陳建安，周靜，朱學海，丁茜，何永明，李曉婷，梁燕

(中山大學附屬東華醫(yī)院檢驗科，廣東東莞523110)

118例急性白血病五色流式細胞術免疫分型與FAB分型的結(jié)果分析

陳建安，周靜，朱學海，丁茜，何永明，李曉婷，梁燕

(中山大學附屬東華醫(yī)院檢驗科，廣東東莞523110)

目的探討急性白血病五色流式細胞術免疫分型與FAB分型的關系和表達規(guī)律。方法通過CD45/SSC設門的五色流式細胞儀檢測118例急性白血病患者骨髓細胞的表面抗原，并進行免疫表型分析。結(jié)果在88例AML患者中髓系相關抗原的表達率依次為CD33(93.2%)＞CD13(88.6%)＞CD117(86.4%)，部分AML患者伴表達淋系相關抗原，主要為CD56(25.2%)、CD7(11.3%)、CD19(2.2%)、CD20(2.2%)；M3中高表達CD117(83.7%)、CD13(83.7%)、CD33(83.7%)，但均不表達CD34、HLA-DR，且SSC較大；M4、M5中可見CD64、CD4、CD14明顯表達高于AML其他亞型(P＜0.01)。19例B-ALL患者中CD19的表達率最高(100%)，其次為CD34(90.1%)、HLA-DR(90.1%)、CD10(90.1%)；9例T-ALL患者中CD7的表達率最高(100%)，其次為CD4(77.8%)、CD5(77.8%)、CD2(66.7%)、CD3(66.7%)、CD34(55.6%)。結(jié)論通過五色流式細胞術進行白血病免疫分型是形態(tài)學分型診斷重要的補充，能夠提供更客觀的診斷依據(jù)，對提高急性白血病的診斷正確率、預后判斷和治療方案的選擇有重要的意義。

急性白血??；免疫分型；流式細胞術；CD56

FAB分型標準明確對急性白血病的診斷、治療、預后及生物學特性的研究起到重要作用，是目前應用最多和最廣的分型及診斷方法，但形態(tài)學診斷存在主觀性，加上白血病細胞的異質(zhì)性和多態(tài)性，診斷正確率低(64%～77%)。免疫學分型與FAB分型比較，不僅更客觀、準確、重復性好，還可鑒別白血病細胞的起源、分化階段及基因克隆的特點，提高了白血病的診斷，可將99%的急性髓細胞白血病(AML)與急性淋巴細胞白血病(ALL)鑒別開[1]。流式細胞術是一種對單個細胞表面或胞內(nèi)抗原進行定性分析或定量分析的技術，它具有準確、快速、靈敏、多參數(shù)的特點。本文通過五色流式細胞術對急性白血病患者的骨髓液進行白血病免疫分型，同時做涂片染色行FAB分型，探討免疫分型與FAB的關系和變化規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取本院門診和住院急性白血病患者118例，其中男65例，女53例，年齡16～65歲。所有患者均做細胞形態(tài)學、組織化學、免疫分型，部分做骨髓FISH、染色體培養(yǎng)，按張之南主編的《血液病診斷及療效標準》進行明確診斷[2]。

1.2 儀器和試劑美國BECKMAN COULTER公司生產(chǎn)的FCM-500 MCL流式細胞儀，日本奧林巴斯BX-51顯微鏡；BECKMAN公司生產(chǎn)的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD10、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD33、CD34、CD38、CD45、CD64、CD117、HLA-DR等熒光抗體(FITCPEECDPC5PC7標記)試劑、溶血素、磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液、流式專用管；珠海BASO公司提供的瑞氏、POX、PAS、特異性酯酶、非特異性酯酶染液等。

1.3 方法按白血病分型方案每管加入5種不同熒光標記的抗體，抗體組合為：(1)IgG-FITC/ IgG-PE/IgG-ECD/IgG-PC5/CD45-PC7；(2)CD15-FITC/ CD11b-PE/CD16-ECD/CD33-PC5/CD45-PC7；(3)HLA-DR -FITC/CD64-PE/CD34-ECD/CD14-PC5/CD45-PC7；(4)HLA -DR-FITC/CD13-PE/CD34-ECD/CD117-PC5；(5)KAPPAFITC/LAMPDAR-PE/CD19-ECD/CD38-PC5/CD45-PC7；(6)CD20-FITC/CD10-PE/CD19-ECD/CD5-PC5/CD45-PC7；(7)CD7-FITC/CD56/PE/CD2-PC5/CD45PC7；(8)CD8-FITC /CD4-PE/CD3-ECD/CD45-PC7，必要時加做胞內(nèi)MPO/ 79a/CD3；每種抗體按組合加入10 μl至管底后，加入50 μl EDTA抗凝骨髓標本，混勻，避光孵育20 min后加入500 μl溶血素，避光裂解20 min，加入4 ml PBS緩沖液混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清液后再加入500 μl PBS緩沖液，混勻上機檢測，檢測時以CD45/ SSC雙參數(shù)散點圖設門，每管收集20 000個細胞，所收集數(shù)據(jù)采用流式CXP分析軟件對其進行分析。

1.4 免疫分型標準采用歐洲白血病免疫分型研究組(EGIL)[3]提出的抗原積分系統(tǒng)進行白血病免疫分型分析。

1.5 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行相關分析，AML-M4，M5與AML其他亞型比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 急性白血病患者分布情況118例急性白血病患者中AML 88例，B-ALL 19例，T-ALL 9例，混合型白血病2例；按FAB分型其中AML包括M0 2例，M1 6例，M2 24例，M3 12例，M4 8例，M5 36例。

2.2 急性白血病患者免疫分型表達規(guī)律與FAB分型的關系118例急性白血病均表達CD38，AML中CD33的表達率最高(93.2%)，其他依次為CD13(88.6%)、CD117(86.4%)、CD64(56.9%)、CD34(52.2%)、CD15(50%)、HLA-DR(45.5%)等，另可見部分AML患者伴表達淋系相關抗原，主要為CD56(25.2%)、CD7(11.3%)、CD19(2.2%)、CD20(2.2%)。AML亞型中可見M0、M1、M2均高表達CD117(100%)、CD13(100%)，CD33(100%)；CD34在M0、M1、M2中表達率依次為100%、66.7%、100%；M3中高表達CD117(83.7%)、CD13(83.7%)、CD33(83.7%)，但均不表達CD34、HLA-DR；M4中高表達CD33(100%)、CD17(100%)；M5中高表達CD13(100%)、CD33(94.4%)。19例B-ALL患者中CD19的表達率最高(100%)，其次為CD34(90.1%)、HLA-DR (90.1%)、CD10(90.1%)；9例T-ALL患者中CD7的表達率最高(100%)，其次為CD4(77.8%)、CD5(77.8%)、CD2(66.7%)、CD3(66.7%)、CD34(55.6%)，見表1。

表1118 例急性白血病及其各亞型的主要抗原表達情況(%)

2.3 AML-M4、M5表達CD64、CD14、CD4與AML其他亞型比較CD64在AML-M4、M5的表達陽性率分別為75%和72.2%，均顯著高于AML其他亞型的表達陽性率(38.6%，P＜0.01)；CD14在AML-M4、M5的表達陽性率分別為12.5%和22.2%，均顯著高于AML其他亞型的表達陽性率(0%，P＜0.01)；CD64在AML-M4、M5的表達陽性率分別為50%和61.1%，均顯著高于AML其他亞型的表達陽性率(18.2%，P＜0.01)。

3 討論

白血病是一組高度異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，主要累及造血干細胞及造血祖細胞，由于各種原因?qū)е略煅?祖不能正常分化成熟，阻滯于分化發(fā)育的某個階段，在骨髓、外周血中出現(xiàn)大量幼稚或不完全成熟髓系或淋巴系細胞，其分化發(fā)育喪失嚴格的規(guī)律與免疫表型的階段性，?？沙霈F(xiàn)某些抗原的跨系列表達、跨階段表達、表達缺少及表達過度等[4]。目前白血病應用免疫分型已經(jīng)越來越多被臨床上接受，白血病免疫分型主要通過流式細胞術進行檢測，其基本原理是通過激光的照射，對多種不同熒光抗體標記的單克隆抗體標記的細胞進行分析，產(chǎn)生的信號主要有反映細胞相對大小的前向散射光(FSC)，反映細胞內(nèi)部復雜程度的側(cè)向散射光(SSC)以及反映各種細胞功能和抗原表達的熒光信號，將圖形和數(shù)據(jù)直接輸入聯(lián)機專用的計算機，計算機快速精確地將所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計計算，結(jié)合多參數(shù)分析，從而實現(xiàn)了細胞定量分析。本研究采用五色流式細胞術，通過CD45/SSC設門進行多參數(shù)分析，通常白血病細胞群表達于CD45弱陽性和低SSC區(qū)域，然后對其表面及其胞內(nèi)部分抗原的檢測來分析其系列和分化階段，從而對白血病做出正確的診斷和分析，以指導臨床治療及其預后的判斷，可作為FAB形態(tài)學分型不足很好的補充。

本研究中可見在88例AML中髓系相關抗原的表達率依次為CD33(93.2%)＞CD13(88.6%)＞CD117(86.4%)，與熊見等[5]的報道一致。CD33和CD13為骨髓細胞中髓系的重要標志性抗原，在粒細胞和單核細胞均有高表達，正常髓細胞抗原的表達規(guī)律中CD33、CD13從原始粒細胞或原始單核細胞開始就已經(jīng)表達，并隨著分化的成熟表達也增強，CD13在中幼粒細胞階段出現(xiàn)弱表達，隨后增強，因此其在判斷白血病細胞是否來源于髓系中具有重要的作用。CD117在AML也有高表達，CD117為C2Kit原癌基因細胞表面分化抗原，是多能造血干細胞的重要標志，在粒系細胞中主要表達于早幼粒細胞及其階段之前細胞，單核細胞中主要表達于幼稚單核細胞及其階段之前細胞，因此CD117可作為髓系的特異性抗原對待[6]。在12例AML-M3患者中，除2例考慮為變異型M3外，其余10例形態(tài)學上均為典型的M3，其均表達CD117，高表達CD13、CD33，不表達CD34，HLA-DR、SSC較大，與粒系相似，因此如果白血病細胞具有上述免疫表型特征時，應高度懷疑為APL。CD14、CD64是單核/巨噬細胞的分化抗原，在正常中性粒細胞上不表達或弱表達。本研究中CD14在M4/M5患者中的表達率分別為12.5%和22.2%，低于林元峰等[7]報道的45.4%，但在其余AML亞型均未見表達，因此它在AML分型診斷中具有較高的特異性，但其敏感性較低，對M4/M5的診斷作用有限。CD64在AML各亞型中均有不同程度的表達，在M4/M5中較其他亞型表達率較高，分別為75.0%和72.2%，具有較高的敏感性。CD4為T淋巴細胞抗原，在單核/巨噬細胞上也有弱表達，而且有較高的敏感性[8]，因此結(jié)合CD4、CD64、CD14對M4/M5與其他AML亞型的鑒別診斷有重要作用。白血病細胞中的白細胞抗原的異常表達表現(xiàn)在許多方面，部分可作為預后不良和鑒別診斷的指標[9]，在AML中也可見部分跨系的異常表達，其中CD56的表達率為25.2%，在所檢測抗原中異常表達率為最高，伴CD56陽性的AML具有獨特的臨床生物學特征，主要表現(xiàn)為容易髓外浸潤和復發(fā)，生存期短，因此可提示為預后不良。

免疫分型可將ALL分為B-ALL和T-ALL，本研究的B-ALL中，CD19在所病例中均陽性表達，CD34、CD10、HLA-DR也有較高的表達，因此CD19可作為除胞內(nèi)CD79a、CD22等特異性膜內(nèi)抗原最具有診斷價值的指標。T-ALL中CD7在所檢測病例中均陽性表達，CD4、CD5、CD2、CD3也有較高的表達率，因此CD7、CD4、CD5、CD2、CD3對T-ALL具有較高的診斷價值。無論是T-ALL還是B-ALL均可見小部分表達髓系相關抗原，如CD33、CD11b、CD13，而AML也可見部分表達淋系相關抗原，如CD19、CD20、CD7，因此對此類免疫表型需加做胞內(nèi)MPO/79a/CD3檢測，按照EGIL提出的抗原積分系統(tǒng)進行分析，如果每個系列積分＞2，則應診斷為急性雙表型或混合型白血?。蝗羝渲幸幌荡笥?分，而另一系小于2分則提示為AML伴淋系相關抗原表達或T-ALL/B-ALL伴髓系相關抗原表達。在本研究的2例混合型白血病中，1例形態(tài)學可見兩群異常細胞，一群形似幼稚單核細胞，另一群形似原幼淋巴細胞，經(jīng)流式提示為混合型AML/T-ALL免疫表型；另1例形態(tài)學診斷為ALL，經(jīng)流式提示為雙表型急性髓系/T系白血病免疫表型。在部分形態(tài)學分型可見白血病細胞POX染色有較低的陽性率或陰性,形態(tài)學似ALL，經(jīng)流式提示為AML。

綜上所述，在急性白血病的MICM分型中形態(tài)學分型診斷是基礎，通過五色流式細胞術進行白血病免疫分型形態(tài)學分型診斷重要的補充，對提高急性白血病的診斷正確率，白血病的預后判斷和治療方案的選擇有重要的意義。

[1]許文榮,王建中.臨床血液學和檢驗[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:240-245.

[2]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].4版.北京:科學出版社,2007:103-107.

[3]劉艷榮.實用流式細胞術——血液病篇[M].北京:北京大學醫(yī)學出版社,2010:116.

[4]Dunphy CH,Orton SO,Mantell J,et al.Realative contributions of enzyme cytochemistry and flow cytochemistry and flow cytometric immunophenotyping to the evaluation of acute myeloid leukemias with amoncytic component and of flow cytometric immunphenotyping to the evaluation of absolute monocytoses[J].Am J Clin Pathol, 2004,122(6):865-874.

[5]熊見,解小紅,黃敏,等.多參數(shù)流式細胞術在白血病免疫分型中的應用探討[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2012,33(12):1427-1429.

[6]劉艷榮,于弘,常艷,等.四色熒光標記抗體在白血病分型的應用及意[J].中國實驗血液學雜志,2002,10(5):423-425.

[7]林元峰,鄭源海,周艷貞,等.免疫分型在單核細胞相關性急性髓細胞白血病(M4/M5)鑒別診斷中的應用[J].檢驗醫(yī)學與臨床, 2013,10(19):2520-2523.

[8]Darrell C,Foon KA.Recent advances in flow cytometry.application to the diagnosis of hematologia malignancy[J].Blood,1997,90 (8):2863-2892.

[9]江雁,穆紅,唐志琴,等.急性白血病系列特異性抗原表達分析[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2009,6(6):532-534.

Relationship between the immunophenotype by five-color flow cytometry and FAB phenotype in 118 cases of acute leukemia.
C

HEN Jian-an,ZHOU Jing,ZHU Xue-hai,DING Qian,HE Yong-ming,LI Xiao-ting,LIANG Yan. Department of Clinical Laboratory,Tung Wah Hospital,Sun Yat-sen University,Dongguan 523110,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the relationship between the immunophenotype by five-color flow cytometry and FAB phenotype in Acute leukemia.MethodsImmunophenotyping of 118 cases of bone marrow specimens from patients with acute leukemia were analyzed by five-color FCM with CD45/SSC double parameters and scatter spot picture.ResultsIn 88 cases of acute myeloid leukemia(AML),the myeloid-associated antigens were CD33(93.2%),CD13(88.6%),and CD117(11.3%),respectively,and the lymphoid-associated antigens were CD56(25.2%),CD7(11.3%),CD19(2.2%)and CD20(2.2%),respectively.The antigens mainly expressed in M3 were CD117(83.7%),CD13(83.7%),CD33(83.7%),and bigger SSC,but not CD34and HLA-DR.The antigens mainly expressed in M4 and M5 were CD64,CD4and CD14(P＜0.01).In 19 cases of patients with B-ALL,the expression rate of CD19was the highest (100%),followed by CD34(90.1%),HLA-DR(90.1%)and CD10(90.1%).In 9 cases of patients with T-ALL,the expression rate of CD7was the highest(100%),followed by CD4(77.8%),CD5(77.8%),CD2(66.7%),CD3(66.7%)and CD34(55.6%).ConclusionBased on a more objective diagnostic basis,five-color flow cytometry is extremely important in improving the diagnostic accuracy,therapy and prognosis in acute leukemia.

Acute leukemia;Immunophenotype;Flow cytometry;CD56

R733.71

A

1003—6350（2015）01—0056—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0018

2014-07-23)

東莞市科技局醫(yī)療衛(wèi)生科研項目（編號：20131051010238）

陳建安。E-mail：89630799@qq.com