蔣晨鳳，楊大偉*，高曉婷

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

檳榔（Areca catechuLinnaeus）屬棕櫚科（Arecaceae）檳榔亞科（Arecoideae）檳榔族（Arecinae）檳榔屬（Areca）[1]，2011年中國海南檳榔種植面積達79 232 hm2[2]。它是我國四大南藥之一，具有抗氧化、抗菌、抗抑郁、抗老化等生理活性，而這些生理活性均與檳榔多酚有關(guān)[3-6]。植物多酚因其生理功能的多樣性，已經(jīng)成為人們研究的熱點內(nèi)容，目前，植物多酚的提取普遍是通過綜合多種因素以獲得最佳條件，然而因素越多，各因素以及因素之間的相互作用對試驗結(jié)果的影響越復(fù)雜，最佳提取條件越難獲得。本研究運用錯流浸提工藝?yán)碚撝苯釉O(shè)計和推導(dǎo)出料液比與提取次數(shù)，減少了實驗因素，降低了試驗的復(fù)雜性，研究檳榔多酚的最佳提取條件，為檳榔多酚和植物多酚的提取研究提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煙熏檳榔果（去核粉碎過40目篩）：由湖南賓之郎食品有限公司提供。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：中國藥品生物制品檢定所；甲醇、丙酮、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、硫酸鋰、液溴、濃鹽酸、碳酸鈉均為分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177中藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；CP214電子分析天平：上海豪斯儀器有限公司；B-260恒溫水浴鍋：上?；莺ｋ娖髟O(shè)備有限公司；TGL-16臺式電動離心機：常州市華普達教學(xué)儀器有限公司；722s可見分光光度計：湖南省計量檢測研究所；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 檳榔總酚含量的測定

（1）測定波長的選擇

分別取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，檳榔酚提取液0.5 mL，加入2.0 mL Folin-酚試劑[8]并充分搖勻，1 min后加入10 mL 10%的碳酸鈉溶液，并定容至50 mL，室溫靜置1 h后，以空白為對照，用紫外可見分光光度計在400～900 nm范圍內(nèi)進行波長掃描，根據(jù)呈色化合物的吸收曲線選擇測定波長。

（2）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻[7]繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）檳榔總酚含量的計算

準(zhǔn)確吸取200 μL檳榔提取液于50 mL容量瓶中，加入2.0 mL Folin-酚試劑并充分搖勻，1 min后加入10 mL 10%的碳酸鈉溶液，定容，室溫靜置1 h后于最大吸收波長下測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算總酚含量。總酚含量計算公式如下：

式中：Y為總酚含量，mg/g；A為吸光度值；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；N為稀釋倍數(shù)；V為溶劑體積，mL；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；M為檳榔粉末質(zhì)量，g。

1.3.2 提取溶劑的選擇

（1）不同體積分?jǐn)?shù)甲醇提取劑對檳榔總酚含量的影響

精確稱取1.00 g 檳榔煙果粉末于50 mL帶塞試管中，分別加入25 mL體積分?jǐn)?shù)分別為0、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇溶液，在40 ℃提取1 h，過濾后測定其總酚含量。每個水平重復(fù)3次。

（2）不同體積分?jǐn)?shù)丙酮提取劑對檳榔總酚含量的影響

精確稱取1.00 g 檳榔煙果粉末于50 mL帶塞試管中，分別加入25 mL丙酮體積分?jǐn)?shù)分別為0、20%、40%、60%、80%、100%的溶液，在40 ℃提取1 h，過濾后測定其總酚含量。每個水平重復(fù)3次。

（3）不同比例混合溶液（甲醇：丙酮：水）提取劑對檳榔總酚含量的影響

精確稱取1.00 g 檳榔煙果粉末于50 mL帶塞試管中，分別加入25 mL混合溶劑，甲醇∶丙酮∶水的體積比分別為1∶1∶3、1∶2∶2、1∶3∶1、2∶1∶2、3∶1∶1、1∶1∶1，在40 ℃提取1 h，過濾后測定其總酚含量。每個水平重復(fù)3次。

1.3.3 多級錯流浸取級數(shù)及料液比的設(shè)計

采用解析法推導(dǎo)錯流浸取理論級數(shù)[9]。通過實際操作確定底流量，設(shè)定殘留率，推導(dǎo)并計算不同料液比條件下的錯流浸取理論級數(shù)。浸提級數(shù)的計算如下：

式中：R為殘留率，%；a為溢流底流比；a1為第一級溢流底流比；n為浸取級數(shù)；V1為第一級溢流體積，mL；V0為單級加入的溶劑體積，mL；L為底流液體積，mL。

1.3.4 正交試驗優(yōu)化檳榔總酚提取條件

選定最佳提取溶劑、料液比以及浸取級數(shù)，在此條件下進行時間（40 min、60 min、80 min、100 min、120 min）、溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）和pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）3個單因素分析。在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以總酚得率為指標(biāo)，用L9（34）設(shè)計進行正交試驗優(yōu)化提取條件[10]，因素與水平見表1。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

按照1.3.1的方法，測定沒食子酸及檳榔提取液最大吸收波長，繪制出的吸收曲線分別如圖1和圖2所示。

圖1 沒食子酸溶液吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of gallic acid solution

圖2 檳榔提取液吸收光譜Fig.2 Absorption spectrum of A.catechu extract

由圖1可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)顯色后的最大吸收波長在765 nm。4種曲線分別代表提取溶劑為純丙酮、蒸餾水、純甲醇和混合溶劑（甲醇∶丙酮∶水=1∶2∶2，V/V）條件下檳榔酚提取液的吸收曲線見圖2。由圖2可知，4種溶劑提取條件下的檳榔酚提取液經(jīng)顯色后的最大吸收波長均在765 nm左右，與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液基本一致，因此選擇765 nm作為測定波長。

2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照1.3.1的方法在765 nm波長下測定吸光度值，以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.094 0x+0.028 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，表明沒食子酸質(zhì)量濃度在0～6.24 mg/L范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

圖3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of gallic acid

2.3 提取溶劑的選擇

2.3.1 不同溶劑及其濃度對檳榔總酚提取率的影響

不同溶劑及其體積分?jǐn)?shù)對檳榔總酚提取率的影響如圖4所示。

圖4 不同溶劑及其濃度對總酚提取率的影響Fig.4 Effect of different solvent and concentration on extraction rate of total polyphenols

由圖4可知，水和兩種純?nèi)軇┨崛壚瓶偡拥奶崛÷示^低，其中純丙酮提取總酚效果最差，而兩種有機溶劑在與水的復(fù)合體系下總酚提取率較高。這可能是因為多酚常與蛋白質(zhì)、多糖以及多酚分子間以氫鍵和疏水鍵形式形成穩(wěn)定的分子復(fù)合物，水是多酚的良溶劑，而有機溶劑具有氫鍵斷裂作用，因此有機溶劑與水的復(fù)合體系最適合多酚的提取[11]。結(jié)果表明，丙酮/水溶劑體系比甲醇/水溶劑體系提取率好，體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇與體積分?jǐn)?shù)為60%丙酮分別在各溶劑體系中提取率較高，其中體積分?jǐn)?shù)為60%丙酮提取率最佳，當(dāng)丙酮體積分?jǐn)?shù)＞60%時，多酚提取率呈下降趨勢，原因可能是當(dāng)有機溶劑濃度達到一定程度，色素等親脂性強的成分溶出，同時組織通透性下降，導(dǎo)致總酚得率下降[12]。因此，單一溶劑提取檳榔總酚，體積分?jǐn)?shù)為60%丙酮為宜。

2.3.2 混合溶劑對檳榔總酚提取率的影響

不同體積比的甲醇/丙酮/水混合溶劑對檳榔總酚提取率的影響如圖5所示。

圖5 混合溶劑比例對總酚提取率的影響Fig.5 Effect of mixed solvent ratio on extraction rate of total polyphenols

由圖5可知，總酚提取率隨混合溶劑中有機溶劑比例的增加呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)甲醇∶丙酮∶水的體積比為1∶2∶2時總酚提取率最高，此比例混合溶劑中有機溶劑所占比例為60%，其中甲醇占20%，丙酮占40%，而同樣占60%有機溶劑的混合溶劑（2∶1∶2）其提取率相對較低，可見丙酮比甲醇提取總酚能力更高，這也與2.3.1所得結(jié)果相符，此外，甲醇∶丙酮∶水的體積比為1∶1∶1時，總酚提取率不及體積比1∶2∶2，這可能也與有機溶劑所占比例有關(guān)。混合溶劑提取相比于溶劑/水體系提取效率更高，因此，選擇甲醇∶丙酮∶水體積比為1∶2∶2的混合溶劑作為最佳提取溶劑。

2.4 多級錯流浸取級數(shù)及料液比

設(shè)定殘留率為5%，即殘渣排走的總酚量與原料所含總酚量之比為5%，此時可視為總酚基本提取完全，通過試驗確定當(dāng)檳榔粉末質(zhì)量為1.00 g時各浸取級排出的底流液為3 mL，利用公式計算出不同料液比條件下的錯流浸取理論級數(shù)如表2所示。從實際操作方便性與經(jīng)濟效益等方面綜合考慮，宜選用料液比為1∶20（g∶mL），浸取級數(shù)為2，通過驗證試驗得出在該料液比與浸取級數(shù)條件下其殘留率為4.94%，符合實驗所需條件。

表2 多級錯流浸取級數(shù)Table 2 Stages of multilevel cross-flow extraction

2.5 提取時間對檳榔總酚提取率的影響

圖6 提取時間對總酚提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction rate of total polyphenols

以甲醇∶丙酮∶水=1∶2∶2的混合溶劑為提取劑，料液比1∶20（g∶mL），溫度60 ℃，浸提級數(shù)2的條件下，分別提取不同時間，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在100 min內(nèi)隨時間的增加，檳榔總酚提取率顯著增加，100 min時提取率達到最大（30.14 mg/g），隨后總酚提取率隨時間增加而緩慢降低。這是因為在較高的溫度下，隨著時間的延長，多酚被逐步氧化，在實際工業(yè)生產(chǎn)中，提取時間太長會延長生產(chǎn)周期，從而增加生產(chǎn)成本，提取時間太短則使多酚提取不完全導(dǎo)致提取率低[13]。因此，提取時間選擇100 min為宜。

2.6 提取溫度對檳榔總酚提取率的影響

圖7 提取溫度對總酚提取率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on extraction rate of total polyphenols

以甲醇∶丙酮∶水=1∶2∶2的混合溶劑為提取劑，料液比1∶20（g∶mL），時間100 min，浸提級數(shù)2的條件下，分別在不同溫度下提取，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，在50～70 ℃，隨著溫度的增加，檳榔總酚提取率迅速增加，在溫度70 ℃時提取率達到最大（31.75 mg/g），而后隨溫度增加其總酚提取率變化不明顯，原因可能是增加溫度可軟化植物組織，加速分子間的運動，從而促進多酚類物質(zhì)從植物細胞中溶出[14]。溫度過高，多酚被氧化而遭到破壞，甚至使含量降低[15]，因此，提取溫度選擇70 ℃為宜。

2.7 pH值對檳榔總酚提取率的影響

圖8 pH值對總酚提取率的影響Fig.8 Effect of pH on extraction rate of total polyphenols

以甲醇∶丙酮∶水=1∶2∶2的混合溶劑為提取劑，料液比1∶20（g∶mL），時間100 min，溫度70 ℃，浸提級數(shù)2的條件下，分別在不同pH值下提取，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，pH值為4.0時，總酚提取率達到最大（33.60 mg/g），繼續(xù)增大pH值，總酚提取率降低，當(dāng)pH＜3.0，隨著pH值的降低，總酚提取率反而增大，且提取液顏色逐漸變深，原因可能是提取液中的單寧等聚合態(tài)多酚在低pH值條件下發(fā)生降解，因此多酚提取時，提取液的pH值不能＜3.0[16]，因此，提取劑pH值調(diào)節(jié)為4.0為宜。

2.8 提取條件優(yōu)化正交試驗

為了得到最佳提取工藝條件，對影響因素及參數(shù)進一步優(yōu)化，根據(jù)以上試驗結(jié)果，設(shè)計了3因素3水平的正交試驗，結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

由表3可知，因素的主次順序為C＞B＞A，即pH值＞溫度＞時間。最優(yōu)組合為A2B3C2，即提取條件為時間100 min，溫度70 ℃，pH 4.0。在此最佳條件下進行驗證試驗，多酚提取率為34.46 mg/g。

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，因素C對檳榔總酚提取率影響極顯著（P＜0.01），因素B對檳榔總酚提取率影響顯著（P＜0.05），而因素A對檳榔總酚提取率影響不顯著。

3 結(jié)論

在因素最少化條件下，為探討檳榔多酚提取最佳條件，通過多級錯流浸取工藝?yán)碚撛O(shè)計提取次數(shù)與料液比并進行實驗驗證，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，得到最佳提取條件為：混合溶劑（甲醇∶丙酮∶水=1∶2∶2）為提取劑，料液比1∶20（g∶mL），浸提級數(shù)2，pH 4.0，溫度70 ℃，時間100 min。在此最佳提取條件下，檳榔總酚的提取率為34.46 mg/g。該法不但提取率高，而且可以縮短提取時間，降低能耗，為植物功能成分的提取提供有益的借鑒。

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