李中文 湯明 鄒彥

大量文獻證實EBV與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)。且同時表明血漿EBV-DNA水平和鼻咽的腫瘤負荷、預(yù)后、腫瘤治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等情況密切相關(guān)[1-2]。同時，有文獻報道血漿EBV-DNA水平在早期和中晚期鼻咽癌患者中存在差異性[3-4]。由于鼻咽癌發(fā)生部位隱蔽，癥狀不明顯，因此中晚期患者居多，作為鼻咽癌診斷和預(yù)后敏感性和特異性均較高的血漿EBV-DNA水平是否在初診中晚期鼻咽癌中存在較大差異，缺少相關(guān)資料。本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技來分析60例中晚期初診鼻咽癌患者血漿EBV-DNA水平在中晚期不同分期的變化情況，進一步證實血漿EBV-DNA水平在不同分期中晚期鼻咽癌診斷中的價值，為以后通過分析血漿EBV-DNA水平來早期判斷患者預(yù)后，以及為進一步中晚期鼻咽的治療包括誘導(dǎo)化療、放療、同期化療等方案的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年12月-2013年5月，遵義醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院收治的Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb+Ⅳc期鼻咽癌患者。納入標(biāo)準：鼻咽組織活檢病理證實為鼻咽非角化型或者角化型鱗狀細胞癌，且根據(jù)UICC第7版2010分期的Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc期鼻咽癌患者。

1.2 方法 標(biāo)本采集采集血液標(biāo)本時間為鼻咽組織活檢病理證實為鼻咽非角化型或者角化型鱗狀細胞癌后1周內(nèi)，放化療開始前。熒光定量PCR引物及探針的設(shè)計血液標(biāo)本離心分離血漿，熒光定量PCR原理，參考文獻[5-6]。本院實驗室德國羅氏公司產(chǎn)定量PCR系統(tǒng)，型號：Light Cycle。PCR反應(yīng)試劑盒來自中山醫(yī)科大學(xué)下屬達安基因診斷中心。上下游引物序列分別為 W-44F（5’-TCTATGACTACAGGCAA-3’）和 W-119R（5’-AGACGGCCTGTCCAACGT-3’）。在PCR反應(yīng)體系中加入雙標(biāo)記的熒光探針，探針序列 為：5’（FAM）CACTATATCTACAGTCCAGCCTCC（TAMRA）-3’。擴增的目的基因是EBV的BamH1-W相關(guān)片段。

1.3 反應(yīng)體系 抽取外周血2 mL，3000 rpm，離心2 min，取白細胞層及血漿1000 μL，13 000 rpm，離心5 min，收集沉淀，純水洗滌3次。上清液2 μL，8000 rpm 8 s。PCR 循環(huán)條件：（1）93 ℃ 2 min；（2）93 ℃45 s→ 55 ℃ 60 s→ 10 循環(huán)；（3）93 ℃ 30 s→ 55 ℃45 s→30循環(huán)。

1.4 血漿游離EBV-DNA含量的計算 計算公式為C=Q×（VDNA/VPCR）×（1/Vext），其中C為血漿DNA拷貝數(shù)值（copies/mL），Q為經(jīng)PCR擴增后計算機檢測的原始拷貝數(shù)值，VPCR是用于PCR擴增的DNA的體積，VDNA為提取的DNA稀釋液體積。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件包進行結(jié)果分析，EBV-DNA拷貝數(shù)及年齡經(jīng)正態(tài)性檢驗后，不滿足正態(tài)分布者用中位數(shù)及四分位間距表示，組間差異采用秩和檢驗，有差異者進一步進行兩兩比較；滿足正態(tài)分布者用（±s）表示，組間差異比較采用方差分析；組間性別比比較采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般情況 共納入患者60例，其中男54例，年齡28~75歲，中位年齡53.6歲；女6例，年齡31~68歲，中位年齡48.5歲。分期患者年齡、性別結(jié)構(gòu)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。本研究納入的鼻咽癌患者EBV-DNA檢出率為100%。

表1 各分期患者年齡與性別組成情況比較

2.2 患者血漿EBV-DNA定量PCR檢測結(jié)果比較 患者血漿EBV-DNA定量PCR檢測結(jié)果，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同分期鼻咽癌患者EBV-DNA拷貝數(shù)比較 ×103 copies/mL

3 討論

鼻咽癌雖然世界許多國家均有發(fā)生，但是大部分地區(qū)發(fā)病率較低。有明顯的區(qū)域性和種族聚集性，亞洲人多見，其中以中國的南方如廣東、廣西、湖南等地區(qū)最高。自O(shè)LD發(fā)現(xiàn)EBV（Epstein-Barr virus，EBV）與鼻咽癌在血清上有一定的關(guān)系以來，鼻咽癌患者EBV及其抗體的研究層出不窮。鼻咽癌的相關(guān)抗體主要是IgA、IgG、IgM，不能客觀、及時、準確的反映病毒的感染情況和復(fù)制情況。即使患者腫瘤完全消失，達到治愈標(biāo)準，其體內(nèi)的相關(guān)抗體消失也有明顯的滯后性，甚至部分患者持續(xù)存在[7]。

鼻咽癌病理表現(xiàn)非角化型或者角化型鱗狀細胞癌占90%以上。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)EBV-DNA是一個可靠、靈敏的指標(biāo)[8-11]。EBV和鼻咽癌的關(guān)系密切，基本上所有的非角化型或者角化型癌都能檢測到EBV-DNA。對于外周血漿的EBV-DNA的檢測方法有很多。其中主要的方法聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的相關(guān)方法，包括PCR的定性、半定量和定量。特別是定量在靈敏度、特異度和準確性方面都有很高的價值，也是目前檢測血漿EBV-DNA最常用的方法。各種外周血漿EBV-DNA的PCR定量檢測不是檢測病毒的完整顆粒，而是對病毒DNA相關(guān)片段的檢測。大量研究發(fā)現(xiàn)，EBV的EBNA-1、EBNA-2、Bam HI-w結(jié)構(gòu)區(qū)域、BXLF-1基因片段是常用的檢測目標(biāo)片段，可以得到相似的陽性結(jié)果[12-14]。同時，不同基因片段間也存在一定的差異性。這其中BamHI-w結(jié)構(gòu)區(qū)域的研究最多，檢測這一片段可以大大的提高檢測的特異度和靈敏度，是臨床上最常用的目的基因片段。其本身為EBV的一段高度保守、高度重復(fù)的堿基序列。個體感染的EBV病毒株的亞型不完全一樣，堿基重復(fù)的次數(shù)也存在差異，一般在10~13次間。

有研究者應(yīng)用RT-PCR方法對80例鼻咽癌患者和80例感染過EBV的健康人群比較鼻咽癌患者外周血漿EBV-DNA陽性率達到90%，而80名感染過EBV的健康對照者外周血漿中并未檢出相關(guān)病毒。這重要發(fā)現(xiàn)表明EBV-DNA來自于感染EBV的腫瘤細胞的凋亡，而不是在血中復(fù)制的結(jié)果。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)原發(fā)部位腫瘤細胞的凋亡值和血漿EBV-DNA呈現(xiàn)獨立的正相關(guān)性（P<0.05）[5]。也有人對100例鼻咽癌患者的外周血漿和原發(fā)部位的EBV的基因差異性進行比較和PCR擴增后的產(chǎn)物進行測序，結(jié)果證實完全吻合。這一發(fā)現(xiàn)同樣也證實外周血EBV-DNA及其片段來自于原發(fā)部位腫瘤的凋亡[15]。大多數(shù)研究者認為，EBV-DNA不是病毒感染后在外周血中的自我復(fù)制和分離，而是腫瘤生長部位的瘤細胞含有病毒顆粒，瘤細胞凋亡后病毒顆粒及其片段被釋放入血[5，13-16]。這一結(jié)論對于EBV-DNA在鼻咽癌診斷、分期、預(yù)后預(yù)測等的價值有著重要作用。因此，普遍認為外周血漿EBV-DNA的水平與原發(fā)部位含有EBV的腫瘤細胞凋亡數(shù)有正相關(guān)性。同時，在細胞凋亡的過程中，細胞本身的脫氧核苷酸酶使病毒顆粒斷裂為80~190 bp間的小片段；而與宏觀的腫瘤侵犯周圍的血管床沒有明顯相關(guān)性。但是就EBV-DNA進入外周血中的具體機制問題，目前還存在很多疑點。對于病毒在外周血中的代謝機制及其轉(zhuǎn)歸情況，目前沒有這方面的資料研究。所以，有學(xué)者推測其釋放入血機制很可能與細胞凋亡水解密切相關(guān)。對于鼻咽癌腫瘤細胞凋亡的相關(guān)研究，將有助于病毒代謝的研究。當(dāng)然對于外周血中EBV-DNA的研究，也有助于原發(fā)腫瘤的診斷、復(fù)發(fā)的判斷等。

總之，外周血漿中EBV-DNA對于鼻咽癌的敏感性和特異性均較高[7-8]。熒光定量PCR技術(shù)不僅具有PCR的高靈敏度特點，同時還具有準確、快速、不容易被污染的特點[4]。為研究血漿EBV-DNA水平提供了可靠、安全、穩(wěn)定的方法。相關(guān)文獻資料表明血漿EBV-DNA水平相對穩(wěn)定，敏感性和特異性均較高。本組的EBV-DNA敏感性為100%。并且大量文獻證實EBV-DNA水平和鼻咽的腫瘤負荷，臨床分期，預(yù)后，腫瘤治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。EBV-DNA復(fù)制量隨著腫瘤負荷的增加，病情的加重而逐漸增加。但是在不同分期中，特別是中晚期鼻咽癌患者血漿EBV-DNA水平是否有差異，未見相關(guān)文獻報道。

本文應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對60例鼻咽癌初治患者在治療前血漿EBV-DNA水平進行定量檢測。數(shù)據(jù)表明治療前Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb+Ⅳc期，EBV-DNA拷貝數(shù)中位數(shù)和范圍存在著明顯差異性。這一結(jié)果證實患者EBV-DNA水平在中晚期不同分期鼻咽癌患者外周血漿中存在明顯差異。從EBV-DNA水平的角度印證了血漿EBV-DNA在鼻咽癌診斷、分期中的價值和地位以及與各期預(yù)后情況相一致，以及和腫瘤負荷的相關(guān)關(guān)系。關(guān)于本組60例初治中晚期鼻咽癌患者，其血漿EBV-DNA均陽性，陽性率達到100%，這可能和樣本量不大有關(guān)。當(dāng)然，也和相關(guān)報道，中晚期鼻咽癌患者外周血血漿EBV-DNA陽性率在90%以上相符合。

需要指出的是，因為目的擴增片段、PCR循環(huán)數(shù)、實驗試劑、探針的大小、具體堿基序列等因素有很大的關(guān)系，各個實驗室的數(shù)據(jù)之間有一定的差異性，但是就單一一個實驗室而言，自身具有客觀的可比性。但各研究機構(gòu)應(yīng)用不同的實驗設(shè)計理念、PCR的試劑和實驗方法、儀器設(shè)備等不同，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)之間存在一定的差異[17]。這樣不利于數(shù)據(jù)之間的比較，分析等。其影響因素主要有兩個方面：（1）存在于外周血漿的游離EBV-DNA的片段大小多在80~190 bp之間。所以，擴增PCR的目的片段也在190 bp以內(nèi)。但是擴增片段的具體大小存在一定的差異。其結(jié)果也會有一定的差異。（2）定量PCR過程中PCR循環(huán)次數(shù)、引物和探針的片段序列及大小，目的基因的堿基序列等設(shè)計不同，對應(yīng)的檢出率和檢測結(jié)果必定存在一定的差異性[14]。因此，有學(xué)者呼吁建立統(tǒng)一的實時定量PCR標(biāo)準品和統(tǒng)一實驗室條件，并制定出國際、國內(nèi)通用的標(biāo)準，以便各個實驗室的檢測結(jié)果有可比性和統(tǒng)一性。最終使血漿EBV-DNA成為一個廣泛應(yīng)用的血液學(xué)相關(guān)指標(biāo)的。這對于現(xiàn)在實驗數(shù)據(jù)的比較，以后實驗方法的改進，都有很大的益處。

總之，中晚期鼻咽癌患者不同分期外周血血漿EBV-DNA水平存在明顯差異性，這一結(jié)論對于將外周血血漿EBV-DNA作為鼻咽癌早期診斷、分期和預(yù)后判斷都有一定價值，對于是否不同分期鼻咽癌患者外周血漿EBV-DNA水平是否有恒定的數(shù)值范圍，還需要實驗相關(guān)條件的統(tǒng)一和大樣本的研究證實。

[1]李宇紅，邵建永，馮惠霞，等.鼻咽癌患者血漿游離EBV-DNA的定量檢測及其臨床意義[J].中國腫瘤臨床，2004，31（8）：421-424.

[2]王雪英.定量檢測血漿EBV-DNA在鼻咽癌診治中的臨床研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，18（12）：5-6.

[3]楊德輝，柳青.鼻咽癌患者血漿游離EBV-DNA檢測的研究現(xiàn)狀[J].中山大學(xué)研究生學(xué)刊，2006，26（1）：112-115.

[4] Leung， Benny Z， Brigete B M， et al.Plasma Epstein-Barr viral deoxyribonucleic acid quantitaqution complements tumor-nodemetastasis staging prognostication in nasopharyngeal carcinoma[J].J Clin Oncol，2006，24（34）：5414-5418.

[5] Mutirangura A， Printhanakasem W， Theamboonlers A， et al.Epstein-Barr viral DNA in serum of patients with nasopharyngeal carcinoma[J].Clin Cancer Res，1998，4（3）：665-669.

[6] Heid C A， Stevens J， Livak K J， et al.Real time quantitative PCR [J].Genome Res，1996，6（28）：986-994.

[7]范國宇，劉偉.血漿EBV-DNA 與VCA-IgA聯(lián)合檢測對鼻咽癌診斷的意義[J].中國實用醫(yī)藥，2012，7（19）：46-47.

[8] Lo Y M， Chan A T， Chan L Y， et al.Moleculor prognostication of nasopharyngeal carcinoma by quantitative analysis of circulation Epstein-Barr virus DNA[J].Cancer Res，2000，60（24）：6878-6881.

[9]黃爽，管西寅，應(yīng)紅梅.血漿EB病毒DNA檢測在鼻咽癌中的應(yīng)用進展[J].中國癌癥雜志，2012，22（3）：227-231.

[10] Baizig N M， Morand P， Seigneurin J M， et al.Complementary determination of Epstein-Barr virus DNA load and serum markers for nasopharyngeal carcinoma screening and early detection in individuals at risk in Tunisia[J].Eur Arch Oto-Rhinol，2012，269（3）：1005-1011.

[11]馬美，杜曉東.PET-CT聯(lián)合EBV-DNA在預(yù)測鼻咽癌復(fù)發(fā)中的研究[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2013，20（1）：21-23.

[12]吳少雄，趙充，崔念基，等.誘導(dǎo)化療在局部晚期鼻咽癌放射治療中的價值[J].腫瘤防治雜志，2004，11（12）：1289-1292.

[13] Shotelersuk C， Khorpraset C， Sakdikul S， et al.Epstein-Barr virus DNA in serum/plasma as a tumor marker for nasopharyngeal carcinoma [J].Clin Cancer Res，2000，82（6）：1046-1051.

[14] Lo Y M， Chan L Y.Quantitative and temporal correlation between circulation cell free Epstein-Barr virus DNA and tumor recurrence in nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer Res，1999，59（21）：5452-5455.

[15] Lin J C， Wang W Y， Chen K Y， et al.Quantification of plasma Epstein-Barr virus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma[J].N Engl J Med，2004，350（24）：2461-2470.

[16]王巍巍，黃大毛，王雷，等.血漿EB病毒DNA數(shù)量與鼻咽癌細胞凋亡的相關(guān)性分析[J].實用癌癥雜志，2011，26（1）：4-6.

[17] Hayden R T， Hokanson K M， Pounds S B， et al.Multicenter comparison of different real-time PCR assays for quantitative detection of Epstein-Barr virus[J].Clin Microbiol，2008，46（1）：157-163.