陳佩嬋 侯延平 鄭振 劉先秒 譚慶林

乙型病毒性肝炎是人類的重要疾病類型之一，是嚴(yán)重影響全球公共衛(wèi)生的重大問(wèn)題。全球20億人群曾感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中3.5億人為慢性乙型病毒性肝炎，且終身攜帶乙型肝炎病毒，最終并發(fā)肝硬化或肝臟惡性腫瘤而死亡人數(shù)高達(dá)100萬(wàn)人/年[1-2]。近年來(lái)，有關(guān)于慢性乙型病毒性肝炎的中醫(yī)辨證分型與T細(xì)胞亞群、白細(xì)胞介素、載脂蛋白等量化指標(biāo)關(guān)系的研究報(bào)道[3]。同時(shí)有慢性乙型肝炎臨床癥狀與熱休克蛋白70的文獻(xiàn)研究報(bào)道[4]。但關(guān)于尿液水通道蛋白2 （AQP-2）、血清休克蛋白70（HSP70）和外周血T淋巴細(xì)胞亞群與慢性乙型病毒性肝炎濕熱證的關(guān)系研究甚少。本研究通過(guò)檢測(cè)尿液水通道蛋白2、血清熱休克蛋白70和外周血T淋巴細(xì)胞亞群等指標(biāo)的變化，以探討慢性乙型病毒性肝炎濕熱證的量化規(guī)律，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月-2013年12月高要市人民醫(yī)院消化內(nèi)科住院部西醫(yī)診斷慢性乙型病毒性肝炎，中醫(yī)辨證屬于濕熱證患者101例，排除甲型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、丁型病毒性肝炎、戊型病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化、肝纖維化和肝臟惡性腫瘤等肝臟疾病，將患者分為兩組，其中慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證者為A組，共50例，其中男32例，女18例，年齡19~65歲，平均（45.23±6.32）歲，慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證者為B組，共51例，其中男34例，女17例，年齡19~64歲，平均（45.15±6.24）歲。同期選取肝功能正常，未合并肝臟疾病和濕熱證的健康人群作為正常組，共50例，其中男30例，女20例，年齡18~66歲，平均（45.44±6.01）歲，三組間性別、年齡等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 慢性乙型病毒性肝炎西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》標(biāo)準(zhǔn)[5]，血清乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）或血清HBV-DNA陽(yáng)性大于6個(gè)月以上，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）大于正常上限2倍而低于正常上限的10倍。

1.3 濕熱證中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 濕熱證的辨證參照《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》（第6版，王永炎主編）黃疸章節(jié)中的辨證分型擬定[6]。（1）證候表現(xiàn)為身目發(fā)黃如橘，無(wú)發(fā)熱或身熱不揚(yáng)，頭重身困，嗜臥乏力，胸脘痞悶，厭食油膩，納呆嘔惡，口粘不渴，小便不利，便稀不爽，舌苔厚膩微黃，脈濡緩或弦滑者辨為濕偏重證。（2）證候表現(xiàn)為全身皮膚及白睛發(fā)黃，黃疸重，色澤鮮明，壯熱口渴，心中懊惱，脅脹痛而拒按，惡心嘔吐，納呆，小便赤黃或短少，大便秘結(jié)，舌紅苔黃膩或黃糙，脈弦數(shù)或滑數(shù)者辨為熱偏重證。

1.4 檢測(cè)方法 （1）尿液水通道蛋白2（AQP-2）：留取晨尿20 mL，尿液樣本收集后離心，取上清液，放入-20 ℃冰箱凍存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA 法）檢測(cè)尿液水通道蛋白2（AQP-2）水平，各試劑及尿液標(biāo)本在檢測(cè)前平衡至室溫，采用0.05% SDS-PBS等倍稀釋后，4 ℃過(guò)夜，漂洗封閉后滴加一抗（兔抗鼠1∶1000，經(jīng)3%BSA-PBS稀釋），37 ℃環(huán)境下孵育2 h，漂洗后滴加二抗（1∶2000），37 ℃環(huán)境下孵育1.5 h，顯色終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度（OD值）。（2）采用ELISA 法檢測(cè)血清熱休克蛋白70（HSP70），空腹抽取靜脈血2~3 mL，血標(biāo)本抽取后隨即分離出血清放入-20 ℃冰箱凍存待測(cè)。用ELISA方法測(cè)定血清樣品中HSP70含量，各試劑及血液標(biāo)本在檢測(cè)前平衡至室溫，采用PBS緩沖液洗滌，4 ℃過(guò)夜，漂洗封閉后滴加一抗，常溫下孵育2 h，PBS緩沖液洗滌后滴加二抗，常溫下孵育1.5 h，顯色終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光度。（3）外周血T淋巴細(xì)胞亞群：采用抗體致敏的紅細(xì)胞花環(huán)試驗(yàn)間接測(cè)定外周血T淋巴細(xì)胞亞群，試劑由武漢生物制品研究所提供，采用COULTER流式細(xì)胞儀測(cè)定，以%表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)類型均為計(jì)量資料，屬完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的多組均數(shù)比較，以 （±s）表示，采用One-Way ANOVA對(duì)各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析前首先考察方差齊性，方差齊則組間多重比較用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊則組間多重比較用Dunnett T3法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間AQP-2和HSP70的比較 A組AQP-2明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=15.93，P<0.05），B組AQP-2明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=14.51，P<0.05），且A組AQP-2明顯高于B組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=9.57，P<0.05）。A組HSP70明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=7.21，P<0.05），B組HSP70明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=14.89，P<0.05），且B組HSP70明顯高于A組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=4.41，P<0.05），見表1。

表1 組間AQP-2和HSP70的比較（x-±s）

2.2 組間外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比較 A組、B組和對(duì)照組三組間CD3+比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），A組CD4+、CD4+/CD8+均明顯低于對(duì)照組，兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=12.31，22.45，P<0.05），B組CD4+、CD4+/CD8+均明顯低于對(duì)照組，兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=11.88， 20.74，P<0.05），A組和B組CD4+、CD4+/CD8+比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；A組CD8+明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=10.70，P<0.05），B組CD8+明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=12.64，P<0.05），A組和B組CD8+比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表 2。

表2 組間外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比較（x-±s）

3 討論

我國(guó)是病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)，每年平均發(fā)病率約為（120~140）/10萬(wàn)，其中以乙型病毒性肝炎為主[7]。我國(guó)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染率高達(dá)57.6%，全國(guó)至少6億人曾感染過(guò)乙型肝炎病毒[8]。慢性乙型病毒性肝炎（Chronic viral hepatitis B，CH-B）嚴(yán)重威脅人類健康。目前關(guān)于慢性乙型病毒性肝炎的研究主要涉及中醫(yī)中藥防治、流行病學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和病毒學(xué)等多方面。其中中西醫(yī)結(jié)合治療慢性乙型病毒性肝炎的臨床療效顯著。參照中醫(yī)辨證理論，可將慢性乙型病毒性肝炎分為多種證型，濕熱辯證是慢性乙型病毒性肝炎中醫(yī)辯證的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。慢性乙型病毒性肝炎濕熱證臨床表現(xiàn)多種多樣，由于慢性乙型病毒性肝炎濕熱證在疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，存在濕偏重、熱偏重和濕熱并重等病理改變，對(duì)臨床診斷存在一定難度[10]。因此，如何改善慢性乙型病毒性肝炎濕熱證的診斷效能是臨床研究的重中之重，在濕熱證文獻(xiàn)調(diào)查研究的基礎(chǔ)上結(jié)合慢性乙型病毒性肝炎進(jìn)行濕熱證、濕偏重和熱偏重的量化研究[11]。通過(guò)檢測(cè)慢性乙型病毒性肝炎濕熱證患者AQP-2、HSP70和外周血T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)等相關(guān)指標(biāo)，從生化、免疫和分子生物學(xué)等視角探討慢性乙型病毒性肝炎濕熱證患者的臨床量化規(guī)律，以探討濕偏重和熱偏重的作用機(jī)理，從而進(jìn)一步揭示濕熱證的本質(zhì)[12]。對(duì)濕熱證的濕、熱量化，濕熱病的臨床診斷水平的提高，對(duì)病情預(yù)后的推斷、理法方藥的確定和更好的指導(dǎo)臨床治療有著重大的意義。

濕熱證是嶺南地區(qū)的常見病癥，其與氣候、飲食、體質(zhì)和病原微生物感染等因素緊密相關(guān)，且其臨床表現(xiàn)多樣化。目前初步證實(shí)濕熱證與病原微生物感染緊密相關(guān)，脾胃濕熱與幽門螺旋桿菌感染緊密相關(guān)，而肝臟濕熱與乙型肝炎病毒緊密相關(guān)[13]。濕熱證與細(xì)胞免疫功能顯著相關(guān)，胃腸濕熱證外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+和CD4/CD8比值均明顯低于正常對(duì)照組，差異具有顯著性。胃腸濕熱證患者血清胃泌素、胃動(dòng)素水平均顯著高于健康體檢者[14]。相關(guān)研究報(bào)道顯示，脾胃濕熱患者紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性、紅細(xì)胞ATP含量和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性經(jīng)胰島素代謝或基礎(chǔ)代謝刺激后上述指標(biāo)均明顯高于脾胃氣虛患者，而17-羥基化皮質(zhì)類固醇含量則處于正常范圍內(nèi)，上述研究證實(shí)濕熱證存在細(xì)胞組織物質(zhì)能量代謝的亢進(jìn)狀況，可能為機(jī)體對(duì)濕熱病邪和內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子作出的代謝性效應(yīng)。因此，濕熱證與微生物感染、免疫功能和物質(zhì)代謝的生化指標(biāo)顯著相關(guān)，但關(guān)于慢性乙型病毒性肝炎濕熱證的量化指標(biāo)變化及其意義研究甚少。

濕熱證病理過(guò)程較為復(fù)雜，涉及多臟器、多系統(tǒng)的功能及其結(jié)構(gòu)的改變。由于體質(zhì)對(duì)濕、熱感覺(jué)反應(yīng)的差異性，濕熱證普遍存在濕偏重和熱偏重的區(qū)別。近年來(lái)關(guān)于濕熱證量化的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展。濕熱證動(dòng)物模型體內(nèi)腎臟內(nèi)髓質(zhì)和尿液水通道蛋白2表達(dá)對(duì)于濕熱證“濕”的形成、“濕”的量化程度和“濕”的偏重具有重要的意義[15]。濕偏重型和熱偏重型AQP-2水平較正常體檢者顯著增高，其中濕偏重型AQP-2水平顯著高于熱偏重型[16]。濕熱證在多種因素作用下，特別是大腸桿菌作用下，濕偏重型和熱偏重型中醫(yī)辨證血漿淋巴細(xì)胞HSP70水平顯著增加，同時(shí)，熱偏重型血漿淋巴細(xì)胞HSP70增加程度較濕偏重型更為明顯[17]。另一方面，濕熱證患者CD4+、CD4+/CD8+顯著低于正常體檢者，CD8+顯著高于正常體檢者，提示濕熱證形成過(guò)程中，刺激CD8+免疫細(xì)胞產(chǎn)生，抑制CD4+產(chǎn)生，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能處于明顯的抑制狀態(tài)，機(jī)體識(shí)別和殺傷抗原性物質(zhì)功能顯著降低[18]。

結(jié)合本研究結(jié)果顯示，（1）慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者尿液水通道蛋白2明顯高于健康體檢者，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者AQP-2明顯高于康體檢者，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者尿液水通道蛋白2明顯高于慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者，揭示了慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者AQP-2增高幅度最大，其次為慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者，兩者AQP-2水平均明顯高于健康體檢者，因此，AQP-2指標(biāo)可作為慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者較為敏感的量化指標(biāo)。（2）慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者血清HSP70明顯高于健康體檢者，熱偏重證患者血清HSP70明顯高于健康體檢者，慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者血清HSP70明顯高于慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者，揭示了慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者血清HSP70增加幅度最大，其次為慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證患者，兩者血清HSP70均明顯高于健康體檢者，因此，血清HSP70可作為慢性乙型病毒性肝炎熱偏重證患者病情程度較為敏感的量化指標(biāo)。（3）慢性乙型病毒性肝炎濕熱證患者CD4+、CD4+/CD8+明顯降低，CD8+明顯增高，結(jié)合CD4+、CD8+在細(xì)胞免疫功能中的作用，進(jìn)一步證實(shí)了慢性乙型病毒性肝炎濕熱證導(dǎo)致細(xì)胞免疫抑制的病理狀態(tài)。

綜上所述，慢性乙型病毒性肝炎濕熱證存在AQP-2、HSP70和CD8+等指標(biāo)顯著增加現(xiàn)象，同時(shí)存在CD4+、CD4+/CD8+等指標(biāo)顯著降低現(xiàn)象，其中慢性乙型病毒性肝炎濕偏重證者尿液水通道蛋白2增加程度更明顯，熱偏重證者血清HSP70增加程度更明顯。

[1] Yawen Wang，Yiping Li， Na Li，et al.Transbody against hepatitis B virus core protein inhibits hepatitis B virus replication in vitro[J].International Immunopharmacology，2015， 25（2）：363-369.

[2] Sakura Akamatsu C，Nelson Hayes， Masataka Tsuge，et al.Differences in serum microRNA profiles in hepatitis B and C virus infection[J].Journal of Infection， 2015， 70（3）：273-287.

[3]王若飛，李偉，丁天鵬，等.慢性乙型肝炎中醫(yī)證型分布與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)特點(diǎn)[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（9）：2227-2228.

[4]程紅球，黃彩華，黎昌霖，等.慢性乙型肝炎中醫(yī)證型與拉米夫定抗病毒療效及耐藥發(fā)生率的關(guān)系研究[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2014，14（3）：132-134.

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂.病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志，2000，8（6）：324-329.

[6]王永炎.中醫(yī)內(nèi)科學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2001：209-215.

[7] Harkisoen S，Arends J E， Van den Hoek J A R，et al.Historic and current hepatitis B viral DNA and quantitative HBsAg level are not associated with cirrhosis in non-Asian women with chronic hepatitis B[J].International Journal of Infectious Diseases， 2014， 29（2）：133-138.

[8] Toshiaki Takayanagi. Modeling chronic hepatitis B or C virus infection during antiviral therapy using an analogy to enzyme kinetics：longterm viral dynamics without rebound and oscillation[J].Computers in Biology and Medicine， 2013， 43（12）：2021-2027.

[9]羅俊華，曹秋實(shí).HBeAg陰性慢性乙型肝炎中醫(yī)證型與T淋巴細(xì)胞亞群及IL-4、IFN-γ相關(guān)性研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37（4）：1-3，8.

[10]陳丹丹，朱肖鴻，周萍，等.慢性乙型肝炎病理組織纖維化程度與中醫(yī)證型的研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，12（3）：277-279.

[11]郭明星，李曉東，盛國(guó)光，等.輕度慢性乙型肝炎中醫(yī)證候與肝組織病理的相關(guān)性分析[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2014，24（2）：72-74.

[12]劉新海，徐風(fēng)，劉裔紅，等.阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎中醫(yī)證型療效關(guān)系的實(shí)驗(yàn)室研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（8）：960-961.

[13]謝和平，楊宏志，吳偉康，等.HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎病毒攜帶者中醫(yī)證型與HBV DNA的關(guān)系[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（7）：960-962.

[14]陳裕平.慢性乙型病毒性肝炎后肝硬化的中醫(yī)證型分布規(guī)律[J].河北中醫(yī)，2013，35（3）：355-356.

[15]劉慶，凌家艷，李曉東，等.乙型肝炎肝硬化中醫(yī)證型與TANK基因單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2013，23（4）：241-244.

[16]李思思.腎臟水通道蛋白-2在中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)雜志，2014，21（7）：175-177.

[17]郭蕓菲，王濤，徐小潔，等.熱休克蛋白70羧基末端相互作用蛋白（CHIP）對(duì)HER2的降解作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，23（6）：611-613.

[18] 劉肄輝，張永華，劉莉，等.輔助性T淋巴細(xì)胞9/調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞平衡在乙型肝炎病毒感染炎性反應(yīng)中的變化及其意義[J].中華傳染病雜志，2013，31（11）：646-649.