蘭玉菲，蔚承祥，王慶武，崔 曉

（山東泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 泰安 271000）

〈病蟲害防治〉

一種山東地栽香菇病害病原菌的分離及鑒定*

蘭玉菲，蔚承祥，王慶武，崔 曉

（山東泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 泰安 271000）

從山東肥城采集到香菇病害樣品，分離得到病原菌分離物FC，提取其基因組總DNA，利用真菌通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增其rDNA ITS區(qū)域序列并進(jìn)行測(cè)序。將獲得的序列進(jìn)行同源性比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)FC分離物與GenBank中8個(gè)米根霉（R.oryzae）分離物同源性最高，為98．27%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，證明該分離物為米根霉（R.oryzae）。

香菇；病害；ITS；分子鑒定

香菇 [Lentinula edodes(Berk．)Sing．]又名香信、冬菇，其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，含有較高的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及礦質(zhì)元素，素有山珍、菇中之王等美稱[1]，具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降血壓、降血脂、保肝護(hù)肝等藥用功效[2]。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)2013年全國(guó)香菇產(chǎn)量達(dá)710．32萬(wàn)t，是年產(chǎn)量最大的品種，產(chǎn)量比2012年增長(zhǎng)11．78%。

近年，通過對(duì)山東省香菇主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查，在地栽香菇大棚中發(fā)現(xiàn)了一種新病害，該病害一旦發(fā)生，菌棒就不再出菇，給地栽香菇生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。本研究對(duì)該病的病原菌進(jìn)行分離鑒定，以期為病害的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試樣品采自山東肥城市邊院鎮(zhèn)過村，栽培模式為大棚內(nèi)覆土地栽，品種為香菇931，代料栽培原料主要為棉籽殼和木屑。

1.2 主要試劑

真菌總DNA提取試劑盒（E．Z．N．A．@ FungalDNA Kit）購(gòu)自北京全式金公司；PCR所用試劑均為大連寶生物公司產(chǎn)品。常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 病原菌的分離純化

將采集的病原菌在無(wú)菌環(huán)境下接種于涂布有2滴～3滴乳酸（濃度為25%）的PDA培養(yǎng)基中，置于25℃黑暗培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)后，進(jìn)行3次純化獲得其純培養(yǎng)物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將分離的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫黑暗培養(yǎng)。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲日生長(zhǎng)速度，觀察并記錄初生菌絲顏色、菌落顏色變化、表面特征、有無(wú)色素產(chǎn)生等。參照方水琴[3]的方法挑取菌株產(chǎn)孢器及菌絲制成水封片，利用顯微成像系統(tǒng)（Olympus BX41） 觀察孢子形態(tài)和大小、菌絲特征及分支情況等，并拍照。

1.5 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

參照蘭玉菲[4]的方法制備病原菌菌絲體；利用真菌總DNA提取試劑盒提取其基因組總DNA；參照White[5]所報(bào)道的用于真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增的通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和程序參照蘭玉菲[4]；PCR結(jié)束后，取4 μL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送北京博尚生物公司測(cè)序；將所得DNA序列輸入GenBank進(jìn)行 Blast檢 索 ， 采 用 Clustalx1．81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 5軟件對(duì)所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄分離物的相應(yīng)序列進(jìn)行比較和分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

發(fā)生在菇棚中的病害癥狀見圖 1。分離純化獲得的病原菌菌株的形態(tài)特征觀察結(jié)果見圖2。

圖1 擬鑒定的病害癥狀Fig．1 Symptoms of Lentinula edodes disease

圖2 病原菌菌株的形態(tài)特征觀察Fig．2 An observation on morphological characters of strain FC

分離純化獲得的病原菌（編號(hào)為FC） 在PDA培養(yǎng)基上菌落初為白色，無(wú)定形，氣生菌絲發(fā)達(dá)，呈棉絮狀；后期產(chǎn)生黑色小顆粒，菌絲呈灰色，2 d～3 d即可長(zhǎng)滿整個(gè)平板（圖2A）；培養(yǎng)5 d后顯微觀察可見菌絲白色透明，無(wú)橫隔（圖2B），孢囊梗叢生，不分支，有假根（圖2C），孢子囊頂生，球形或近球形，深褐色（圖2B、圖2D），孢囊孢子呈卵形、球形或近球形，大小不等，淡褐色（圖2E）。

2.2 病原菌ITS基因的擴(kuò)增

FC菌株ITS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

以提取的病原菌總DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為600 bp的目的片段。

2.3 病原菌ITS的序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

圖3 病原菌菌株ITS區(qū)PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of rDNA ITS region of strain FC

序列測(cè)定結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為604 bp（GenBank登錄號(hào)為KT222809），其中包括13 bp 18S rDNA基因序列、199 bp內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) 1（ITS1）、155 bp 5．8S編碼序列、210 bp內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）和27 bp的28S rDNA。Blast分析顯示，F(xiàn)C與多株Rhizopus oryzae菌株最大相似性達(dá)100%。以黑曲霉（Aspergillus niger） 為外組，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明FC分離物與GenBank中下載的8個(gè)米根霉（R.oryzae）分離物和4個(gè)戴爾根霉（R. delemar）分離物聚為一簇。同源性比對(duì)結(jié)果表明FC分離物與8個(gè)米根霉分離物同源性為98.27%；而與戴爾根霉4個(gè)分離物同源性為93.87%；與少孢根霉（R.microsporus）2個(gè)分離物的同源性為86.43%；與匍枝根霉（R.stolonifer） 分離物的同源性最低，為85.09%。FC分離物與引起甜菜根腐病病原菌（KJ744361） 的ITS核苷酸一致率達(dá)到100%，而與引起桑樹根部腐爛的致病菌（JN003653） 核苷酸一致率為98.76%，綜上說明該分離物為米根霉（R.oryzae）。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the ITS sequences and constructed using the Maximum Likelihood method

3 討論

本研究從山東肥城市邊院鎮(zhèn)香菇大棚中分離到真菌菌株FC，對(duì)該病原菌的ITS序列與GenBank中的ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合病原菌形態(tài)特征，將其鑒定為米根霉（R.oryzae）。FC分離物與引起甜菜根腐病病原菌（KJ744361）的ITS核苷酸一致率達(dá)到100%。

根霉屬（Rhizopus）屬于接合菌亞門（Zygomycotina） 接合菌綱（Zygomycetes） 毛霉目 （Mucorales）毛霉科（Mucoraceae）[6]。根霉為喜高溫的競(jìng)爭(zhēng)性雜菌，廣泛分布于空氣、水塘、土壤及有機(jī)殘?bào)w中，菌絲能分解吸收富含淀粉、糖分等速效性養(yǎng)分基質(zhì)。熟化的培養(yǎng)基在高溫期間接種和發(fā)菌時(shí)極易遭受侵害。香菇菌絲能在被根霉侵染過的培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)，但養(yǎng)分吸收不完全，菌棒板結(jié)，開袋后轉(zhuǎn)色困難[7]。根霉是香菇代料栽培中主要污染真菌之一，分離頻率為4.08%[8]，而危害食用菌的主要為黑根霉 [R.stolonifer（Ehrenb:Fr.Vuill）][6]。本研究分離純化到的FC分離物通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)病原菌為米根霉，與GenBank中的2個(gè)匍枝根霉（R.stolonifer） ITS同源性僅為85.09%，這說明米根霉對(duì)食用菌生產(chǎn)也可產(chǎn)生危害，生產(chǎn)中應(yīng)加以預(yù)防和控制。

[1]黃年來.中國(guó)香菇栽培學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1994.

[2]趙妍，林鋒，宋春艷，等.香菇主要育種技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志，2015，32（2）：92-95.

[3]方水琴，吳福安，陳明勝，等.一種引起成年桑樹根部腐爛的病害及致病菌分離與初步鑒定[J].蠶業(yè)科學(xué)，2011，37（5）：785-791.

[4]蘭玉菲，安秀榮，王慶武，等.一種雞腿菇病害病原菌的分離及鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44（3）：84-87.

[5]White TJ,Bruns T,Lee S,et al.PCR protocols:a guide to methods and applications[M].San Diego:Academic Press, 1990:315-322.

[6]張學(xué)敏，楊集昆，譚琦.食用菌病蟲害防治[M].北京：金盾出版社，1994.

[7]宋金俤，曲紹軒，馬林.食用菌病蟲識(shí)別與防治原色圖譜[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[8]徐耀波.平菇和香菇代料栽培過程中的污染真菌研究[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

Isolation and Molecular Identification of a Pathogen in Lentinula edodes

LAN Yu-fei,YU Cheng-xiang,WANG Qing-wu,CUI Xiao
(Edible Fungi Research Institute,Taian Academy of Agricultural Sciences,Taian 271000,China)

A fungi strain,FC,was isolated from Lentinula edodes and its genome total DNA was obtained．The internal transcribed spacers(ITS)was amplified by PCR using fungi universal primers ITS1 and ITS4．Homology analysis and constructed phylogenetic tree showed that FC shared nucleotide identity of 98．27%with eight Rhizopus oryzae isolates．Combined morphological characteristics,the FC was R.oryzae.

Lentinula edodes;pathogen;internal transcribed spacers(ITS);molecular identification

S646.1

A

1003-8310（2015）06-0074-03

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．019

山東省食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)病蟲害防控崗位（SDAIT-11-011-05）；國(guó)家食用菌產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-24）。

蘭玉菲（1980-），女，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事食（藥）用菌遺傳多樣性分析、新品種選育、病蟲害防控及栽培技術(shù)開發(fā)推廣研究。E-mail:lanyufei526@163．com

2015-09-12