張三軍

目前胰腺癌的發(fā)病率占人類全身腫瘤的1%~3%，在消化道腫瘤中的比例為8%~10%[1]。胰腺癌明確診斷時(shí)多已是進(jìn)展期，未做治療的胰腺癌中位生存期為3~4個(gè)月[2]。目前手術(shù)是根治胰腺癌的唯一方法，但胰腺癌手術(shù)切除率僅5%~15%，且根治術(shù)后5年生存率仍低于5%[3]。因此在當(dāng)前條件下，化療對(duì)于改善進(jìn)展期胰腺癌患者的生活質(zhì)量，以及延長患者生存期起到非常重要的作用，吉西他濱作為當(dāng)前治療進(jìn)展期胰腺癌的首選化療藥物，但吉西他濱單獨(dú)治療胰腺癌的效果也不甚理想，主要原因主要在于胰腺癌細(xì)胞獲得性或內(nèi)在的耐藥性[4-5]。

NF-κB為一種快反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，與人類多種疾病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系[6]。在胰腺等組織細(xì)胞癌變的過程中也起到重要作用。NF-κB通常與其抑制蛋白IκB結(jié)合成無活性的三聚體存留于胞質(zhì)，當(dāng)IκB磷酸化而降解后，NF-κB激活并入核與相應(yīng)靶基因結(jié)合，特別是RelA（p65）亞基可反式激活很多基因，如細(xì)胞周期素D1、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、多藥耐藥基因（MDR）等，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡抵抗、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和耐藥等生物學(xué)行為[7-11]。而傳統(tǒng)化療藥物如吉西他濱和依托泊苷等能激活腫瘤細(xì)胞的NF-κB[10-12]，進(jìn)而引起胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥。另外有研究表明姜黃素和百里醌等療法能下調(diào)胰腺癌細(xì)胞活性NF-κB水平，而姜黃素或百里醌在聯(lián)合吉西他濱治療胰腺癌時(shí)能顯著增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，從而一定程度上逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞的耐藥性[10-11]。因此，NF-κB在促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生存和抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，抑制NF-κB能有效殺滅胰腺癌細(xì)胞。

本研究通過Bay 11-7082抑制IκB磷酸化而阻斷NF-κB通路，觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長和凋亡的影響，并初步探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 NF-κB抑制劑Bay 11-7082、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；胰蛋白酶、胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物發(fā)展有限公司；Bax抗體購自美國Epitomics公司；caspase-3抗體購自美國Abcam公司。

1.2 藥物配制 NF-κB抑制劑Bay 11-7082用DMSO配成30 μmol/L，-20 ℃冰箱保存（DMSO的終濃度小于0.1%）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購自ATCC，培養(yǎng)在含l5%胎牛血清、質(zhì)量濃度1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L谷氨酰胺和1.5 g/L碳酸氫鈉的Ham’ s F-12K培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)條件為37 ℃、5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞單層貼壁生長至70%~80%融合時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取1 mL濃度為5×104/mL的SW1990細(xì)胞懸液接種于載玻片上，待細(xì)胞過夜貼壁后，第2天更換培養(yǎng)液，加入不同濃度Bay 11-7082（2.5 μmol/L、5 μmol/L和 10 μmol/L）培養(yǎng) 2 h，光學(xué)顯微鏡下觀察。及甲醛固定后，DAPI染色5 min，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）的Bay 11-7082培養(yǎng)2 h，PBS洗脫后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照調(diào)零，以及陰性對(duì)照組（細(xì)胞中僅加入等量的0.1% DMSO溶液）。藥物作用結(jié)束前1 h，各孔加入CCK-8 0.01 mL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，放置于酶標(biāo)儀處測(cè)A450值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白調(diào)零OD值）/（對(duì)照組OD值-空白調(diào)零OD值）×100%。1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取1 mL濃度為5×105/mL的SW1990細(xì)胞懸液于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至90%融合后，分別加入不同濃度（2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）的Bay 11-7082培養(yǎng)2 h，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，先加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后，再加入5 μL碘化丙啶（PI），在室溫下避光反應(yīng)15 min，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 Western blot法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞中caspase-3和Bax表達(dá) 收集處于對(duì)數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞，Bay 11-7082處理同上，裂解細(xì)胞并分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，用Bradford法測(cè)量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（20 μg/孔），常規(guī)8% SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入特異性一抗（1∶1000）于4 ℃下孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體（1：2500）室溫孵育1 h，ECL顯色，條帶曝光強(qiáng)度用Quantity One 4.6.2（BIO， RAD）軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，正態(tài)分布變量多組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)改變 光學(xué)顯微鏡下胰腺癌細(xì)胞SW1990經(jīng)不同濃度Bay 11-7082處理過后，在倒置顯微鏡下觀察到貼壁的正常胰腺癌細(xì)胞數(shù)逐漸減少，細(xì)胞間距變大，部分細(xì)胞體積縮小，脫落漂浮的細(xì)胞增多。細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后，在熒光顯微鏡下觀察到Bay 11-7082處理后細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、染色體凝集和出現(xiàn)凋亡小體等典型凋亡特征性改變，以高濃度Bay 11-70829（10 μmol/L）作用效果最為顯著。表明Bay 11-70829可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株SW1990凋亡。

2.2 Bay 11-7082對(duì)SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用 Bay 11-7082對(duì)SW1990細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，2.5 μmol/L、5 μmol/L和 10 μmol/L Bay 11-7082作用SW1990細(xì)胞2 h后正常培養(yǎng)24 h，細(xì)胞存活率分別為（72.8±11.05）%、（65.1±13.26）%和（55.8±14.55）%；用藥組OD值均明顯低于空自對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 Bay 11-7082對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡的影響 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，見圖2，2.5 μmol/L、5 μmol/L和 10 μmol/L Bay 11-7082 作用 SW1990細(xì)胞2 h后正常培養(yǎng)24 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，對(duì)照組僅產(chǎn)生0.4%~1.0%的早期凋亡細(xì)胞，2.5 μM、5 μM 和 10 μM Bay 11-7082 組分別誘導(dǎo)（6.7±1.44）%、（10.1±2.37）%和（17.2±2.46）%的細(xì)胞發(fā)生早期凋亡，呈濃度依賴性，與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 Bay 11-7082對(duì)SW1990細(xì)胞中caspase-3和Bax表達(dá)的影響 Western印跡表明在胰腺癌SW1990細(xì)胞中，NF-κB抑制劑Bay 11-7082可激活人胰腺癌SW1990細(xì)胞中caspase-3以及上調(diào)Bax的表達(dá)，呈一定的濃度依賴性。

圖1 人胰腺癌SW1990細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖2 不同濃度Bay 11-7082對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡率的影響

圖3 Bay 11-7082對(duì)SW1990細(xì)胞中caspase-3和Bax蛋白表達(dá)的影響

3 討論

Wang等[13]首次對(duì)NF-κB在胰腺癌中的表達(dá)進(jìn)行研究中發(fā)現(xiàn)，11種胰腺癌細(xì)胞系中有9種細(xì)胞系中NF-κB曾持續(xù)激活狀態(tài)，而在正常胰腺組織中未見明顯NF-κB激活表達(dá)；在胰腺癌動(dòng)物模型中NF-κB也呈持續(xù)激活狀態(tài)[10-12]；Dong[14]和Patel[15]研究發(fā)現(xiàn)，激活后的NF-κB可對(duì)抗細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的耐受，引起腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥。因此，下調(diào)NF-κB對(duì)胰腺癌細(xì)胞有一定的增殖抑制作用。Kuo[16]報(bào)道NF-κB抑制劑PDTC能增強(qiáng)凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用；Arlt[17]報(bào)道NF-κB抑制劑sulfasalazine可增強(qiáng)人胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性；García[18]報(bào)道NF-κB抑制劑Bay 11-7082能誘導(dǎo)多重耐藥白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究中發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑Bay 11-7082能對(duì)人胰腺癌SW1990細(xì)胞產(chǎn)生一定的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，在一定范圍內(nèi)隨著Bay 11-7082濃度的增大，對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長的抑制作用越來越明顯，同時(shí)也誘導(dǎo)更多細(xì)胞發(fā)生凋亡。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果和FCM檢測(cè)結(jié)果較一致，表明Bay 11-7082對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長的影響主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式為主，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，激活的NF-κB進(jìn)入核內(nèi)，促使Bcl-2家族蛋白成員中Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bcl-2可阻止細(xì)胞通過線粒體通道發(fā)生凋亡；而另一Bcl-2家族蛋白成員-Bax可對(duì)抗凋亡抑制蛋白Bcl-2的作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[19]；而caspase蛋白酶在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵的作用[20]，caspase蛋白酶在正常細(xì)胞中以非活化形式存在[21]，caspase-3作為細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末效應(yīng)酶，在級(jí)聯(lián)效應(yīng)中被caspase-8和9等激活[22]，活化的caspase-3裂解聚合酶PARP和D4-GDI蛋白[23]，從而觸發(fā)凋亡發(fā)生。Banerjee[10]報(bào)道百里醌不僅能下調(diào)NF-κB，還能活化caspase-3以及上調(diào)Bax水平從而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，還有報(bào)道caspase抑制劑能有效抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究中western印跡表明NF-κB抑制劑Bay 11-7082能激活胰腺癌SW1990細(xì)胞caspase-3和上調(diào)Bax水平，呈一定的濃度依賴性，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。因此，筆者認(rèn)為，NF-κB抑制劑Bay 11-7082可能部分通過活化caspase-3和上調(diào)Bax水平從而誘導(dǎo)胰腺癌SW1990細(xì)胞發(fā)生凋亡。

總之，本研究結(jié)果顯示應(yīng)用NF-κB抑制劑Bay 11-7082可以有效抑制人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其部分機(jī)制可能是通過活化Caspase-3和上調(diào)Bax表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。

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