王昌亮 王禮泉 林明臻 孫香蓮 翟升永

長鏈非編碼RNA（large intervening non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分子，他們本身并不編碼蛋白質(zhì)，而常以RNA的形式調(diào)控基因的表達(dá)，包括表觀遺傳學(xué)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等[1-2]。最初研究認(rèn)為lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物[3]，然而近年來的研究提示其生物學(xué)功能廣泛且參與多種重要的調(diào)控過程如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活以及核內(nèi)運輸?shù)鹊?。HOTAIR是lncRNA的成員之一，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4-5]，其在乳腺癌中的研究限于對某些蛋白的表達(dá)調(diào)控[6]。本實驗研究探索HOTAIR在乳腺癌組織及前哨淋巴結(jié)中的表達(dá)情況，為乳腺腫瘤的基因治療提供新策略。結(jié)合臨床病理資料分析，指導(dǎo)治療及預(yù)測預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 實驗對象入組標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)本來源

1.1.1 實驗對象入組標(biāo)準(zhǔn) 所有入組患者均簽署知情同意書，實驗研究符合倫理學(xué)原則。收集濰坊市人民醫(yī)院乳腺外科2013年6-年12月住院患者，行乳房手術(shù)+前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)，術(shù)前穿刺病理診斷為乳腺浸潤性癌，取乳腺癌組織、癌旁組織，癌旁組織選取乳腺非同一象限經(jīng)病理證實為正常乳腺組織。前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node，SLN）探測儀結(jié)合亞甲藍(lán)染料檢出SLN≥2枚且術(shù)中冰凍病理示SLN有轉(zhuǎn)移的患者入組，進而行常規(guī)腋窩淋巴結(jié)（Axillary lymph node，ALN）清掃。標(biāo)本來源均為女性，年齡32~51歲，平均42.2歲。術(shù)后常規(guī)病理證實為浸潤性導(dǎo)管癌，SLN轉(zhuǎn)移數(shù)目不少于2枚，ALN轉(zhuǎn)移率低于100%，獲得SLN（+）組10例，ALN（-）組10例，乳腺癌組織組10例，癌旁組織組10例。記錄患者年齡、前哨淋巴結(jié)（SLN）數(shù)目、腋窩淋巴結(jié)（ALN）數(shù)目、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、C-erbB-2、P53以及ki-67。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)分組采用N1、N2、N3（無N0患者）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率（10%，10%~50%，50%）；ki-67表達(dá)（14%，14%~75%，75%）。

1.1.2 標(biāo)本處理及保存 取前哨淋巴結(jié)，縱向等大剖開，一半冰凍檢查，另一半RNAlater solution（購自AMBION公司）保存，留作提取RNA使用。冰凍檢查示有癌組織轉(zhuǎn)移，則另一半繼續(xù)進行實驗操作。腋窩淋巴結(jié)組取未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，剖開保存。癌組織、癌旁組織相同實驗處理。所有標(biāo)本均為新鮮標(biāo)本，簡單切碎組織樣本，任何一邊的最大厚度不超過0.5 cm，RNAlater液5倍于組織碎塊并完全浸沒，-80 ℃長期保存。入組病例臨床病理資料見表1。

表1 入組患者臨床病理資料

1.2 總RNA提取及質(zhì)量判斷

1.2.1 總RNA提取 異硫氰酸胍-苯酚（Trizol， 購自INVITROGEN公司）法提取總RNA：裂解細(xì)胞獲得核酸，利用DNA和RNA在特定pH時溶解度不同，通過有機溶劑抽提沉淀RNA。-80 ℃冰箱保存組織樣本室溫下解凍，組織塊放入處理好的EP管稱重，一次提取的組織塊重量在0.05~0.1 g之間，并做好記錄。進行RNA提取，并防止DNA污染。

1.2.2 RNA質(zhì)量判斷 分光光度儀進行RNA定量，計算OD260/OD280比值，范圍在1.8~2.0為滿意純度。記錄RNA濃度，總體RNA濃度范圍（2.1946±0.7765）μg/μL。RNA電泳符合標(biāo)準(zhǔn)即：有清晰地18S、28S條帶，RNA無降解，且肉眼觀察28S條帶亮度是18S條帶亮度的1~2倍，進行RNA逆轉(zhuǎn)錄。

1.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄、lncRNA-HOTAIR的實時熒光定量

1.3.1 實時熒光定量反應(yīng)試劑及引物準(zhǔn)備 HOTAIR序 列：（Forward）GGGGCTTCCTTGCTCTTCTTATC；（Reverse）GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC，β-ACTIN（內(nèi)參）序列：（Forward）CCTGTACGCCAACACAGTGC；（Reverse）ATACTCCTGCTTGCTGATCC。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、熒光定量PCR試劑盒以及引物序列均購自INVITROGEN公司。使用美國ABI公司的實時熒光定量儀：ABI-7500HT。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量反應(yīng) （1）采用INVITROGEN公司的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（5×RT Reaction Buffer、Enzymes mix、Rnase-free ddH2O），低溫解凍，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液振蕩混勻后離心，加模板RNA到混合液中混勻，離心收集管壁殘留液體，42 ℃水浴反應(yīng)1小時95 ℃水浴5分鐘完成逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4℃保存進行RT-PCR。（2）使用INVITROGEN公司的熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green master mix、PCR primer mix、ROX Reference Dye），進行熒光定量，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，監(jiān)測PCR產(chǎn)物量的變化，得到模板RNA逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴增曲線圖三個階段：基線期、對數(shù)期和平臺期。對熒光曲線的指數(shù)擴增階段進行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用美國ABI公司SDS 1.4軟件處理實驗結(jié)果。統(tǒng)計學(xué)分析采用t檢驗、Spearman等級相關(guān)分析等進行處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量檢測長鏈非編碼RNA-HOTAIR在各組中的表達(dá)情況。待測HOTAIR量通過軟件計算以-△△CT表示相對表達(dá)量。各組中HOTAIR表達(dá)情況見表2。

表2 HOTAIR在各組中的相對表達(dá)量

2.2 前哨淋巴結(jié)（SLN）中HOTAIR表達(dá)情況與患者臨床病理指標(biāo)關(guān)系分析 分析實時熒光定量結(jié)果與臨床病理指標(biāo)關(guān)系提示：HOTAIR與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率存在相關(guān)性，表現(xiàn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，HOTAIR表達(dá)升高（相關(guān)系數(shù)r=0.65；P=0.03）；另外ki-67蛋白高表達(dá)癌組織，對應(yīng)SLN中HOTAIR表達(dá)量越高，呈直線相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=0.80；P<0.01）。而HOTAIR表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、年齡、ER、PR、C-erbB-2以及P53無明顯相關(guān)性。資料見表3。

表3 SLN中HOTAIR表達(dá)情況與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

3 討論

長鏈非編碼RNA HOTAIR是HoxC基因簇的一條反義鏈，是一個長度為2.2 kb的基因，定位在哺乳動物12q13.13上HOXC位點，不編碼任何蛋白質(zhì)。目前HOTAIR被人們所認(rèn)識的作用機制是特異性結(jié)合多梳抑制復(fù)合體2（PRC2），HOTAIR可至少連接兩個不同的組蛋白修飾復(fù)合物，從而充當(dāng)一個腳手架的作用，如其5’端區(qū)連接PRC2 復(fù)合物，負(fù)責(zé)H3K27 的甲基化；3’區(qū)連接LSD1（組蛋白賴氨酸去甲基化酶）介導(dǎo)H3K4me2 的去甲基化。抑制相關(guān)基因的表達(dá)，使得染色體特定區(qū)域發(fā)生甲基化，引發(fā)異染色質(zhì)形成或基因沉默而致病[7]。研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR通過在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中調(diào)控Snail蛋白的表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡作用顯著[6，8]。越來越多的LncRNA被證明在細(xì)胞水平和分子遺傳學(xué)水平具有相應(yīng)的功能，包括劑量補償效應(yīng)、參與基因組印記過程、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞分化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完善、細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運輸、干細(xì)胞的程序再編以及熱休克反應(yīng)，作為微小RNA（miRNA）的前體等[9]。LncRNA的這些作用已引起人們的廣泛關(guān)注，其中既有順式調(diào)控作用，又有反式調(diào)控作用的HOTAIR在癌癥中異常表達(dá)，已成為癌癥方面非編碼RNA研究的一個新的熱點，但作用機制尚不十分清楚[10]。

本實驗研究中，HOTAIR在前哨淋巴結(jié)組以及癌組織組中表達(dá)量異常升高，提示HOTAIR在惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展方面關(guān)系密切。

Gupta等[9，11-13]研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)顯著升高，并認(rèn)為HOTAIR是預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要指標(biāo)。本實驗研究中前哨淋巴結(jié)HOTAIR異常高表達(dá)，提示其作為乳腺癌基因治療新靶點的可行性。可為前哨淋巴結(jié)陽性患者，術(shù)后輔助化療同時，給予基因靶向治療。臨床病理資料分析顯示HOTAIR在影響患者術(shù)后治療方案選擇、預(yù)測預(yù)后有一定作用。HOTAIR表達(dá)量與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率有相同的變化趨勢，表現(xiàn)為ALN%越高，HOTAIR表達(dá)量增加。ki-67反應(yīng)惡性腫瘤增殖活性大小。乳腺癌中ki-67也作為預(yù)后指標(biāo)之一，ki-67陽性表達(dá)越高，預(yù)示細(xì)胞增殖活躍，侵襲轉(zhuǎn)移幾率高，預(yù)后差[14]。實驗中HOTAIR基因與ki-67蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與文獻報道相似[15]。但其他臨床病理指標(biāo)未顯示明顯相關(guān)，需擴大樣本量進一步研究。

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