摘 要 毛狀根培養(yǎng)技術是在植物基因工程和植物細胞工程相互融合基礎上發(fā)展的一種新的培養(yǎng)技術。毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)與常規(guī)植物組織培養(yǎng)技術相比，具有生長快、易于培養(yǎng)、有效物質產量高的優(yōu)點。綜述了發(fā)根農桿菌誘導番茄產生毛狀根的影響因素，包括發(fā)根農桿菌的菌株類型、外植體類型、預培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間、侵染時間、菌液濃度、抗生素、外源生長調節(jié)劑和化學因子，并對番茄毛狀根誘導存在的問題進行展望。

關鍵詞 發(fā)根農桿菌；番茄；毛狀根；誘導因素

中圖分類號：Q812 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）34-053-05

知網出版網址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20151230.1807.032.html 網絡出版時間：2015/12/30 18：07：00

毛狀根培養(yǎng)技術是在植物基因工程和植物細胞工程相互融合基礎上發(fā)展的一種新的培養(yǎng)技術[1]。毛狀根發(fā)根是由發(fā)根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染雙子葉植物、裸子植物或少數(shù)單子葉植物，在植物侵染部位或周圍產生大量不定根，而獲得的毛狀根所再生的植株，不僅表現(xiàn)出抗逆境能力強、葉片皺縮、節(jié)間縮短等現(xiàn)象，而且還能提高產量，次生代謝含量很大程度上高于原品種。國外已利用發(fā)根農桿菌獲得次生代謝產物，在這方面有深入的研究，其中許多植物（如紫草、甜菜、蘿卜、長春花等）的發(fā)根已進行工業(yè)化生產；國內在利用發(fā)根農桿菌獲得轉基因植物和生產次生代謝方面也取得了可喜的成績，獲得了油菜、甘草、甘藍、決明、西洋參、番茄等植物的發(fā)根，有的還得到了轉基因植物，有的在發(fā)根中檢測到了次生代謝[2]。

番茄紅素（Lycopene）是一種天然類胡蘿卜素，而類胡蘿卜素也是三大次生代謝產物之一（萜烯類化合物），其猝滅單線態(tài)氧和清除自由基能力是最強的[3]。番茄紅素具有抗氧化能力，能有效降低癌癥、心血管病、血脂病、血糖病等多種疾病的發(fā)病率，能增強免疫細胞活性，預防骨質疏松，抗炎癥、抗凝血，降低總膽固醇含量等[4-11]。番茄紅素主要存在于番茄、西瓜、葡萄柚和番石榴等植物中，其中以番茄相對含量最高，達到0.2～20 mg/100 g，但絕對含量依然很低，且不同品種及不同成熟程度含量也明顯不同[12]。毛狀根培養(yǎng)技術是提高番茄中番茄紅素最有效的途徑之一，而發(fā)根農桿菌的菌株類型、外植體的類型、預培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間、侵染時間和菌液濃度、抗生素及外源生長調節(jié)劑和化學因子均是發(fā)根農桿菌誘導番茄產生毛狀根的影響因素。本文就近些年番茄毛狀根研究進展進行系統(tǒng)闡述，并對番茄毛狀根誘導問題作展望。

1發(fā)根農桿菌的生物學特征及分類

發(fā)根農桿菌是一種寄生非常廣泛的土壤細菌[13]，為根瘤科（Rhizobiaceae）農桿菌屬（Agrobacterium）的一種革蘭氏陰性菌，外形呈桿狀，具鞭毛，其內具有誘導毛狀根產生的Ri質粒[2]，Ri質粒是發(fā)根農桿菌染色體外一個巨大的侵入性根誘導質粒，為共價閉合環(huán)狀DNA，大小為200～800 kb，具有獨立的遺傳復制能力，按其功能的不同主要有T-DNA區(qū)（Transfer-DNA region）、Vir區(qū)（Virulence region）、Ori區(qū)（Origin of replication）、冠癭堿代謝功能區(qū)（OPCA， Opine catabolism region）[14]。T-DNA區(qū)意為“轉移進入植物細胞核的轉移區(qū)”，Vir意為“致瘤區(qū)”。

發(fā)根農桿菌侵染植物后，T-DNA在Vir區(qū)的脅迫下能夠轉移并整合到植物基因組中，利用植物的營養(yǎng)成分編碼合成冠癭堿，根據(jù)侵染產生冠癭堿種類的不同，Ri質?？梢苑譃檗r桿堿（agropine）型、黃瓜堿（cucronpine）型、甘露堿（mannopine）型和異黃瓜堿（mikimonpine）型，其中含農桿堿型Ri質粒上的菌株具更廣泛的宿主范圍和發(fā)根性[15]。

2發(fā)根農桿菌誘導毛狀根的影響因素

2.1菌株類型

目前常用的發(fā)根農桿菌菌株有ATCC15834、R1000、A4、R1601、C58C1等，在誘導植物產生毛狀根的菌株中，A4菌株使用率（27%）> ATCC15834（20%）> R1601（14%）；不同植物對于不同菌株的敏感性差異較大[16]，同種植物對于不同菌株的敏感性也有一定的差異。胡霄等[17]以番茄子葉為外植體，選用R1000、A4和ATCC15834菌株對其進行轉化，結果表明，當番茄苗齡為12～16 d、菌液濃度OD600=0.4～0.6時，A4菌株（29.6%）的誘導率均大于R1000（7.4%）和ATCC15834（17.3%）。郝瑞文[18]利用A4、9402Bin19、ATCC15834這3個發(fā)根農桿菌菌株感染懷牛膝的葉切片和莖段外植體，獲得毛狀根轉化體系，并篩選了優(yōu)質株系，其中3個菌株誘導毛狀根的頻率明顯不同，ATCC15834的轉化頻率最高，為60%～80%，A4的轉化頻率為40%～55%，9402Bin19的轉化頻率最低，為30%～40%。因此，利用不同菌株轉化同一植株部位，或利用同種菌株轉化同一植株不同部位，或利用同種菌株轉化同一植株同一部位的不同生理期，毛狀根誘導率均存在差異。

2.2外植體類型

發(fā)根農桿菌已在許多植物（番茄、棉花、人參等）的外植體上誘導出毛狀根，不同外植體（葉片、莖、子葉、愈傷組織、下胚軸等）誘導植株產生毛狀根存在差異。黃彩紅等[19]利用發(fā)根農桿菌對2個番茄品種（P26和組培大黃）的子葉、下胚軸（上、中、下部位）4種外植體進行誘導，結果表明，P26番茄的誘導率，子葉（平均為36.7%）>下胚軸中部（28.8%）>下胚軸下部（26.6%）>下胚軸上部（9.5%）；而組培大黃的下胚軸上部（平均為24.5%）>下胚軸下部（22.4%）>子葉（21.2%）>下胚軸中部（18.3%）。胡霄等[17]利用發(fā)根農桿菌ATTCC15834對番茄無菌苗的不同部位（子葉、下胚軸、葉片）進行誘導并產生毛狀根，結果表明，只有子葉能長出穩(wěn)定的毛狀根；下胚軸有少量毛狀根產生，但容易出現(xiàn)褐化，并且不易脫菌；葉片出現(xiàn)褐化且無毛狀根產生，這可能是因為子葉和下胚軸的再生能力強；葉片在處理過程中容易被風干，傷口處的細胞容易死亡，從而影響其侵染；而下胚軸在侵染以后，很難將其多余菌液吸干，造成不易脫菌。一般認為，幼嫩的、生長旺盛的植物組織對發(fā)根農桿菌更敏感，有利于菌株的侵染，適宜作為誘導植株產生毛狀根的外植體。

2.3預培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間

2.3.1 預培養(yǎng)時間

外植體經過預培養(yǎng)后能促進細胞分裂，分裂的細胞更容易整合外源DNA，從而提高外源基因的轉化效率；同時，通過預培養(yǎng)還能提高外植體的適應能力，使其能夠適應離體培養(yǎng)的條件，保持活躍的生長狀態(tài)[20]。任永霞等[21]研究表明，不經預培養(yǎng)直接侵染的3個番茄品種（‘東農709’、‘東農708’和‘東農704’）的子葉均變白、變褐、萎蔫，無產生抗性愈傷組織的能力，而經過預培養(yǎng)2或5 d后抗性愈傷誘導率均較高，且不同品種間也有差別，東農704誘導率最高（42.2%），東農708其次（28.9%），東農709最低（27.9%）；且隨著預培養(yǎng)時間的不同，抗性誘導率也不同，子葉（東農709品種外植體）預培養(yǎng)2和5 d，而后侵染10、15和20 min，其5 d預培養(yǎng)且侵染10、15和20 min的抗性愈傷誘導率（37.0%、27.9.5%和26.3%）均大于2 d預培養(yǎng)且侵染10、15和20 min的抗性愈傷誘導率（32.1%、21.6和11.6%）。

2.3.2 共培養(yǎng)時間

共培養(yǎng)時間對誘導植株產生毛狀根的頻率也有影響，這是因為發(fā)根農桿菌的T-DNA轉移與整合需要一定的時間，所以為了能夠保證充分轉化，一般都將外植體放在不含抗生素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d左右，進行除菌[20]。陳雙臣等[22]、劉晶等[23]和王婷婷[24]研究均表明，共培養(yǎng)2 d對農桿菌介導番茄轉化是最優(yōu)的。

2.4侵染時間和菌液濃度

2.4.1 侵染時間

侵染時間是影響發(fā)根農桿菌誘導植物外植體產生毛狀根的關鍵因素。侵染時間過短，發(fā)根農桿菌不能對植物細胞進行充分附著；侵染時間過長，發(fā)根農桿菌則容易對植物細胞造成傷害[15]。不同的學者采用了不同的侵染時間來誘導番茄產生毛狀根，梁超[25]用OD600為0.3的菌液侵染預培養(yǎng)2 d的番茄子葉，結果表明，當侵染3、6和10 min時，抗性芽的生成率分別是8.6%、24.8%和1.4%。王金華等[26]對預培養(yǎng)的天數(shù)（1、2和3 d）、農桿菌液的倍數(shù)（10、20和30倍）、侵染時間（10、20和30 min）、共培養(yǎng)天數(shù)（1、2和3 d）這四因素，采用L9（34）正交實驗，結果表明，預培養(yǎng)3 d、農桿菌的稀釋倍數(shù)30倍、侵染時間20 min和共培養(yǎng)天數(shù)2 d，可達到最佳的遺傳轉化效果。

2.4.2 菌液濃度

菌液濃度對毛狀根的誘導轉化也存在差異，不同植物、不同外植體誘導毛狀根所需菌液濃度不同，菌液濃度的高低直接影響著農桿菌侵染效率[15]。番茄遺傳轉化所用農桿菌菌液濃度多為OD600=0.2～0.6。胡霄等[17]以番茄子葉為外植體，在8～12 d的苗齡時，ATCC15834菌株的誘導率在侵染菌液濃度OD600=0.4～0.6時誘導率最高，可以達到58.8%；在8～12 d的苗齡時，R1000菌株誘導率隨侵染濃度增加而增加，OD600=0.2～0.4、0.4～0.6和0.6～0.8，誘導率分別為13.0%、17.0%和25.5%。

2.5抗生素及外源生長調節(jié)劑

在遺傳轉化中，頭孢霉素、卡那霉素和潮霉素是使用較廣泛的抗生素，抗生素種類和濃度對植物轉化效率有不同的效果，合適的抗生素不僅能起到良好的抑菌效果，而且有利于植物產生毛狀根。陳珍和朱誠[27]研究表明，以卡那霉素抗性基因作為篩選標記的植物表達載體質粒p2301和pBI121，其轉化頻率高于以潮霉素抗性基因為篩選標記的植物表達載體pl301；其中在MB0誘導培養(yǎng)基添加不同梯度（200、400、600和800 mg/L）的頭孢霉素，番茄子葉外植體的再生頻率分別為73.33%、60%、66.7%。

毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)具有生長快速、不需外源植物生長調節(jié)劑、合成次生代謝物質能力強而且穩(wěn)定，并能向培養(yǎng)液釋放部分代謝產物等優(yōu)點，但加入適當濃度外源生長調節(jié)劑，更能促進毛狀根次級代謝產物的積累[28]。王婷婷[24]以不同生長調節(jié)劑（ZT、IAA和GA）及濃度進行組合，結果表明，番茄子葉誘導芽分化最佳的ZT與IAA組合是“MS+ZT2.0 mg/L+IAA0.1 mg/L”，不定芽分化效率達到了95.0%。趙明珠和張美萍[29]以‘大紅番茄’‘紅牛奶番茄’和‘粉冠888’這3種無菌番茄苗的子葉為外植體，對其分化培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基進行篩選，結果表明，‘粉冠888’可為遺傳轉化提供大量穩(wěn)定的外植體來源，適宜的分化培養(yǎng)基為“MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L”，生根培養(yǎng)基為“MS+IAA 0.5 mg/L”。

2.6化學因子

植物細胞能分泌某些酚類化合物，可誘發(fā)農桿菌內Ti或Ri質粒DNA上Vir區(qū)基因的活化和高效表達，促進農桿菌T-DNA向宿主細胞核轉移，從而提高遺傳轉化效率，其中誘導效果最佳的是乙酰丁香酮（AS），而AS因其較強的誘導性，已在許多植物如毛白楊、煙草、玉米、番茄等使用，大大提高了其轉化率[30]。有些研究表明，AS必須在誘導培養(yǎng)液中和共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中同時使用，才能大大提高轉化效率[31]，目前，在大多數(shù)的研究中，無論是誘導培養(yǎng)基還是共培養(yǎng)基，AS的有效濃度一般為50～200 μmol/L[32-33]。另外，也有研究者認為高濃度的乙酰丁香酮對葉片有毒害作用，但其毒害機制尚不清楚[34]。因此，在番茄遺傳轉化中，AS使用濃度有待進一步探討。

此外，一些金屬離子（Cu2+和Ag+）能夠很好地誘導蕎麥[35]和駱駝刺[36]產生毛狀根。在今后番茄的遺傳轉化中，也可以嘗試使用一些金屬離子，以提高轉化效率。

3問題及展望

毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)與常規(guī)植物組織培養(yǎng)技術相比，具有生長快、易于培養(yǎng)、有效物質產量高的優(yōu)點，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應用前景。但毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)大多用于生產藥用植物的次生代謝產物上，在果蔬作物上應用研究很少。隨著研究的不斷深入，還有一些問題待解決，如目前發(fā)根農桿菌不同菌株侵染相同番茄品種的能力或相同菌株侵染不同番茄品種的能力差異機制尚不明確；發(fā)根農桿菌誘導番茄產生毛狀根的眾多因素，相互制約、相互促進，在眾多因素尋找一個切合點（即番茄模式植物）至關重要；利用毛狀根體系適應逆境（干旱）環(huán)境和生產番茄次生代謝大多處于實驗研究階段，較少將其作為一種生物反應器應用于工業(yè)大規(guī)模生產，這些都需要研究者進行更深入、更成熟的探究。

隨著分子生物學的快速發(fā)展，對發(fā)根農桿菌的功能及其應用方面進一步深化了解，未來期望對Ri質粒上的rolB基因實現(xiàn)準確有效的轉化與調控，達到產生特定次生代謝產物、定性改良性狀的目的，從而為解決番茄生產上適應逆境（干旱）環(huán)境和大量生產次生代謝物及優(yōu)良品種等培育體系提供一條全新的途徑。

參考文獻：

[1]張廣求，王伯初，段傳人，等.提高毛狀根中此生代謝產物含量的方法與技術[J].重慶大學學報（自然科學版），2005，28（6）：121-124.

[2]劉偉，郝建平.發(fā)根農桿菌的研究進展及其應用[J].山西農業(yè)科學，2007，35（7）：13-16.

[3]李娜娜，吳曉英，吳振強.番茄紅素在化妝品中的應用展望[J].廣東化工，2014，41（18）：87-88.

[4]Vaishampayan U，Hussain M，Banerjee M，et al. Lycopene and soy isoflavones in the treatment of prostate cancer [J].Nutr Cancer，2007，59（1）：1-7.

[5]張濤，邱青朝，胡波.番茄紅素對人前列腺癌PC-3細胞周期的阻滯作用[J].南華大學學報（醫(yī)學版），2008，36（6）：748-751.

[6]Reid K，F(xiàn)akler P. Protective effect of lycopene on serum cholesterol and blood pressure： Meta-analyses of intervention trials[J].Maturitas，2011，68：748-751.

[7]蘇小華，鮑波，朱少平，等.番茄紅素的功能與穩(wěn)定性研究進展[J].生物技術進展，2013，3（1）：18-21.

[8]羅金鳳，任美艷，陳敬鑫，等.番茄紅素的生理功能及保持其穩(wěn)定性方法的研究進展[J].食品科學，2011，32（19）：279-283.

[9]張帶榮.番茄紅素防治前列腺癌的研究進展[J].中國臨床藥理學雜志，2014，30（10）：962-965.

[10]陳錦瑤，張立實.番茄紅素的生物學作用及應用研究進展[J].衛(wèi)生研究，2013，42（2）：336-342.

[11]Watzl B，Bub A，Blockhaus M，et al. Prolonged tomato juice consumption has no effect on cell-mediated immunity of well-nourished elderly men and women [J].J Nutr，2000，130（7）：1719-1723.

[12]呂鑫，侯麗霞，張曉明，等.番茄果實成熟過程中番茄紅素含量的變化[J].中國蔬菜，2009（6）：21-24.

[13]張艷馥，劉偉華，姜靜，等.Ri質粒誘導的植物發(fā)根培養(yǎng)體系及其應用[J].生物技術，1997，7（3）：4-6.

[14]譚燕.決明組培無性系建立及其毛狀根結構與抗氧化酶系特征[D].重慶：西南大學，2014.

[15]劉連旺，張永清，李先恩.藥用植物毛狀根研究進展[J].山東中醫(yī)藥大學學報，2015，39（3）：288-291.

[16]張萌，高偉，王秀娟.藥用植物毛狀根的誘導及其應用[J].中國中藥雜志，2014，39（11）：1956-1960.

[17]胡霄，唐瑤，李婷，等.不同發(fā)根農桿菌菌株誘導番茄毛狀根的研究[J].廣東農業(yè)科學，2015（3）：20-23.

[18]郝瑞文.農桿菌介導番茄和牛膝的遺傳轉化及霸王組培再生[D].西安：西北大學，2005.

[19]黃彩紅，孫洪祥，周淑香，等.發(fā)根農桿菌介導番茄遺傳轉化研究[J].北方園藝，2001（3）：32-33.

[20]李素紅.決明毛狀根誘導培養(yǎng)體系優(yōu)化及成分分析[D].重慶：西南大學，2012.

[21]任永霞，王罡，王萍，等.影響農桿菌介導類胡蘿卜素合成酶基因LycB轉化番茄主要因子的研究[J].作物雜志，2005（1）：18-20.

[22]陳雙臣，劉愛華，王鳳華，等.農桿菌介導的番茄Micro-Tom遺傳轉化體系的建立[J].華北農學報，2010，25（2）：112-115.

[23]劉晶，周樹峰，陳華，等.農桿菌介導的雙價抗鹽基因轉化番茄的研究[J].華東農學報，2005，38（8）：1636-1644.

[24]王婷婷.番茄再生體系和轉化體系的優(yōu)化研究[D].太谷：山西農業(yè)大學，2013.

[25]梁超，王景雪，裴雁曦，等.根癌農桿菌介導的番茄高效遺傳轉化體系的研究[J].華北農學報，2009，24（2）：71-74.

[26]王金華，葛晨慧，曹守軍，等.番茄組織再生及其遺傳轉化體系的優(yōu)化[J].青島農業(yè)大學學報，2007，24（1）：24-27.

[27]陳珍，朱誠.農桿菌介導的番茄遺傳轉化體系優(yōu)化研究[J].浙江大學學報（農業(yè)與生命科學版），2008，34（6）：615-620.

[28]劉莉莉，李昌禹.毛狀根發(fā)展現(xiàn)狀研究[J].北方園藝，2014（24）：178-182.

[29]趙明珠，張美萍.不同番茄品種再生體系的比較[J].北方園藝，2011（9）：127-129.

[30]鄧藝，曾炳山，趙思東，等.乙酰丁香酮在農桿菌介導的遺傳轉化中的作用機制及應用[J].安徽農業(yè)科學，2010，38（5）：2229-2232.

[31]宋洪元，任雪松，司軍，等.利用Cre/lox重組系統(tǒng)建立番茄基因工程雄性不育恢復系[J].中國農業(yè)科學，2009，42（10）：3581-3591.

[32]趙慧，侯雷平，王慧，等.影響小白菜子葉再生的因素[J].分子植物育種，2009，7（5）：1-6.

[33]李梅蘭，王小菁，李紅清.根癌農桿菌介導藍豬耳轉化系統(tǒng)的建立[J].園藝學報，2006，33 （1）：105-110.

[34]Koc N.K.，Kayim H.，Yetisir H.，et al. The improvement of resistance to bacterial speck in transgenic tomato plants by Agrobacterium tomefaciens mediated transformation[J].Russian Journal of Plant Physiology，2007，54（1）：89-96.

[35]金紅，賈敬芬，郝建國，等.發(fā)根農桿菌A4對蕎麥的遺傳轉化[J].西北大學學報（自然科學版），2000，30（3）：235-238.

[36]步懷宇，景建洲，郝建國，等.不同轉化因子對發(fā)根農桿菌Ri質粒轉化駱駝刺的影響[J].西北大學學報，2000，20（4）：577-584.

（責任編輯：丁志祥）