nèi)分離血清，-80℃冰箱保存。(2)miRNA分離，按照miRcute miRNA提取分離試劑盒(離心柱型)說明書嚴格操作，使用紫外分光光度儀測定濃度，-80℃冰箱保存待用。(3)miRNA逆轉(zhuǎn)錄：首先miRNA 3'末端進行加Poly(A)處理，其次Poly(A)修飾的miRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，兩階段設置37℃60 min，合成的cDNA反應液放置-20℃保存待用。(3)RT-qPCR取適量上述cDNA放入去RNase的PCR管中，參照TIANGEN BIOTECH公司SYBRGreen熒光定量PCR檢測試劑盒說明書加入上下游引物、2×SYBR Green PCR Master Mix，無RNase H2O配成20μl反應體系。將配好的反應體系放入Icycler IQ/Q5 PCR儀系統(tǒng)中，設置反應程序參數(shù)：94℃2 min，94℃20 s，60℃34 s，共40個循環(huán)。每個樣本重復2次，記錄每個PCR管中熒光信號達到設定的閾值時所循環(huán)的次數(shù)即CT值。以miRNA-16為內(nèi)參照，根據(jù)Schmittgen等[14]采用的相對定量法計算，F(xiàn)=2-△ct，△ct=ctmiRNA-21-ctmiRNA-16，F(xiàn)表示目標基因表達量相對于同一樣本miRNA-16的變化倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，資料非正態(tài)，方差不齊，多個樣本比較采用非參數(shù)Kruskkal-WallisH秩和檢驗，兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗，術前、術后比較采用自身配對Wilcoxon符號秩和檢驗。使用Medcalc計算敏感度、特異度及其曲線下面積(ROC)。miRNA-21與臨床資料關系采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-21和miRNA-16的擴增曲線和溶解曲線 圖1為miRNA-21和miRNA-16部分擴增曲線，圖2為它們的溶解曲線，溶解曲線均為單峰，說明擴增產(chǎn)物特異，無其他產(chǎn)物及二聚體。

圖1 miRNA部分擴展曲線

圖2 miRNA部分溶解曲線

2.2 三組受試者的血清miRNA-21表達比較 腎癌術前組患者的血清miRNA-21表達為0.344 (0.211，0.511)；腎臟良性腫瘤組患者的miRNA-21表達為0.15(0.062，0.364)；健康對照組miRNA-21表達為0.669(0.019，0.140)。三組的血清miRNA-21表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；三者之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 血清miRNA-21在腎癌患者術前與術后6個月組中的差異 腎癌術前組患者的血清miRNA-21為0.344(0.211，0.511)；腎癌術后組患者的miRNA-21為0.148(0.044，0.440)。腎癌患者術前與腎癌術后6個月組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，miRNA-21相對水平在術后降低，接近腎臟良性腫瘤組。

2.4 血清miRNA-21的表達水平對腎癌患者的診斷效率 利用Medcalc軟件得出最佳診斷分界點，計算miRNA-21篩查腎癌的敏感度為90%、特異度為84.4%(見圖3)。ROC曲線下面積(AUC)為0.92，95%置信區(qū)間(0.812，0.977)，AUC假設檢驗P＜0.001為差異有統(tǒng)計學意義。

圖3 miRNA-21受試者工作曲線

3 討論

腎細胞癌(RCC)是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤，占成人惡性腫瘤的3%左右，死亡率在40%以上[15-16]。通常，腎癌早期無臨床癥狀，并缺乏早期診斷方法。目前，手術切除仍是腎癌唯一的治療方法，根治性腎切除術后，還存在20%～40%的復發(fā)率。目前臨床上仍無標準血清生物標志物，用來診斷腎癌或發(fā)現(xiàn)早期復發(fā)患者。據(jù)文獻報道，雖然現(xiàn)存幾種血清蛋白可用于晚期或復發(fā)性腎癌的檢測[17]，但不具備標準分子標記物的特異性及敏感性特征。因此尋找一種無創(chuàng)可行的早期診斷方法對臨床工作及其重要。

本研究前期根據(jù)生物信息學及國內(nèi)外研究進展做了大量篩選工作。已有文獻報道，在多種腫瘤中(甲狀腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、食管鱗狀癌、膽管癌、大腸癌、宮頸癌)，miRNA-21是表達上調(diào)最頻繁的miRNA之一，其表達在腫瘤組明顯高于健康對照組[18-23]。MiRNA-21參與形成RAS致癌信號，轉(zhuǎn)錄誘導AP1下游的RAS基因，并發(fā)揮其致癌基因的致癌作用[24]。腎癌由多種基因調(diào)控紊亂導致，其具體機制尚不清楚，可能是以一種或多種致癌基因上調(diào)作用為主導或以一種或多種抑癌基因下調(diào)作用為主導，也可能是一種或多種致癌基因與一種或多種抑癌基因的共同主導作用聯(lián)合導致。張濤等[25]報道腎癌有關的下調(diào)抑癌基因有VHL(Von Hippel-Lindau)、p53和p16；與腎癌有關的上調(diào)原癌基因有myc基因家族。

本實驗應用miRNA-16作為內(nèi)參基因，對靶基因進行歸一化處理，減少目標基因個體化差異。分析結(jié)果顯示：首先，血清miRNA-21在腎癌患者的表達高于健康對照和腎臟良性腫瘤組，因此我們猜想血清miRNA-21在腎癌患者的高表達可能與腎癌的發(fā)生有關。2013年，Dey等[26]的相關文獻報道，miRNA-21不僅在腎癌中表達上調(diào)，而且調(diào)節(jié)腎癌細胞的增殖和侵襲，在此基礎上得知，PTEN可能是miR-21的下游靶基因，由此，miR-21在人體外的作用也得到研究證實。其次，血清miRNA-21在腎癌患者術后的表達低于術前患者。很多研究表明miRNA-21是致癌基因，其表達增大到一定閾值可能發(fā)生腎癌。本研究認為，腎癌患者術后、放化療、免疫治療及基因治療后，當血清miRNA-21的表達低于某一限定值時，即可判定預后轉(zhuǎn)歸情況，從而達到臨床評估腎癌患者治療效果和預測復發(fā)轉(zhuǎn)移的目的。根據(jù)Medcalc軟件得出的診斷試驗結(jié)果表明，血清miRNA-21在篩查腎癌時具有較高的敏感度和特異度，由AUC＞0.9，我們得出結(jié)論：血清miRNA-21具有較高的篩查價值。

血清miRNA不僅有理由成為腎癌診斷、預測療效的生物標志物，而且在腫瘤的基因治療中擁有良好前景。相信不遠的將來，血清miRNA成為癌癥的“金標準”時代會成為現(xiàn)實。盡管如此，本研究仍存在一些局限性?？紤]在以后實驗中增加樣本量、隨訪時間以及采用多中心挑取樣本。并且本課題在確定血清miRNA-21可能致癌的表達閾值研究方面仍需更多努力。

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Differential expression of serum miRNA-21 in patients with renal cell carcinoma before and after surgery and its significance.

YANG Yi,ABUDU·Rezake,MULATI·Rexiati,WANG Wen-guan,HAMULATI·Tusong,YAN Kun-wu, WANG Yu-jie.Department of Urology,the First Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo investigate the changes in expression of serum miRNA-21 in patients with renal cell carcinoma(RCC)before and after surgery,and to identify detection indexes for renal cell carcinoma after surgery.MethodsThe expression of serum miRNA-21 was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)in a larger cohort,including 32 RCC patients(RCC group),20 healthy individuals(control group)and 15 patients with benign renal tumor(benign tumor group).The RCC patients were detected preoperatively and 6 months postoperatively.ResultsAmong RCC patients,there was no statistically significant differences in serum miRNA-21 expression between different ethnicity,gender and age(P＞0.05).Significant differences existed in preoperative RCC patients,controls and patients with benign renal tumor(Z=27.536,P＜0.001).Paired comparisons showed statistically significant differences between preoperative RCC patients and the controls(Z=-5.072,P＜0.001),preoperative RCC patients and patients with benign renal tumor(Z=-2.5,P＜0.012),controls and patients with benign renal tumor (Z=-2.439,P＜0.014).Between preoperative and postoperative RCC patients,significant difference was found (Z=-2.684,P＜0.007).Serum miRNA-21 expression level revealed an up-regulation in preoperative RCC patients(preoperative RCC group,with a median of 0.34;benign renal tumor group,0.15;control group,0.06),but it a down-regulation in postoperative RCC patients(preoperative RCC group,with a median of 0.34,postoperative RCC group, 0.15).As a biochemical marker,miRNA-21 has sensitivity of 90%,specificity of 84.4%,with an area under the ROC curve(AUC)of 0.92.ConclusionThe differences of serum miRNA-21 expression in a larger cohort(32 RCC patients,20 controls and 15 patients with benign renal tumor)are statistically significant.Therefore,serum miRNA-21 is expected to become a biochemical marker for the diagnosis and post-operational determination of RCC.

Renal cell carcinoma;miRNA;Serum;Biomarkers

R737.11

A

1003—6350（2015）07—0948—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0340

2014-10-22)

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(編號：2013211A101)

王玉杰。E-mail：wangyj-mr@vip.sina.com