周連玉，云成玉，米 琴，喬 楓

（青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008）

硒脅迫對黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長的影響及對中華羊茅的化感作用

周連玉，云成玉，米 琴，喬 楓

（青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008）

通過液體和固體培養(yǎng)方式研究硒對黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens）生長的影響及其發(fā)酵液對中華羊茅（Festuca sinensis）種子萌發(fā)特性的化感作用。結(jié)果表明：與無硒培養(yǎng)基相比，濃度為1．0 mmol·L-1～8．0 mmol·L-1亞硒酸鈉對菌落直徑和菌絲體生物量具有顯著抑制作用（P＜0．05）。黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長指標(biāo)的化感作用表現(xiàn)在稀釋倍數(shù)越小，抑制作用越大；對幼苗不同生長指標(biāo)的抑制作用由高至低依次為根長、苗長、苗鮮重、根鮮重；各生長指標(biāo)之間存在顯著的正相關(guān)性。

黃綠蜜環(huán)菌；硒；菌絲生長；化感作用

黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens） 是一種大型真菌，在青海主要生長在海拔3 000 m～4 300 m的草甸上，大多分布于海北（祁連、海晏、剛察）、黃南（澤庫、河南）、海南（共和、貴德、興海）、果洛（瑪沁、甘德、久治） 及高海拔的玉樹地區(qū)。此外，四川、西藏、河北、陜西、甘肅等省區(qū)也有分布[1]。其研究多集中于生理生態(tài)特性、生物學(xué)特征、人工培養(yǎng)、化學(xué)成分分析、分子鑒定等[2-11]。有研究報(bào)道黃綠蜜環(huán)菌蘑菇圈生長能明顯增加植物群落的物種多樣性及物種豐富度[2-5]。

硒（Se） 是維持人和動(dòng)物正常生理功能的必需微量元素[12]，人和動(dòng)物缺硒會引起多種疾病。無機(jī)硒在體內(nèi)不易吸收且毒性強(qiáng)，只有通過生物作用使施加的外源無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為易被體內(nèi)吸收利用的有機(jī)硒。諸多微生物如細(xì)菌、真菌具有富集硒的能力[13-17]，能轉(zhuǎn)化硒的形態(tài)[18]，這些特性提高了菌類產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用范圍。

許多微生物的代謝產(chǎn)物如細(xì)菌、放線菌、真菌，具有不同程度的化感效應(yīng)[19-21]。研究表明，低濃度的無機(jī)硒對種子萌發(fā)特性有促進(jìn)作用，高濃度發(fā)揮抑制作用[22-26]；而研究微生物富硒發(fā)酵的代謝產(chǎn)物對種子萌發(fā)特性的影響少見報(bào)道。目前黃綠蜜環(huán)菌還屬于野生，無法進(jìn)行人工栽培。本試驗(yàn)以黃綠蜜環(huán)菌和中華羊茅（Festuca sinensis）為材料，結(jié)合液體和固體培養(yǎng)，研究不同濃度的亞硒酸鈉對黃綠蜜環(huán)菌生長產(chǎn)生的作用，以及黃綠蜜環(huán)菌的富硒培養(yǎng)液對中華羊茅種子萌發(fā)特性的影響，以期為富硒黃綠蜜環(huán)菌和化感物質(zhì)的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1．1．1 菌種

黃綠蜜環(huán)菌菌株由青海師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1．1．2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，pH自然。

深層發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖4%、牛肉膏0．1%、KH2PO40．1%、MgCO30．1%。

1．1．3 植物種子

中華羊茅種子由蘭州大學(xué)草地保護(hù)所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1．2．1 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌落直徑的影響

分別以硒濃度 0（CK）、1．0 mmol·L-1、2．0 mmol·L-1、4．0 mmol·L-1、8．0 mmol·L-1添加到90 mm PDA平板中，用打孔器將黃綠蜜環(huán)菌菌落打孔成直徑4 mm的菌塊，接種于平板中央，每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿，25℃培養(yǎng)7 d后，測量菌落直徑。

1．2．2 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量影響

分別以硒濃度 0（CK）、1．0 mmol·L-1、2．0 mmol·L-1、4．0 mmol·L-1、8．0 mmol·L-1添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，將3塊4 mm的菌塊接到發(fā)酵培養(yǎng)基，250 mL三角瓶中裝入培養(yǎng)液100 mL，25℃、130 r·min-1培養(yǎng)8 d，培養(yǎng)液過濾獲得菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體于60℃干燥至恒重，電子天平稱重測得菌絲體生物量。發(fā)酵液用于活性測定。

1．2．3 黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長的影響

挑選籽粒飽滿的中華羊茅種子，首先用75%的酒精表面消毒1 min，然后用無菌水沖洗3次，將種子分別在不同硒濃度的發(fā)酵液原液（X）、2倍（2X）稀釋液、3倍（3X） 稀釋液、4倍（4X） 稀釋液中浸泡24 h，以無菌水作對照，將種子放到鋪有二層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50粒，每日補(bǔ)充無菌水，以潤濕濾紙為準(zhǔn)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，14 d后測定根長、苗長，并稱量其鮮重。用抑制率來衡量富硒發(fā)酵液對中華羊茅的化感作用情況，抑制率（P） 公式為：

式中：L1表示對照值；L2表示處理值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，各項(xiàng)測定指標(biāo)采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（LSD，P＜0．05）。采用Spearman’s rho方法進(jìn)行生長指標(biāo)之間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌落直徑的影響硒對黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長的影響見圖1。

圖1 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌落直徑的影響Fig．1 Effect of the concentration of Se on the mycelial diameter of Armillaria luteo-virens

由圖1可見，隨著硒濃度的升高，黃綠蜜環(huán)菌菌落生長速度逐漸減慢，對照濃度的菌落直徑顯著大于硒濃度的菌落直徑（P＜0．05）。在硒處理組中，濃度為2．0 mmol·L-1和4．0 mmol·L-1時(shí)，菌落直徑顯著小于濃度為1．0 mmol·L-1的菌落，但顯著大于濃度為8．0 mmol·L-1的菌落（P＜0．05）。

2.2 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響見圖2。

圖2 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響Fig．2 Effect of the concentration of Se on the mycelial biomass of Armillaria luteo-virens.

由圖2可知，黃綠蜜環(huán)菌對硒具有很強(qiáng)的耐受力，在液體培養(yǎng)基硒濃度高達(dá)8．0 mmol·L-1時(shí)，菌絲生物量仍達(dá)到0．68 mg·mL-1。不添加硒的菌絲體生物量顯著高于添加硒的菌絲體生物量（P＜0．05），且隨著硒濃度的增加生物量逐漸下降。當(dāng)硒濃度為4．0 mmol·L-1和8．0 mmol·L-1時(shí)，菌絲體生物量顯著低于硒濃度為1．0 mmol·L-1（P＜0．05）。

2.3 黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長的影響

黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長的影響見表1。

由表1可見，各處理組與對照相比，不同濃度的富硒發(fā)酵液對中華羊茅種子萌發(fā)后苗長、根長、苗鮮重和根鮮重均表現(xiàn)為顯著的抑制作用（P＜0．05)。相同濃度的富硒發(fā)酵液稀釋倍數(shù)越小，其抑制作用越大，對中華羊茅的不同生長指標(biāo)抑制作用由高到低普遍表現(xiàn)為根長＞苗長＞苗鮮重＞根鮮重。

富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長指標(biāo)的相關(guān)分析見表2。

由表2相關(guān)性分析可知，富硒發(fā)酵液作用下苗長與根長、苗鮮重或根鮮重之間相關(guān)系數(shù)較高，分別為 0．696、0．954、0．945，均達(dá)到極顯著水平（P＜0．01）；根長與苗鮮重、根鮮重之間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0．938和0．884；苗鮮重與根鮮重之間相關(guān)系數(shù)高達(dá)0．961?？梢?，在富硒發(fā)酵液的作用下，中華羊茅的各項(xiàng)生長指標(biāo)相關(guān)性較高。

表1 黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長的影響Tab．1 Effect of the Se-enriched fermentation of Armillaria luteo-virens on Festuca sinensis seedling growth

表2 富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長指標(biāo)的相關(guān)分析Tab．2 Correlation of seedling growth criteria of Festuca sinensis affected by the Se-enriched fermentation of Armillaria luteo-virens

3 討論

近年來靈芝 （Ganoderma lucidum）、蜜環(huán)菌（Armillaria mella） 等食用菌作為富硒載體開發(fā)為富硒產(chǎn)品，已引起學(xué)者們的關(guān)注。許多研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的硒能促進(jìn)真菌生長，但高濃度的硒抑制真菌生長[27-29]。何冬蘭等[27]研究Na2Se2O3對靈芝菌絲生長的影響，0．05 mmol·L-1～1．0 mmol·L-1的Na2Se2O3可促進(jìn)菌絲生長，硒濃度高于1．0 mmol·L-1時(shí)菌絲體生長量呈現(xiàn)下降趨勢。王蓉等[28]研究硒對2種靈芝菌生長的影響，認(rèn)為硒抑制固體培養(yǎng)基上靈芝菌的生長，2種靈芝菌的耐受能力不同，其固態(tài)培養(yǎng)的耐硒能力顯著高于液態(tài)培養(yǎng)。唐巧玉等[29]發(fā)現(xiàn)硒濃度小于10 mg·L-1時(shí)能夠促進(jìn)蜜環(huán)菌生長，超過此濃度起到抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)黃綠蜜環(huán)菌在固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)時(shí)，硒濃度為1．0 mmol·L-1～8．0 mmol·L-1時(shí)均對其產(chǎn)生不良影響，可能是因黃綠蜜環(huán)菌比較敏感，而培養(yǎng)基中添加硒的濃度過高所引起。

有相關(guān)研究報(bào)道，低濃度外源硒對植物幼苗生長有促進(jìn)作用，而高濃度的硒表現(xiàn)出顯著的抑制作用[22-26]。真菌發(fā)酵液中存在化感物質(zhì)，對植物生長表現(xiàn)出促進(jìn)或抑制作用[20-21]。吳麗偉等[21]報(bào)道不同濃度的蜜環(huán)菌發(fā)酵液促進(jìn)油菜幼苗的伸長，增加單株的干重，但對根系的伸長表現(xiàn)抑制作用。目前真菌在無機(jī)硒作用下的發(fā)酵液影響植物幼苗生長的研究報(bào)道較少，本試驗(yàn)研究黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長指標(biāo)的化感作用，發(fā)現(xiàn)富硒發(fā)酵液稀釋倍數(shù)越小抑制作用越大，對幼苗不同生長指標(biāo)的抑制作用由高至低依次為根長、苗長、苗鮮重、根鮮重（表1），且各生長指標(biāo)之間存在顯著的正相關(guān)性（表2）；通過各濃度之間的比較發(fā)現(xiàn)，富硒發(fā)酵液對各生長指標(biāo)的抑制作用，隨著濃度的升高而表現(xiàn)出加強(qiáng)的趨勢，除濃度為1．0 mmol·L-1和2．0 mmol·L-1富硒發(fā)酵液的4倍稀釋液外，其它硒濃度下的發(fā)酵液對根長和苗長的抑制率均在90%以上，化感效果好。本研究中，有些相鄰濃度處理之間存在作用趨勢不明顯的結(jié)果，這可能是由于富硒發(fā)酵液中包含多種具有化感作用的物質(zhì)，其對幼苗各項(xiàng)生長指標(biāo)的作用是受多種代謝物共同作用所致，這些結(jié)果與前人的研究具有一定的一致性[20-21]。對于發(fā)酵液中硒的化學(xué)形態(tài)及含量是否與化感作用有關(guān)，需要做進(jìn)一步的研究。

[1]刁治民．青海草地黃綠蜜環(huán)菌生態(tài)學(xué)特性及營養(yǎng)價(jià)值研究[J]．中國食用菌，1997，16（4）：21-22．

[2]王文穎，王啟基，姜文波．黃蘑菇的生長對草地植被及土壤的影響[J]．草業(yè)學(xué)報(bào)，2004，13（4）：34-38．

[3]王啟蘭，姜文波，陳波．黃綠蜜環(huán)菌蘑菇圈生長對土壤及植物群落的影響[J]．生態(tài)學(xué)雜志，2005，24（3）：269-272．

[4]陳立紅，閻偉，劉建．草原蘑菇圈對牧草長勢影響的初步分析[J]．西北植物學(xué)報(bào)，2002，22（6）：1421-1425．

[5]雷茜，王文穎．野生黃蘑菇圈對草地植被及土壤的影響[J]．西北民族學(xué)報(bào)：自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21（2）：42-46．

[6]邊世平．青海祁連黃蘑菇營養(yǎng)成分分析[J]．營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2005，27（5）：439-440．

[7]周連玉，鄧旭武，朱莉莉．中草藥浸提液對黃綠蜜環(huán)菌生長的研究[J]．北方園藝，2010（6）：207-208．

[8]周連玉，朱莉莉，鄧旭武，等．黃蘑菇深層發(fā)酵條件的研究[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，36（1）：110-112．

[9]黨軍，王瑛，陶燕鐸，邵赟，等．黃綠蜜環(huán)菌菌絲體水提物多糖含量測定[J]．光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28（6）：2836-2840．

[10]白世俊，包錦淵．黃綠蜜環(huán)菌有效成分的定性分析[J]．北方園藝，2012（3）：161-163．

[11]李海波，吳學(xué)謙，王立武，等．青藏高原黃綠蜜環(huán)菌純培養(yǎng)菌種的分離培養(yǎng)及分子鑒定[J]．菌物學(xué)報(bào)，2008，27（6）：873-883．

[12]Palmer KM,Stanton NL,Ben-David M,et al．Are pikas exposed to and affected by selenium deficiency[J]．Journal of Wildlife Disease,2007,43(3):475-484．

[13]Rael RM,Frankenberger WT．Influence of pH,salinity,and selenium on the growth of Aeromonas veronii in evaporationagricultural drainage water[J].Water Research,1996,30(2): 422-425.

[14]Arnaudguihem C,Bierla K,Ouerdane L,et al.Selenium metabolomics in yeast using complementary reversed-phase/ hydrophilic ion interaction (HILIC) liquid chromatography-electrospray hybrid quadrupole trap/Orbitrap mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2012,757(C):26-38.

[15]劉麗梅，趙紅衛(wèi)，傅春蓉，等.沼澤紅假單胞菌富硒發(fā)酵條件的研究[J].微生物學(xué)雜志，2010，30（5）：96-101.

[16]夏志蘭，喻桃生，周連玉，等.靈芝液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].微生物學(xué)雜志，2007，27（2）：10-15.

[17]凌宏通，宋斌，林群英，等.富硒食用菌的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2008，28（4）：78-84.

[18]Schiling K,Johnson TM,Wilche W.Isotope fractionation of selenium during fungal biomethylation by Alternaria alternata[J].Environmental Science and Technology,2011,45(7): 2670-2676.

[19]徐開杰，燕明獻(xiàn)，柴乖強(qiáng)，等.農(nóng)桿菌不同菌液濃度對柳枝稷種子萌發(fā)及幼苗生長發(fā)育的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（1）：206-212.

[20]孫鋒.木霉發(fā)酵產(chǎn)物對抗蟲棉種子萌發(fā)及苗期生長的影響[J].作物雜志，2009（2）：33-35.

[21]吳麗偉，王秋穎，蘇明聲，等.蜜環(huán)菌發(fā)酵液化感效應(yīng)的初步研究[J].菌物學(xué)報(bào)，2010，29（1）：119-124.

[22]繆樹寅，梁東麗，趙文龍，等.硒酸鹽和亞硒酸鹽對7種不同基因型小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（10）：1934-1940.

[23]何士敏，張燕，易涵.硒浸種對豌豆種子萌發(fā)的生理生化效應(yīng)[J].種子，2012，31（2）：42-47.

[24]楊亞，朱列書，彭細(xì)橋，等.硒對煙草種子萌發(fā)的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，38（3）：241-244.

[25]李紅俠，劉小陽，陳紅玲，等.硒對胡蘿卜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J].宿州學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，27（1）：47-48.

[26]郭鋒，樊文華.外源硒對鎘脅迫下芥菜種子萌發(fā)生理效應(yīng)的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，28（4）：130-133.

[27]何冬蘭，黃六容，劉梅芳.硒對靈芝菌絲生長及胞外酶活性的影響[J].中國食用菌，2005，24（2）：42-43.

[28]王蓉，師俊玲，樊明濤.硒對兩種靈芝菌生長的影響[J].食用菌，2007（3）：5-8.

[29]唐巧玉，周毅峰，秦恩華，等.硒對蜜環(huán)菌的作用規(guī)律及其在多糖中的積累[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（10）：96-98.

Effects of Selenium on the Mycelial Growth of Armillaria luteo-virens and Allelopathy of Fermentation Broth on Festuca sinensis

ZHOU Lian-yu,YUN Cheng-yu,MI Qin,QIAO Feng
(College of Biology and Geography,Qinghai Normal University,Xining 810008,China)

The effects of selenium on the mycelial growth of Armillaria luteo-virens when the strain grew in solid and liquid media,and allelopathy of fermentation broth of the strain on Festuca sinensis seed germination were studied．The results showed that Na2Se2O3(1．0 mmol·L-1～8．0 mmol·L-1)could inhibit significantly mycelial diameter and biomass (P＜0．05)compared with the control cultures．Effects of the Se-enriched fermentation of A.luteo-virens on F.sinensis seedling growth demonstrated that growth inhibitions increased as the concentration of the Se-enriched fermentation increased,and inhibitory of different growth criteria was root length＞seedling length＞seedling fresh weigh＞root fresh weigh．There were significant positive correlation among different growth criteria (P＜0．01)．

Armillaria luteo-virens;selenium;mycelial growth;allelopathy

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0045-05

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．012

周連玉（1976），女，博士，副教授，主要從事微生物方面研究。E-mail:zly7604@163．com

2015-09-10