鄧菲丹 羅建業(yè)

結(jié)腸癌患者機(jī)體內(nèi)免疫微環(huán)境的變化已經(jīng)受到人們的重視，其中輔助性T細(xì)胞（Th）亞群Th1/Th2的失衡在惡性腫瘤免疫逃逸與免疫耐受中非常重要[1]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中，約有3%~5%的胞嘧啶被甲基化，基因甲基化異常與結(jié)腸癌變化密切相關(guān)[2]，因此制定結(jié)腸癌Th1、Th2相關(guān)細(xì)胞因子DNA甲基化譜對(duì)結(jié)腸癌的早期診斷有重要意義。本文通過檢測(cè)結(jié)腸癌患者結(jié)腸組織中Th1/Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）和干擾素-γ（IFN-γ）基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄活性，旨在探討DNA甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系及其在結(jié)腸癌中的作用，為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2011年1月-2014年6月本院住院部就診的80例結(jié)腸癌患者組織為結(jié)腸癌組、80例相應(yīng)癌旁組織為癌旁組和100例正常結(jié)腸組織為對(duì)照組。結(jié)腸癌患者年齡34~75歲，中位年齡49歲，男55例，女25例，病理類型均為鱗癌，根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)[3]，高分化鱗癌14例，中分化鱗癌42例，低分化鱗癌24例。對(duì)照組32~75歲，中位年齡49歲。收集三組患者的結(jié)腸組織標(biāo)本，其中對(duì)照組標(biāo)本來源于結(jié)腸息肉組織，結(jié)腸癌組標(biāo)本來源于結(jié)腸活檢和手術(shù)治療，癌旁組標(biāo)本來源于結(jié)腸癌旁組織手術(shù)，結(jié)腸癌患者所有手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)過本院病理學(xué)專家明確診斷，在患者手術(shù)中取病理標(biāo)本，標(biāo)本放入液氮中速凍后-80 ℃條件下保存待檢，樣本獲得了倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)標(biāo)本相關(guān)的DNA和RNA提取 均按試劑盒說明書提供的方法提取三組結(jié)腸組織DNA與RNA，并采用瓊脂糖凝膠電泳并鑒定DNA和RNA完整性。

1.2.2 IL-10和IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè) 按照EZ DNA Methylation-GoldTM Kit試劑盒（購自美國Zymoresearch公司）操作說明對(duì)DNA進(jìn)行甲基化修飾及純化。在NCBI線上檢索IFN-γ（J00219）和IL-10（AF418271）基因啟動(dòng)子區(qū)序列，Methyl Primer Express V2.0軟件進(jìn)行分析核對(duì)參考物[4]，亞硫酸氫鹽測(cè)序法（BSP）檢測(cè)IL-10基因啟動(dòng)子?；禺愋訮CR（MSP）檢測(cè)IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)非甲基化及甲基化基因，IL-10和IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)序列一甲基化特異性PCR和RT-PCR 引物序列如表1所示?；Y(jié)果判斷：出現(xiàn)甲基化特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物判斷定為甲基化，僅非甲基化特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物判斷定為非甲基化。

表1 IL-10和IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)序列一甲基化特異性PCR和RT-PCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以 （±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組結(jié)腸組織IL-10和IFN-γ mRNA的表達(dá)比較 三組IL-10和IFN-γ mRNA 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中結(jié)腸癌組和癌旁組IL-10 mRNA均高于對(duì)照組（P<0.05），IFN-γ mRNA均低于對(duì)照組（P<0.05），結(jié)果見表2。

表2 三組結(jié)腸組織IL-10和IFN-γ mRNA的表達(dá)比較（x-±s） copy/mL

2.2 三組IL-10和IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率比較 三組結(jié)腸組織IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-320、-350、-352、-373位點(diǎn)甲基化率進(jìn)行相互比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；三組結(jié)腸組織基因啟動(dòng)子區(qū)-110、-185位點(diǎn)甲基化率進(jìn)行相互比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中結(jié)腸癌組和癌旁組IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-110均高于健康對(duì)照組（P<0.05），結(jié)腸癌組IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-185低于健康對(duì)照組（P<0.05），結(jié)果見表3；IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率結(jié)腸癌組>癌旁組>對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果見表3；三組結(jié)腸組織提取DNA的IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)見電泳圖1。

2.3 IL-10基因啟動(dòng)子區(qū) 通過在線的TFSEARCH軟件分析發(fā)現(xiàn)，IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)包含有STAT3或Ets-1、HSF、CCAAT-box、HSF與AP-4、ER共 5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域，見圖2。

3 討論

機(jī)體Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在體內(nèi)抑制腫瘤生發(fā)展中扮演的重要角色，而Th1向Th1漂移，將造成機(jī)體免疫抑制狀態(tài)，使腫瘤能夠逃避免疫監(jiān)視[5-6]。IFN-γ是Th1類分泌的主要較早抗腫瘤細(xì)胞因子之一，且協(xié)助腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1極化；IL-10是Th2類分泌免疫抑制細(xì)胞因子，是一種抑制或者下調(diào)的Th1型免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，具有多種抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的物生作用，使腫瘤細(xì)胞免疫耐受。IL-10高表達(dá)則促進(jìn)機(jī)體腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。筆者研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌患者IL-10表達(dá)水平明顯比健康者強(qiáng)，抗腫瘤相關(guān)的IFN-γ則低表達(dá)，這說明，機(jī)體正處于明顯的Th1/Th2失衡狀態(tài)，Th0細(xì)胞向Th2漂移極化現(xiàn)象，T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原肽的無能狀態(tài)，這是結(jié)腸癌患者免疫監(jiān)視功能嚴(yán)重低下的最主要原因。

表3 三組結(jié)腸組織IL-10和 IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率比較 例（%）

圖1 MSP檢測(cè)三組結(jié)腸組織IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)注：1為電泳標(biāo)記，N為空白對(duì)照，U為非甲基化，M為甲基化，2為對(duì)照組，3為結(jié)腸癌組，4為癌旁組

圖2 IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

DNA甲基化主要在mRNA轉(zhuǎn)錄基因水平抑制細(xì)胞因子基因的表達(dá)，CpG島甲基化與其所在基因的表達(dá)呈反比，即CpG島甲基化程度越高，mRNA基因表達(dá)水平越低，反之則越高[7-8]。本研究對(duì)三組不同結(jié)腸組織的IL-10和IFN-γ基因的甲基化狀態(tài)進(jìn)行在線的TFSEARCH軟件分析，結(jié)腸癌患者結(jié)腸癌組織IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)-185位點(diǎn)甲基化率明顯較低，使IFN-γ甲基化率異常性增高，這與張磊昌等[9]相關(guān)研究報(bào)道一致，說明DNA甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)異常，喪失對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及對(duì)異常細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，造成免疫功能低下，促使癌細(xì)胞的過度增殖，從而可能導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。

DNA甲基化在生物界是一種正常的自然修飾方式，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的過程DNA甲基化引起抑癌基因轉(zhuǎn)錄抑制，其中約70%~80%的甲基化發(fā)生在CpG序列上，結(jié)腸癌組織IL-10基因CpG島的甲基化率較低，這與結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)IL-10基因的轉(zhuǎn)錄因子SP1、CCAAT-box、STAT3和Ets-1有關(guān)[9-10]。因此，本研究采用BSP進(jìn)一步論證了甲基化對(duì)IL-10基因的轉(zhuǎn)錄活性的影響，在結(jié)腸癌組織中IL-10基因啟動(dòng)子高甲基化的發(fā)生率明顯高于正常健康組織，IL-10的表達(dá)調(diào)控受多種因素的影響，IL-10的DNA甲基化修飾在這個(gè)過程中起重要作用[11-12]。筆者通過DNA序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組的IL-10的DNA甲基-110、-185位點(diǎn)的甲基化率明顯高于對(duì)照組，他們影響5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子位點(diǎn)相結(jié)合活性，從而造成結(jié)腸癌的IL-10基因啟動(dòng)因子活性增高致使IL-10基因高的表達(dá)，并且負(fù)調(diào)控IFN-γ mRNA的表達(dá)，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增生、凋亡、分化起負(fù)性調(diào)控作用，使結(jié)腸癌細(xì)胞免疫耐受，逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。

綜上所述，IL-10和IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)使IL-10基因高的表達(dá)和IFN-γ mRNA低的表達(dá)，使結(jié)腸癌患者處于明顯的Th1/Th2失衡狀態(tài)，Th0細(xì)胞向Th2漂移極化現(xiàn)象，與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

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