肖利佳，龍壽斌，羅歷，沈化清，郝建華

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院檢驗科，廣東深圳518052)

CRISPR/Cas9技術(shù)在HepG2基因組中進(jìn)行定點基因突變的探索

肖利佳，龍壽斌，羅歷，沈化清，郝建華

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院檢驗科，廣東深圳518052)

目的探索利用CRISPR/Cas9技術(shù)在細(xì)胞株HepG2基因組中進(jìn)行定點突變。方法設(shè)計并構(gòu)建靶向核受體LRH-1和ERRα基因組序列的gRNA質(zhì)粒。將構(gòu)建好的gRNA質(zhì)粒和hCas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，PCR擴(kuò)增HepG2基因組中LRH-1和ERRα基因的突變位點，并用SURVEYOR法檢測突變情況。結(jié)果靶向核受體LRH-1和ERRα基因組序列的gRNA質(zhì)粒構(gòu)建成功。HepG2細(xì)胞經(jīng)gRNA-LRH-1/gRNA-ERRα和hCas9轉(zhuǎn)染后，針對LRH-1和ERRα的突變位點基因組序列的PCR產(chǎn)物經(jīng)SURVEYOR法檢測結(jié)果顯示出現(xiàn)兩條與預(yù)計大小相符的電泳條帶。結(jié)論在HepG2細(xì)胞中成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的基因組編輯對LRH-1和ERRα特定基因組序列產(chǎn)生突變，為構(gòu)建其細(xì)胞株敲除模型奠定了基礎(chǔ)。

CRISPR；HepG2；基因組編輯；定點突變

由依賴于規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和Cas蛋白(CRISPR associated proteins)構(gòu)成的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一類廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌體內(nèi)的免疫防御機(jī)制，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA[1-3]。此系統(tǒng)中，crRNA(CRISPR-derived RNA)與tracrRNA(Trans-activating RNA)結(jié)合形成tracrRNA/ crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物能引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas9在與crRNA堿基配對的靶序列剪切雙鏈DNA。隨后研究證實通過異位表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的關(guān)鍵因子，同樣可以在哺乳動物基因組誘發(fā)雙鏈DNA斷裂[4]。哺乳動物基因組中的雙鏈DNA斷裂主要是通過隨機(jī)插入或刪除的非同源重組的末端修飾(Non-homologous end joining，NHEJ)進(jìn)行修復(fù)，因此可以通過此種方法在哺乳動物基因組中誘發(fā)定點突變。以往研究證實將crRNA和tracrRNA融合在同一個質(zhì)粒上表達(dá)，同樣可以引導(dǎo)Cas9特異性地切斷靶DNA序列[5-6]。因其快速、簡便，該系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于定點基因編輯和基因敲除模型的建立[7]。目前，對于利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在穩(wěn)定癌細(xì)胞系中構(gòu)建基因敲除模型的報道較少，因此我們擬利用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在肝癌細(xì)胞系HepG2基因組中進(jìn)行定點突變，為探索在體外穩(wěn)定肝癌細(xì)胞株HepG2中建立特定基因敲除模型提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的gRNA和hCas9質(zhì)粒購自addgene Church實驗室。人肝癌細(xì)胞株HepG2購自ATCC，為本實驗室保存，培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中。AflII限制性核酸內(nèi)切酶、T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ(T7 EndonucleaseⅠ，T7EⅠ)和Gibson Assembly?Cloning Kit購于NEB公司(New England Biolabs)，質(zhì)粒提取試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Qiagen公司，高保真DNA聚合酶KAPA HiFi HotStart Polymerase購自Kapa Biosystem公司。寡聚核苷酸序列由Tech Dragon公司合成，PCR引物由Invitrogen公司合成，DNA測序由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 寡聚核苷酸的設(shè)計及合成由于gRNA載體中crRNA和tracrRNA融合體的轉(zhuǎn)錄是由U6啟動子控制，并且CRISPR/Cas9系統(tǒng)中crRNA對20個堿基靶序列DNA識別時要求靶序列后緊跟一個-NGG(N代表ATGC中任意一個堿基)的PAM(Protospacer-adjacent motif)序列。因此針對核受體LRH-1和ERRα的基因組序列，我們分別設(shè)計GTAAGGGCCGACCGAATGCG(TGG)和GCAGAAGTACAAGCGGCGGC(CGG)作為其靶序列，相應(yīng)的寡聚核苷酸序列由Tech Dragon公司負(fù)責(zé)合成。

1.2.2 gRNA-LRH-1和gRNA-ERRα質(zhì)粒的構(gòu)建將合成的0.1 nmol寡聚核苷酸序列正鏈和負(fù)鏈分別加入KAPA HiFi HotStart Polymerase反應(yīng)體系中，按照95℃2 min，98℃20 s、65℃15 s、72℃15 s共 30個循環(huán)，最后72℃5 min充分延伸。取5μl退火延伸產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，隨后對雙鏈DNA延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化。gRNA空載體經(jīng)AflII限制性核酸內(nèi)切酶消化后，將酶切產(chǎn)物和寡聚核苷酸退火延伸產(chǎn)物經(jīng)純化定量。于10μl的Gibson Assembly mix中加入100 ng經(jīng)酶切純化后的雙鏈DNA產(chǎn)物和300 ng的gRNA空載體，用蒸餾水補(bǔ)齊20μl，于50℃孵育60 min將雙鏈DNA產(chǎn)物連接到gRNA空載體上。隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪板培養(yǎng)后選取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后交由華大基因公司測序驗證。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天將培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中的HepG2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后重懸，并重新種入6空板內(nèi)，第2天待HepG2細(xì)胞生長處于對數(shù)生長期時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。采用Lipo 2000脂質(zhì)體介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染法：首先形成Lipo/ gRNA-LRH-1/gRNA-ERRα和hCas9復(fù)合物，室溫孵育30 min后將此復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 h后更換成含10%血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 基因組DNA的提取及突變的SURVEYOR驗證HepG2細(xì)胞經(jīng)Lipo/gRNA-LRH-1/ gRNA-ERRα和hCas9復(fù)合物轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液于37℃孵育45 min，隨后加入200μl氯仿混勻，經(jīng)離心分離后按1:1體積加入異丙醇，待白色絮狀物形成后離心收集DNA沉淀，用70%的乙醇洗滌兩次以后加入消毒蒸餾水溶解DNA并測定濃度。隨后利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出突變位點，LRH-1突變位點引物上游5'-TCTCCTCCATCCACAAAAGG-3'；下游5'-CTCGGGTGAGCTGGTATAGG-3'。ERRα突變位點引物上游5'-GCCTCCAACGAGTGTGAGAT-3'；下游5'-GTGGCCTTCCTCAGTAGCAG-3'。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，在T7EⅠ緩沖液中先95℃5 min充分變性，然后按照1℃/min緩慢退火，待退火完成后加入T7EⅠ，消化產(chǎn)物隨后進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 寡聚核苷酸的設(shè)計、合成及退火延伸根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對目的DNA序列識別的規(guī)律，我們設(shè)計了針對核受體LRH-1和ERRα基因組序列的寡聚核苷酸序列，其中黃色背景部分為反向互補(bǔ)序列，也是靶向目的DNA的識別序列(見圖1)。將合成的0.1 nmol寡聚核苷酸序列正鏈和負(fù)鏈經(jīng)退火延伸后，5μl退火延伸產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示，針對LRH-1和ERRα的寡聚核苷酸序列退火產(chǎn)物在100 kb左右均出現(xiàn)明顯的條帶，與預(yù)計片段大小相符，且無其他非特異性片段，提示退火延伸成功(見圖2)。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)和構(gòu)建gRNA-LRH-1和gRNA-ERRα的寡聚核苷酸序列

2.2 寡聚核苷酸退火產(chǎn)物與gRNA載體的連接和驗證gRNA空載體經(jīng)AflII限制性核酸內(nèi)切酶消化，酶切產(chǎn)物和寡聚核苷酸退火延伸產(chǎn)物經(jīng)純化定量后利用Gibson Assembly?Cloning Kit進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪板培養(yǎng)后分別選取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后送華大基因公司測序分析，其測序結(jié)果與合成的寡聚核苷酸序列比對后完全一致，證實gRNA-LRH-1和gRNA-ERRα重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功(見圖3)。

圖2 寡聚核苷酸退火產(chǎn)物的電泳分析

2.3 基因組DNA的提取及突變的SURVEYOR驗證HepG2細(xì)胞經(jīng)Lipo/gRNA-LRH-1/gRNA-ERRα和hCas9復(fù)合物轉(zhuǎn)染24 h后提取全基因組DNA，經(jīng)定量后以基因組DNA為模板，以分別針對LRH-1和ERRα基因組突變位點的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后用T7EⅠ消化，隨后對PCR產(chǎn)物和消化產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果顯示在對照組和實驗組均能檢測到與預(yù)計大小相符的目的條帶。經(jīng)T7EⅠ消化后，在轉(zhuǎn)染gRNA-LRH-1/ hCas9組的電泳結(jié)果顯示出現(xiàn)兩條額外的358 bp和281 bp的片段，轉(zhuǎn)染gRNA-ERRα/hCas9組出現(xiàn)兩條額外的366 bp和316 bp的片段，與預(yù)計大小相符(見圖4)。該結(jié)果說明部分HepG2細(xì)胞的基因組序列因為產(chǎn)生了由CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘發(fā)的隨機(jī)插入或刪除的非同源重組的末端修飾，從而導(dǎo)致基因組突變而在PCR產(chǎn)物經(jīng)緩慢退火時不能完全配對(Mismatch)，因此能被T7EⅠ識別從而切斷成兩條小的DNA片段，證實CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功在HepG2細(xì)胞基因組上導(dǎo)致定點突變。

圖3 gRNA-LRH-1和gRNA-ERRα重組質(zhì)粒載體的測序驗證

圖4 HepG2基因組DNA突變的SURVEYOR驗證

3 討論

CRISPR/Cas9技術(shù)是繼鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)技術(shù)后可用于定點基因組編輯并取得快速發(fā)展的新興技術(shù)，且有效率高、速度快及簡單經(jīng)濟(jì)的特點，在構(gòu)建基因敲除動物模型的應(yīng)用前景將非常廣闊[8]。目前已有多個研究小組利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因敲除小鼠并獲得成功，其中來自劍橋大學(xué)的Rudolf Jaenisch課題組利用該技術(shù)在胚胎干細(xì)胞中同時敲除多達(dá)5個基因，并且通過受精卵注射，成功構(gòu)建同時敲除兩個基因的基因敲除小鼠[9]。盡管CRISPR/ Cas9技術(shù)近幾年在構(gòu)建基因敲除動物模型的應(yīng)用取得了可喜的成績，但是目前利用該技術(shù)在穩(wěn)定癌細(xì)胞系中構(gòu)建基因敲除模型的報道較少。

核受體是一類轉(zhuǎn)錄因子超家族，其通過受體依賴性或者非受體依耐性的方式調(diào)控下游基因表達(dá)，不僅在新陳代謝、生殖、發(fā)育等生理過程中起著重要的作用，其同樣參與包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[10]。因此本研究選擇兩個重要核受體LRH-1和ERRα基因組序列作為靶序列，擬利用CRISPR/Cas9技術(shù)在肝癌細(xì)胞株HepG2基因組中對特定基因序列定點突變進(jìn)行探索。根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中crRNA識別20個堿基的靶序列DNA時要求靶序列后緊跟一個PAM(NGG)序列的原則，我們首先設(shè)計合成了靶向LRH-1和ERRα基因組序列的寡聚核苷酸序列，并運(yùn)用Gibson Assembly?Cloning Kit將退火延伸的寡聚核苷酸序列產(chǎn)物連接到gRNA載體，測序驗證成功后轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并對轉(zhuǎn)染后的HepG2基因組靶序列進(jìn)行SURVEYOR實驗以驗證突變的產(chǎn)生。結(jié)果顯示靶向LRH-1和ERRα基因組序列的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HepG2細(xì)胞中均導(dǎo)致了特定位點的基因突變。同時結(jié)果提示只有一部分HepG2細(xì)胞中產(chǎn)生了基因突變，這是因為將CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)胞有一定的轉(zhuǎn)染效率，并且CRISPR/Cas9系統(tǒng)對靶基因的剪切和細(xì)胞的修復(fù)過程是一個動態(tài)的過程，另外癌細(xì)胞株中一部分基因存在基因組上拷貝數(shù)的擴(kuò)增，這些原因使得不能利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對大量細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染從而獲得基因敲除細(xì)胞株。若要得到完全敲除LRH-1和ERRα基因的細(xì)胞株則需要進(jìn)行單克隆的篩選和鑒定。

本研究的前期結(jié)果證實了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在肝癌細(xì)胞株HepG2基因組中對核受體LRH-1和ERRα基因組序列進(jìn)行定點突變，為在HepG2細(xì)胞中建立LRH-1和ERRα基因敲除細(xì)胞模型奠定了基礎(chǔ)。

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Exploration of site-directed mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 system in HepG2.

XIAO Li-jia,LONG Shou-bin,LUO Li,SHEN Hua-qing,HAO Jian-hua.Department of Clinical Laboratory,Nanshan Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Shenzhen 518052,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore whether CRISPR/Cas9 system could be effective in hepatocarcinoma cell line HepG2.MethodsgRNA plasmids targeting nuclear receptor LRH-1 and ERRα were designed and constructed.After verification by sequencing,gRNA-LRH-1/gRNA-ERR α and hCas9 plasmids were transfected in HepG2 cells respectively.Then mutation sites were amplified by PCR and mutation rates were evaluated by SURVEYOR assay.ResultsgRNA-LRH-1 and gRNA-ERRα recombination plasmids targeting nuclear receptor LRH-1 and ERRα were successfully established.After transfecting HepG2 with gRNA-LRH-1/gRNA-ERRα and hCas9,the mutation sites were amplified by PCR and subjected to SURVEYOR assay.The electrophoresis results showed that two additional bands with expected size were found in cells transfected with gRNA-LRH-1/gRNA-ERRα and hCAS9.ConclusionThe site-directed mutagenesis of LRH-1 and ERRα gene locus were successfully created by genome editing mediated by CRISPR/Cas9 in HepG2,which provides the basis for the generation of HepG2-LRH-1/ERRα knockout cell model.

CRISPR;HepG2;Genome editing;Site-directed mutagenesis

R37

A

1003—6350（2015）01—0007—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.01.0003

2014-07-03)

深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目（編號：201402135）

郝建華。E-mail：haojmail@aliyun.com