胡秀敏，江遠(yuǎn)仕，張盛漲

(1.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524023；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田區(qū)人民醫(yī)院汕頭大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，廣東深圳518000；3.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，廣東深圳518000)

三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)谷氨酸表達(dá)分布的研究

胡秀敏1，江遠(yuǎn)仕2，張盛漲3

(1.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東湛江524023；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田區(qū)人民醫(yī)院汕頭大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，廣東深圳518000；3.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科，廣東深圳518000)

目的研究三叉神經(jīng)痛(TN)大鼠時(shí)其三叉神經(jīng)節(jié)(TG)內(nèi)谷氨酸(Glu)表達(dá)與分布的關(guān)系。方法皮下注射硝酸甘油構(gòu)建三叉神經(jīng)痛大鼠模型；應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)Glu含量與分布。結(jié)果皮下注射硝酸甘油構(gòu)建三叉神經(jīng)痛大鼠的三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)Glu含量增多且其主要分布在三叉神經(jīng)節(jié)表層。結(jié)論Glu可能與三叉神經(jīng)痛發(fā)生有密切關(guān)系。

硝酸甘油；谷氨酸；三叉神經(jīng)痛；三叉神經(jīng)節(jié)

三叉神經(jīng)痛(TN)是一種原發(fā)性神經(jīng)痛，累及面部三叉神經(jīng)一支或兩支分布區(qū)，表現(xiàn)為反復(fù)性、慢性頭痛。發(fā)作時(shí)表現(xiàn)為以面頰上下頜及舌部明顯的劇烈電擊樣、針刺樣、刀割樣或撕裂樣疼痛，突發(fā)突止，間歇期完全正常，可伴有惡心、嘔吐、畏聲、畏光等癥狀。目前三叉神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制還不是很清楚。谷氨酸(Glu)是公認(rèn)的神經(jīng)系統(tǒng)興奮性遞質(zhì)，它能通過(guò)谷氨酸受體參與三叉神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的痛覺(jué)信息的傳遞[1]，Glu也是神經(jīng)系統(tǒng)分布很廣泛的一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛參與各種神經(jīng)的調(diào)節(jié)，可能與三叉神經(jīng)痛的發(fā)作有密切聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：健康SD大鼠16只，體重220～260 g；由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供動(dòng)物編號(hào)：SCXK(粵)2013-0008。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：按體重均衡原則將大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(生理鹽水，n=8只)、模型組(硝酸甘油組，n=8只)，分別皮下注射硝酸甘油與生理鹽水后，1 h灌注取材。②主要試劑與儀器：硝酸甘油(廣州明興制藥有限公司，批號(hào)MC 2407)，兔抗鼠谷氨酸多克隆抗體(Millipore Corporation，一抗)，批號(hào)：2204896，PV-6001二步法免疫組化檢測(cè)試劑(北京中杉金橋生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠三叉神經(jīng)痛模型的建立參照Tassorelli等[2]皮下注射硝酸甘油，SD大鼠按10 mg/kg頸部皮下注射硝酸甘油。一般注射后5～10 min大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、爬籠次數(shù)增多、后肢頻繁撓頭、煩躁不安等現(xiàn)象，約40 min后達(dá)到高峰。此現(xiàn)象可持續(xù)3～5 h，之后大鼠呈現(xiàn)蜷臥、活動(dòng)減少狀態(tài)，此為造模成功。對(duì)照組大鼠皮下注射等體積生理鹽水，大鼠僅在20 min內(nèi)略有撓頭現(xiàn)象，之后趨于正常，也未出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、爬籠次數(shù)增多和其他煩躁不安現(xiàn)象。

1.2.2 免疫組化標(biāo)本留取對(duì)照組在皮下注射生理鹽水、模型組注射硝酸甘油1 h后，然后用10%的水合氯醛以400 mg/kg給大鼠腹腔麻醉，打開(kāi)胸腔，在心尖處剪一個(gè)小口，灌注針經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈，同時(shí)把右心耳剪開(kāi)以便于血液以及灌注液流出，另一端接50 ml注射器，開(kāi)始先用生理鹽水快速灌注大約500 ml生理鹽水至肝臟變白，右心流出生理鹽水，再注射約200 ml 4%的多聚甲醛(溶于0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH 7.4)溶液，灌注先快后慢大約20 min灌完，在灌注之前可以先注射適量肝素使血液肝素化。灌注過(guò)程中用止血鉗止住腹主動(dòng)脈，固定后斷頭取三叉神經(jīng)節(jié)，置于4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS液中固定4 h。全自動(dòng)脫水機(jī)脫水后石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片，切片厚度為3μm，貼于APES硅膠防脫載玻片上，63℃12 h烤干備用。切片常規(guī)脫蠟至水，4罐二甲苯依次脫蠟8 min后無(wú)水乙醇(100%、95%、85%、75%)脫水依次3 min，熱修復(fù)抗原：將切片放入盛有0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)對(duì)抗原中進(jìn)行修復(fù)，自然冷卻后PBS洗3遍，3%H2O2室溫孵以滅活內(nèi)源性酶活性進(jìn)行封閉，然后暗室室溫10 min，PBS洗3遍，滴加一抗(Anti谷氨酸抗體，兔抗大鼠1:2 000，購(gòu)于Millipore Corporation)，4℃冰箱過(guò)夜，復(fù)溫30 min，PBS漂洗3次，每次2 min；滴加二抗(PV-6001北京中杉金橋生物有限公司)，室溫90 min，PBS漂洗3次，每次2 min；二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色，蒸餾水沖洗5 min，蘇木精復(fù)染1 min，梯度酒精脫水，蒸餾水沖洗5 min，二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照用0.01 mol/L的PBS代替一抗顯色，其他步驟不變，結(jié)果均為陰性。為了保證可比性，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組切片在同一反應(yīng)條件、同一染缸中進(jìn)行，其他反應(yīng)條件保持不變。

1.3 圖像分析TG染色后，顯微鏡下拍照，用Image tool圖像分析系統(tǒng)觀察分析光密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)采用方差分析。以P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

皮下注射硝酸甘油組大鼠谷氨酸陽(yáng)性免疫反應(yīng)細(xì)胞主要分布在三又神經(jīng)節(jié)表層細(xì)胞，TG的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)呈棕褐色染色，位于胞漿、胞核處，胞核素木蘇復(fù)染呈現(xiàn)藍(lán)色。注射生理鹽水組大鼠TG谷氨酸感覺(jué)神經(jīng)元大部分呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。于每只大鼠TG切片中隔5張取1張切片，用圖像分析系統(tǒng)軟件分析Glu陽(yáng)性神經(jīng)元的光密度變化。硝酸甘油組和生理鹽水組陽(yáng)性神經(jīng)元的平均光密度分別為(0.354 5±0.257 1)和(0.166 2±0.064 3)。硝酸甘油組TG中Glu的表達(dá)較生理鹽水組明顯增加(F=403.387，P＜0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 谷氨酸在各組SD大鼠三叉神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)

3 討論

三叉神經(jīng)痛是臨床上一種比較常見(jiàn)的疾病，具有廣泛的發(fā)病年齡，從10歲到90歲均可發(fā)病，其中以40歲以上的中年人居多，近年來(lái)兒童的發(fā)病率逐漸增加，女性多見(jiàn)。三叉神經(jīng)痛以兩側(cè)或一側(cè)面部三叉神經(jīng)分布區(qū)內(nèi)反復(fù)發(fā)作的陣發(fā)性劇烈痛為主要表現(xiàn)，發(fā)作時(shí)表現(xiàn)為以面頰上下頜及舌部明顯的劇烈電擊樣、針刺樣、刀割樣或撕裂樣疼痛，突發(fā)突止，間歇期完全正常，可伴有惡心、嘔吐、畏聲、畏光等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量，被認(rèn)為是人類最痛苦的疾病之一。三叉神經(jīng)分為繼發(fā)性和原發(fā)性三叉神經(jīng)痛，以后者多見(jiàn)，且發(fā)病機(jī)制與病因不明，可能涉及外周、中樞及免疫因素等。繼發(fā)性三叉神經(jīng)痛是由于腫瘤、外傷、炎癥等原因引起的痛，目前臨床上雖然有多種治療方法，但效果均不理想。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)硝酸甘油組與生理鹽水組作比照，硝酸甘油組Glu表達(dá)明顯高于生理鹽水組，通過(guò)Glu表達(dá)與分布揭示TN與Glu的密切關(guān)系。對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)Glu與疼痛的研究，至今仍是社會(huì)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，21世紀(jì)的大量研究表明，Glu在各種類型疼痛中均具有一定的重要作用，Glu作為神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)普遍存在的一種興奮型神經(jīng)遞質(zhì)，在口面部信息感覺(jué)的傳遞中同樣發(fā)揮重要作用。研究人員研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸是負(fù)責(zé)TN信息傳遞和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵遞質(zhì)而且口面部痛覺(jué)的異常敏化就伴隨三叉神經(jīng)傳導(dǎo)路上谷氨酸釋放的異常增多[3-5]。有實(shí)驗(yàn)表明，在大鼠組織發(fā)生炎癥或神經(jīng)損傷所致的病理性疼痛時(shí)，外周或脊髓內(nèi)谷氨酸水平升高[6]。

目前，臨床上治療TN方法也眾多，藥物品種更是繁多，藥物治療如普坦類佐米曲普坦可以抑制三叉神經(jīng)神經(jīng)元的興奮性，曾被喻為治療三叉神經(jīng)痛的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7]。手術(shù)治療如微血管減壓術(shù)、神經(jīng)周圍支撕脫術(shù)、顱底神經(jīng)高位切除切斷術(shù)、經(jīng)皮穿刺射頻溫控?zé)崮委煹萚8]，但效果均不理想，且容易復(fù)發(fā)。TN的理想術(shù)式是能做到選擇性毀損痛覺(jué)纖維，保留其他的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)纖維，減少并發(fā)癥，降低復(fù)發(fā)率。實(shí)施高度選擇性切斷三叉神經(jīng)感覺(jué)跟(TNSR)上的痛覺(jué)纖維，保留其他感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)纖維治療TN是基礎(chǔ)和臨床的重要課題，江遠(yuǎn)仕等[9-10]開(kāi)展TNSR的表層神經(jīng)纖維束切斷術(shù)(STS)。術(shù)后患者痛覺(jué)消失，運(yùn)動(dòng)、溫度、觸壓覺(jué)功能保留尚完好，從臨床上證明了三叉神經(jīng)痛的痛覺(jué)纖維可能位于三叉神經(jīng)節(jié)的表層。

由本實(shí)驗(yàn)推測(cè)，在三叉神經(jīng)節(jié)表面初級(jí)傳入纖維中，谷氨酸可能作為一種神經(jīng)遞質(zhì)作用于突觸后膜上的谷氨酸受體而直接參與傷害性信息的傳遞，導(dǎo)致中樞敏化，從而導(dǎo)致大鼠三叉神經(jīng)支配區(qū)面部和口腔疼痛。

綜上所述，Glu可能存在于三叉神經(jīng)節(jié)的表層并且參與TN的病理生理過(guò)程，其與三叉神經(jīng)痛發(fā)生有密切關(guān)系。

[1]Ivanov A,Pellerino C,Rama S,et al.Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA recetors in regulation of the extracellular signal-rugulated kinases(EPK)activity in cultured rath ippocampal neu rons[J].Physion,2006,572(3):789-798.

[2]Tassorelli C,Joseph SA.Systemic nitroglycerin induce f os immunoreactivity in brainstem and foreb rain structures of the rat[J].Brain Res,1995,682(3):167-181.

[3]Sessle BJ.Peripheral and central mechanisms of orofacial inflammatory pain[J].International Review of Neurobiology,2011,97(5): 179-206.

[4]Barroso-Chinea P,Castle M,Aymerich MS,et al.Expression of the mRNAs encoding for the vesicular glutamate transporters 1 and 2 in the rat thalamus[J].The Journal of Comparative Neurology,2007, 501(3):703-715.

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[10]江遠(yuǎn)仕,王少洪,張長(zhǎng)椿,等.三叉神經(jīng)根表層纖維束切斷術(shù)治療三叉神經(jīng)痛的可行性研究[J].中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志,2002,20(3): 163-165.

Distribution of glutamic acid expression within the trigeminal ganglia in rats with trigeminal neuralgia.

HU Xiu-min1,JIANG Yuan-shi2,ZHANG Sheng-zhang3.1.Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,Guangdong, CHINA;2.Department of Otolarynogology-Head and Neck Surgery,People's Hospital of Futian District of Shenzhen Affiliated to Guangdong Medical School,the Second Affiliated Hospital of Shantou University,Shenzhen 518000, Guangdong,CHINA;3.Department of Otolarynogology-Head and Neck Surgery,People's Hospital of Futian District of Shenzhen Affiliated to Guangdong Medical School,Shenzhen 518000,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo study the distribution of glutamate(Glu)expression within the trigeminal ganglia (TG)in rats with trigeminal neuralgia(TN).MethodsRats models with TG were constructed by subcutaneous injection of nitroglycerin trigeminal neuralgia.Immunohistochemical technique was applied to detect the contents and distribution of Glu.ResultsThe level of glutamic acid was found increased in trigeminal ganglion in the rat models, and it was mainly distributed in the surface layer of trigeminal ganglion.ConclusionGlu may have close relationship with TN.

Glyceryl trinitrate;Glutamate;Trigeminal neuralgia;Trigeminal ganglion

R-332

A

1003—6350（2015）01—0015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0005

2014-07-29)

廣東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：040112155）；深圳市重點(diǎn)科研基金（編號(hào)：20110421225）

江遠(yuǎn)仕。E-mail：jysh@163.com