黃維，陳潔儀，黃俊勇，周成宇

（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤科，廣東佛山528000）

TRPM8調(diào)控EMT促進人腎癌細胞A498遷移及侵襲的作用研究

黃維，陳潔儀，黃俊勇，周成宇

（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤科，廣東佛山528000）

目的探討瞬時受體電位M8(TRPM8)是否通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)影響人腎癌細胞的侵襲及遷移能力。方法利用熒光定量PCR來檢測人腎癌細胞A498、786-0以及GRC-1中TRPM8的表達水平；設(shè)計并合成靶向TRPM8的特異性shRNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染TRPM8表達最高的腎癌細胞A498以構(gòu)建穩(wěn)定低表達TRPM8細胞株，通過Western blot和定量PCR來驗證shRNA的干擾效率；通過Transwell法檢測干擾后細胞的遷移及侵襲能力，Western blot法檢測EMT相關(guān)指標E-cadherin和N-cadherin以及其上游信號分子Snail和WNT-5a的變化。結(jié)果TRPM8-shRNA轉(zhuǎn)染后，能夠有效抑制A498細胞中TRPM8的表達；Transwell法檢測細胞侵襲能力結(jié)果顯示，A498組、Control組和shRNA組的穿膜細胞數(shù)分別為(102.56±11.41)、(105.67±10.83)、(74.62±8.65)，A498/shRNA組細胞侵襲能力受到顯著抑制(F=49.105，P＜0.01)；Transwell法檢測細胞遷移能力結(jié)果顯示，A498組、Control組和shRNA組的穿膜細胞數(shù)分別為(115.45±10.31)、(109.33±7.53)、(76.21±13.28)，A498/ shRNA組細胞遷移能力受到顯著抑制（F=36.168，P＜0.01）；Western blot法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRPM8干擾組細胞的E-cadherin表達增加，N-cadherin的表達降低；此外，TRPM8干擾組細胞的Snail以及WNT-5a表達較對照組顯著下降。結(jié)論運用RNA干擾技術(shù)能夠有效沉默A498細胞的TRPM8基因，并誘導其遷移侵襲能力的下降，其可能的機制是通過調(diào)節(jié)EMT的上游信號分子Snail、WNT-5a的表達來調(diào)控EMT，從而影響腎癌細胞的遷移及侵襲。以上提示TRPM8在腎癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抑制TRPM8的表達可能成為一種治療腎癌的新方法。

TRPM8；腎癌；侵襲；遷移

腎癌(Renal carcinoma)是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，其中大部分是腎細胞癌(Renal cell carcinoma)，目前腎癌有逐年增加的趨勢，且早期診斷較為困難，相當一部分患者在就診時已處于中晚期，臨床上主要以手術(shù)治療為主，但往往療效不佳[1-2]。因此，迫切需要尋找新的方法提高腎癌患者的生存期。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，分子靶向治療已成為當今腎癌防治研究的熱點，目前應(yīng)用于臨床的有索拉非尼及舒尼替尼[3]。瞬時受體電位8(TRPM8)是瞬時受體電位(Transient receptor potential，TRP)家族中的一員，可通過介導鈣離子內(nèi)流參與多種生理及病理過程。已有研究表明其與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。此外，上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮了重要作用[5]。本研究擬利用特異性shRNA轉(zhuǎn)染腎癌離體細胞株A498以構(gòu)建TRPM8低表達的穩(wěn)定細胞株，觀察TRPM8基因下調(diào)后對A498遷移及侵襲的影響以及EMT相關(guān)指標的表達變化，初步探討TRPM8基因在腎癌細胞中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)人腎癌細胞A498、786-0以及GRC-1購自于中科院上海細胞庫。四株細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640中，并置于5%二氧化碳以及37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 TRPM8特異性shRNA和轉(zhuǎn)染TRPM8 shRNA購自美國Santa Cruz公司(Cat.sc-95009-SH)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，具體操作流程參照英韋創(chuàng)津公司的Lipofectamine2000產(chǎn)品說明書。48 h后加入篩選抗生素G418，濃度為400 μg/ml，維持培養(yǎng)6 d后G418濃度改為200 μg/ml；細胞擴增后提取蛋白和RNA，進行RT-PCR和Western blot鑒定。

1.3 熒光定量PCR采用TGuide RNA提取試劑盒(Tiangen公司)提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)則采用TAKARA的PrimeScript?II Reverse Transcriptase試劑盒。引物序列如下:TRPM8正義鏈：5'-TATCTTACTGAACACCTGTAGTCCCAG-3'，TRPM8反義鏈：5'-TGAGTTTATAGTGTATTCAAAGCTGAGAA-3' (256bp)；GAPDH正義鏈：5'-AGGTGAAGGTCGGAGT CAAC-3'，GAPDH反義鏈：5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'(232bp)。實驗重復(fù)3次。

1.4 Western blot將約1×107個細胞加至蛋白裂解液，冰上靜置30 min，低溫離心20 min(轉(zhuǎn)速12 000 r/min)，提取上清。應(yīng)用BCA定量法計算蛋白的濃度。取60 μg總蛋白跑膠(恒壓100 V)。電轉(zhuǎn)膜30 min。含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h。一抗4℃冰箱過夜，二抗孵育1 h后顯影。TRPM8、E-cadherin、N-cadherin、WNT-5a、Snail以及GAPDH抗體均購自美國Santa cruz公司。

1.5 Transwell法檢測細胞的遷移能力首先將Transwell小室放進24孔板里，然后將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TRPM8或陰性對照序列的細胞用胰蛋白酶消化，用不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細胞3次，隨之將細胞重懸，每孔加入100 μl細胞懸液，在小室的下層加入500 μl 1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中放置24 h。最后取出小室，棄掉培養(yǎng)基，使用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)的殘余細胞。甲醛固定并結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察，隨機選取8個視野進行細胞計數(shù)。

1.6 Transwell法檢測細胞的侵襲能力方法同上，但與遷移實驗有所區(qū)別的是，在上室的聚碳酸酯膜之上還要鋪上一層基質(zhì)膠，用以模擬體內(nèi)ECM，細胞進入下室之前，必須先將基質(zhì)膠降解。隨機選取8個視野進行細胞計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。Transwell侵襲實驗采用析因設(shè)計方差分析比較各組間差異；熒光定量PCR實驗采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組間差異。以P＜0.05界定為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腎癌細胞中TRPM8的表達四株腎癌細胞中，A498的TRPM8表達水平最高(以此為參照)，而786-0以及GRC-1細胞的相對表達水平分別為(0.35±0.06)和(0.64±0.05)。故選擇A498作為研究對象以作下一步實驗，見圖1。

圖1 TRPM8 mRNA在3株腎癌細胞中的表達水平

2.2 shRNA抑制A498細胞中TRPM8的表達A498細胞經(jīng)特異性shRNA轉(zhuǎn)染篩選后，Western blot和熒光定量PCR結(jié)果顯示TRPM8的蛋白水平及核酸水平表達均較對照組顯著下調(diào)(F=103.65，P＜0.01)，提示TRPM8表達下調(diào)的A498細胞株構(gòu)建成功，命名為A498/shRNA，并用于下一步實驗，見圖2。

圖2 shRNA顯著抑制A498細胞的TRPM8表達

2.3 TRPM8基因沉默后A498細胞的遷移能力變化研究結(jié)果提示：A498組、對照組(A498/Con)組和A498/shRNA組的穿膜細胞數(shù)分別為(115.45± 10.31)、(109.33±7.53)、(76.21±13.28)。與對照組比較，A498/shRNA組細胞遷移能力受到顯著抑制(F= 36.168，P＜0.01)，見圖3。

圖3 TRPM8對細胞體外遷移能力的影響：上圖為顯微鏡下各組細的觀察；下圖為各組中侵襲細胞的數(shù)目比較

2.4 TRPM8下調(diào)后A498細胞的侵襲能力變化研究結(jié)果提示(圖4)，A498組、對照組(A498/ Con)組和A498/shRNA組的穿膜細胞數(shù)分別為(102.56±11.41)、(105.67±10.83)、(74.62±8.65)。與對照組比較，A498/shRNA組細胞侵襲能力受到顯著抑制(F=49.105，P＜0.01)。

圖4 TRPM8對細胞體外侵襲能力的影響：上圖為顯微鏡下各組細胞的觀察；下圖為各組中侵襲細胞的數(shù)目比較

2.5 TRPM8基因沉默后A498細胞的E-cadherin、N-cadherin、Snail以及WNT-5a表達情況通過Westen blot檢測發(fā)現(xiàn)(圖5)，A498/shRNA組的E-cadherin表達顯著增加，而N-cadherin的表達顯著降低；此外，TRPM8干擾組細胞的Snail、WNT-5a表達較對照組顯著下降。結(jié)果提示TRPM8可能通過調(diào)節(jié)Snail和WNT-5a兩種上游信號因子來調(diào)控EMT的發(fā)生。

圖5 TRPM8基因敲除對A498細胞中E-cadherin、N-cadherin、Snail以及WNT-5a表達的影響

3 討論

腎癌與前列腺癌和膀胱癌并稱泌尿系統(tǒng)三大惡性腫瘤，占所有男性惡性腫瘤的3%。據(jù)流行病學報告，在美國每年將會新發(fā)31 500例腎癌病例[2]。我國目前雖無準確的發(fā)病統(tǒng)計，但據(jù)20世紀90年代我國居民死因構(gòu)成統(tǒng)計，腎腫瘤的死亡率約為0.32/10萬人[6]。有研究表明細胞內(nèi)鈣離子水平與腫瘤細胞惡性程度密切相關(guān)，TRP可通過介導鈣離子內(nèi)流來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學行為，TRPM8作為TRP家族中的一員，已被證實在前列腺癌、舌癌及肝癌等多種腫瘤中高表達，并與預(yù)后密切相關(guān)目前研究已證實[7-11]。本研究結(jié)果表明，在腎癌中TRPM8是高表達的；成功構(gòu)建TRPM8低表達的細胞株后，發(fā)現(xiàn)該組細胞的遷移及侵襲能力較對照組顯著下降。因此，我們推測TRPM8基因是腎癌的促轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。

EMT作為上皮源性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要步驟，與腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其主要特征為上皮標志物E-cadherin表達的減少，間質(zhì)標志物N-cadherin表達的增加[12-13]。Snail是E-cadherin的主要調(diào)節(jié)因子，可通過與Smad相互作用蛋白(SIP1)競爭性結(jié)合E-cadherin蛋白啟動子區(qū)的E-box連接基序，抑制E-cadherin的表達，從而誘導EMT發(fā)生[14]。已有研究表明，Snail的表達在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平受到PI3K/ AKT通路的直接調(diào)控，而TRPM8能直接活化PI3K/ AKT通路[15-16]。因此，我們推測TRPM8是否通過調(diào)節(jié)Snail來調(diào)控E-cadherin的表達水平，從而推動EMT的發(fā)生。

我們進一步研究結(jié)果顯示，腎癌細胞在TRPM8下調(diào)后，Snail分子的表達水平較對照組顯著降低，而E-cadherin表達顯著增加，N-cadherin表達則顯著下降，提示了TRPM8與腎癌細胞EMT密切相關(guān)，其部分機制可能為TRPM8通過對Snail因子的調(diào)控，從而影響E-cadherin的表達水平。然而，值得注意的是，EMT的調(diào)節(jié)涉及多條信號通路，且這些信號通路之間可能還存在著相互作用(Cross-over)。WNT通路是目前研究得比較深入的與EMT密切相關(guān)的信號通路[17]。為了進一步明確TRPM8對EMT的調(diào)節(jié)作用，我們還檢測了WNT通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子WNT-5a的表達，發(fā)現(xiàn)TRPM8下調(diào)后，WNT-5a蛋白表達亦受到明顯抑制，這提示了TRPM8對EMT的調(diào)控可能也與WNT通路相關(guān)。

綜上所述，本研究探討了TRPM8與EMT及腎癌細胞遷移侵襲之間的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TRPM8可通過調(diào)控EMT的發(fā)生影響腎癌細胞的遷移及侵襲，其可能機制為調(diào)節(jié)EMT上游通路分子Snail及WNT-5a。這為進一步揭示TRPM8基因與腎癌的關(guān)系提供新的實驗依據(jù)，為探討腎癌轉(zhuǎn)移的分子機制提供新的思路。

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Down-regulation of TRPM8 suppresses invasion and migration of human renal carcinoma cell A498 via inhibiting EMT.

HUANG Wei,CHEN Jie-yi,HUANG Jun-yong,ZHOU Cheng-yu.Department of Oncology,the First People’s Hospital of Shunde District of Foshan,Foshan 528000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of down-regulation of TRPM8 on the invasion and migration of renal carcinoma cells A498.MethodsThe expression of TRPM8 in human renal carcinoma cell A498,786-0 and GRC-1 were detected by fluorescence quantitative PCR.shRNA targeting TRPM8 was designed and synthesized,and then transfected into the A498 cells via Lipofectamine 2000 mediation.The interference efficiency of shRNA was evaluated by Western blot and quantitative PCR.The migration ability and invasion ability of A498 were detected by using transwell assay.Expression of E-cadherin,N-cadherin,WNT-5a and Snail were detected by using Western blot.ResultsTRPM8-targeted shRNA could down-regulate the TRPM8 expression of A498.Transwell Cell number of invasion was(102.56±11.41),(105.67±10.83),(74.62±8.65)in A498 group,control group and shRNA group,respectively,which indicated that cell invasion ability were significantly inhibited in shRNA group(F=49.105, P＜0.01).Transwell Cell number of migration was(115.45±10.31),(109.33±7.53),(76.21±13.28)in A498 group,control group and shRNA group,respectively,which indicated that cell migration ability were significantly inhibited in shRNA group(F=36.168,P＜0.01).In addition,the expression of E-cadherin was increased,while that of N-cadherin, WNT-5a and Snail was decreased in shRNA interference group.ConclusionDown-regulation of TRPM8 can induce inhibition of invasion and migration in human renal carcinoma cells A498 via regulating epithelial mesenchymal transitions(EMT),specifically,the upstream signal molecule Snail,WNT-5a of EMT.It could be regarded as a novel target for clinical diagnosis and gene therapy for renal carcinoma.

TRPM8;Renal carcinoma;Invasion;Migration

R737.11

A

1003—6350（2015）01—0018—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0006

2014-06-29)

黃維。E-mail：12258276@qq.com