耿雪冉，柳萬石，王賀祥**

（1．中國農(nóng)業(yè)大學生物學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193；2．金亨稷師范大學，朝鮮 平壤 999093）

污白干酪菌核糖核酸酶的分離純化和理化性質(zhì)*

耿雪冉1，柳萬石2，王賀祥1**

（1．中國農(nóng)業(yè)大學生物學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，北京 100193；2．金亨稷師范大學，朝鮮 平壤 999093）

采用DEAE-cellulose陰離子交換層析、CM-cellulose陽離子交換層析和FPLC-Superdex-75凝膠過濾層析，從污白干酪菌（Tyromyces amygdalinus）干子實體純化得到一種核糖核酸酶，SDS-PAGE電泳檢測其為單一蛋白，分子量為25 kDa。最適反應條件為60℃，pH4．4。該酶對幾種寡聚核糖核苷酸的水解活性低于對t-RNA的水解活性。

污白干酪菌；核糖核酸酶；分離純化；理化性質(zhì)

核糖核酸酶（ribonuclease,RNase），是一類廣泛存在于動物、植物以及微生物體內(nèi)的核酸水解酶，其全名為聚核苷-α-寡核苷轉(zhuǎn)移酶。核糖核酸酶的主要生理功能是降解生物體內(nèi)的RNA，控制RNA的種類以及數(shù)量，參與核糖核酸轉(zhuǎn)錄后的剪切、修飾和降解等過程；還與某些植物的自交不親和性、器官發(fā)生、控制腫瘤血管生成[1]、殺滅腫瘤細胞以及抑制病毒（包括HIV-1）的復制等有關(guān)[2]。

迄今為止，已經(jīng)從多種大型真菌中分離純化得到的核糖核酸酶有20多種，比如香菇（Lentinus edodes）[3]、刺芹側(cè)耳 （Pleurotus eryngii）[4]、鳳尾菇（Pleurotus sajor-caju）[5]等。這些大型真菌來源的核糖核酸酶的分子量、理化性質(zhì)以及氨基酸序列都存在較大差異，生物學功能也各不相同。

污白干酪菌（Tyromyces amygdalinus）隸屬于擔子菌門（Basidiomycota） 層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）干酪菌屬（Tyromyces）。污白干酪菌分布于河北、安徽、浙江、湖南、海南、四川、貴州、云南、福建等地，夏秋季生樹木上，可導致木材腐朽。目前對該菌的研究較少，尤其是生理活性物質(zhì)的研究更少。本文從污白干酪菌的子實體中分離純化出一種核糖核酸酶，并對其部分性質(zhì)進行研究，擬為污白干酪菌核糖核酸酶進一步的研究應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

污白干酪菌干子實體。

1.2 試驗方法

1．2．1 核糖核酸酶活性測定方法

將5 μL酶液加到135 μL，0．1 mol·L-1pH4．4 NaAc-HAc緩沖液中，然后加入10 μL底物tRNA（10 mg·mL-1）；空白對照以5 μL去離子水代替酶樣品，其他同樣品管。將其充分混勻后，37℃水浴反應15 min，迅速加入350 μL 3．8%高氯酸終止反應，12 000 r·min-1離心5 min后取上清于260 nm處測定吸光度。

酶活性定義：以260 nm處每分鐘、每毫升反應液產(chǎn)生1個吸光值所需要的酶量作為一個酶活力單位。

1．2．2 核糖核酸酶粗樣品的制備

稱量污白干酪菌干子實體10 g，加入200 mL的去離子水組織勻漿破碎，4℃抽提過夜。勻漿液9 000 r·min-1離心10 min，取上清液，得到粗樣品。

1．2．3 DEAE-cellulose陰離子交換層析

粗提取物通過DEAE-cellulose陰離子交換層析，層析柱預先用10 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8．4） 緩沖液平衡，上樣后以同一緩沖液將不吸附的組分洗脫，再分別用含150 mmol·L-1NaCl、500 mmol·L-1NaCl和1 mol·L-1NaCl的緩沖液進行分段洗脫，得到活性組分。

1．2．4 CM-cellulose陽離子交換層析

將DEAE-cellulose陰離子交換層析所得活性組分充分透析后，通過預先用10 mmol·L-1pH 4．4 NaAc-HAc-緩沖液平衡好的CM-cellulose陽離子交換層析柱，上樣之后以同一緩沖液將不吸附的組分洗脫下來，再分別用含150 mmol·L-1NaCl、300 mmol·L-1NaCl和1 mol·L-1NaCl的緩沖液進行分段洗脫，得到活性組分。

1．2．5 FPLC-Superdex-75HR 10/300凝膠過濾層析

將CM-cellulose陽離子交換層析所得活性組分充分透析，冷凍干燥，進行FPLC-Superdex-75凝膠過濾層析，層析柱預先用150 mmol NH4HCO3（pH 8．4）緩沖液平衡，即得到活性組分。

1．2．6 SDS-PAGE電泳檢測

純化所得的核糖核酸酶通過SDS-PAGE檢驗純度及分子量。取20 μL核糖核酸酶樣品，加入5 μL上樣緩沖液，混合后煮沸5 min，12 000 r·min-1離心1 min，取上清，加樣，電泳檢測。電泳條件：濃縮膠（5%）和分離膠（15%）采用恒壓180 V。電泳完畢后，加入考馬斯亮藍G-250染色1 h～2 h，脫色液脫色至本底無色，對比標準蛋白分子量并且結(jié)合FPLC結(jié)果計算分離得到的核糖核酸酶分子量。

1．2．7 RNase氨基酸序列的質(zhì)譜分析

RNase氨基酸序列的質(zhì)譜分析由廣州輝駿生物科技公司完成，所用儀器為納升級高效液相色譜儀－線性離子肼－靜電場軌道肼質(zhì)譜聯(lián)用儀（nano-flow HPLC-LTQ-Orbitrap mass spectrometer）。

1．2．8 RNase的理化性質(zhì)

最適反應pH：配制0．1 mol·L-1不同pH的緩沖液，將純化所得的RNase加入到上述緩沖液中，按照標準方法測定酶活力，活力最高值為100%，以相對活力為縱坐標，相應的pH值為橫坐標作圖。

最適反應溫度：將純化所得的RNase在最適pH條件下，分別在4℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的溫度下反應15 min，按照標準方法測定酶活力，活力最高值為100%，以相對活力為縱坐標，相應的溫度值為橫坐標作圖。

熱穩(wěn)定性：將純化所得的RNase在不同溫度條件下作用1 h后，按照標準方法測定酶活力，未孵育的初始活力值為100%，以相對活力為縱坐標，相應的溫度值為橫坐標作圖。

RNase對寡聚核糖核苷酸的水解作用：以10 mg·mL-1的poly（A）和poly（C）為反應底物，將5 μL的酶樣品加入到 135 μL，0．1 mol·L-1pH4．4 NaAc-HAc緩沖液中，然后加入10 μL底物；空白對照以5 μL去離子水代替酶樣品，其余都相同。充分混勻后，置于37℃水浴反應15 min，迅速加入350 μL 3．8%高氯酸終止反應，12 000 r·min-1離心5 min，poly（A）上清在260 nm處測定吸光值，poly（C）上清在280 nm處測定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 污白干酪菌RNase的分離純化結(jié)果

污白干酪菌RNase洗脫曲線見圖1。

圖1 RNase在DEAE-cellulose和CM-cellulose的洗脫曲線Fig.1 Elution profiles of RNase on DEAE-cellulose column and CM-celllulose column

污白干酪菌子實體經(jīng)過組織勻漿、抽提后得到的粗樣品通過DEAE-cellulose陰離子交換層析分段洗脫，其洗脫曲線如圖1a所示，得到了4個組分的洗脫峰D1、D2、D3和D4。經(jīng)過測定各洗脫峰的RNase酶活性，發(fā)現(xiàn)酶活性主要集中在D3組分。收集D3組分，充分透析，通過CM-cellulose陽離子交換層析，得到了4個峰，洗脫曲線如圖1b所示。通過檢測RNase活性，發(fā)現(xiàn)RNase活性集中在C2組分。污白干酪菌RNase在Superdex 75的洗脫曲線及SDS-PAGE電泳圖見圖2。

圖2 RNase在Superdex-75洗脫曲線及SDS-PAGE電泳圖Fig.2 FPLC-gel filtration of RNase on Superdex-75 HR 10/300column and SDS-PAGE of fraction SU1

收集C2組分，透析凍干后，進行FPLC-Su perdex-75 HR10/300凝膠過濾層析，其洗脫曲線見圖2a，得到2個洗脫峰SU1和SU2，活性主要集中在SU1。SU1峰呈現(xiàn)的是一個單一且對稱的峰，所以初步判斷得到的核糖核酸酶是單一組分。收集SU1活性峰的組分，凍干后電泳檢查純度。污白干酪菌RNase的分子量是25 kDa。

2.2SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果

SU1組分電泳結(jié)果為一條帶（圖2b），結(jié)合在Superdex-75 HR10/300凝膠過濾的結(jié)果，該酶的分子量為25 kDa。

2.3 污白干酪菌RNase的質(zhì)譜結(jié)果分析

通過質(zhì)譜分析，得到的短肽序列用Mascot匹配NCBInr數(shù)據(jù)庫，污白干酪菌RNase蛋白條帶匹配上8個肽段，分別為：LAAELALR、EVTEISEMDIK、LEINNDKK、SFSQMALLLATWKPMR、QEEVSIPK、NFRNNIDNQLNQGMR、MTYEIGDRLK、NNKDFVCVLMSEIFPSR。

2.4 污白干酪菌RNase的理化性質(zhì)

污白干酪菌RNase的最適pH、溫度，以及在不同pH緩沖液和不同溫度中測定的酶活性見圖3。

從圖3可以看出，該酶的最適pH及溫度分別為pH 4.4和60℃（圖3a）。pH大于6.0，酶的活性非常低，僅為最高活性的20%及以下，然而在pH 3.0到pH 5.0范圍內(nèi)活性比較高，由此可見該酶是一種酸性核糖核酸酶（acid RNase，ACR）。從溫度對污白干酪菌RNase活性的影響來看（圖3b），與其他大部分已純化出的核糖核酸酶差不多，在溫度50℃～60℃范圍內(nèi)活性非常高，最適溫度為60℃。溫度高于70℃酶迅速失活。污白干酪菌RNase在不同溫度條件下處理1 h后，酶活性如圖3c所示。溫度低于60℃，酶的活性比較穩(wěn)定，在60℃處理1 h后仍保持有80%的酶活性時，但溫度高于60℃時，酶迅速失活。

圖3 污白干酪菌RNase的理化性質(zhì)Fig.3 Characteristics of Tyromyces amygdalinus RNase

RNase對寡聚核糖核苷酸的水解活性遠遠低于對t-RNA的水解活性，該RNase對poly（A）、poly（C）均有一定的水解能力，其活性分別為（4.46± 0.4） U·mg-1和（5.33±0.3） U·mg-1，然而對t-RNA的活性為（40.0±1.9）U·mg-1。

3 結(jié)論

通過各種層析從污白干酪菌中分離純化得到一種核糖核酸酶，其分子量為25 kDa。該酶最適作用溫度和pH分別為60℃和pH 4.4。該酶對poly（A）和poly（C）均有一定的水解作用。

[1]聶明建,王國槐.植物核糖核酸酶與轉(zhuǎn)基因工程雄性不育系研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2006（3）：122-127.

[2]Dewi DL,Ishii H,Haraguchi N,et al.Dicer 1,ribonuclease type III modulates a reprogramming effect in colorectal cancer cells[J].Int J Mol Med,2012,29(6):1060-1064.

[3]Kobayashi H,Itagaki T,Inokuchi N,et al.A new type of RNase T2 ribonuclease in two Basidiomycetes fungi,Lentinus edodes and Irpex lacteus[J].Biosci Biotechnol Biochem,2003, 67(10):2307-2310.

[4]Ng TB,Wang HX.A novel ribonuclease from fruiting bodies of the common edible mushroom Pleurotus eryngii[J].Peptides,2004,25(8):1365-1368.

[5]Ngai PH,Ng TB.A ribonuclease with antimicrobial,antimitogenic and antiproliferative activities from the edible mushroom Pleurotus sajor-caju[J].Peptides,2004,25(1):11-17.

全球食用菌市場將迎來新發(fā)展階段

據(jù)美國最新報道稱，由于全球消費者對有機產(chǎn)品的需求不斷增加，2018年全球食用菌市場將迎來新的發(fā)展階段。全世界的農(nóng)民已經(jīng)開始著手發(fā)展蘑菇種植，并把它作為更有利可圖的產(chǎn)業(yè)之一。

當下，一些因素擴大了蘑菇市場高收益系統(tǒng)的發(fā)展，增加了需求飽和，提高了客戶對產(chǎn)品的增值接受度和改變了超市豐富的產(chǎn)品種類。然而，也有一些制約全球蘑菇市場增長的因素，比如蘑菇食品的短期保質(zhì)期，添加使用不安全的成分或是防腐劑等。

蘑菇是有營養(yǎng)的，應對全世界人民進行普及。同時，增加蘑菇更深層次的研究、開發(fā)更多趣味活動，打造更全面的蘑菇創(chuàng)新理念，將進一步加速全球蘑菇的市場發(fā)展。

中國食用菌商務網(wǎng) 2015.10.30

Purification and Characterization of Ribonuclease from Tyromyces amygdalinus

GENG Xue-ran1,Ryu Mansok2,WANG He-xiang1
（1．State Key Laboratory for Agrobiotechnology and Department of Microbiology,College of Biologial Sciences,China Agricultural University,Beijing 100193,China; 2．Pyongyang KimHyongJik University of Education,Pyongyang 999093,D．P．R．Korea）

A novel ribonuclease (RNase)was purified from dry fruit bodies of Tyromyces amygdalinus using a purification procedure which involved ion exchange chromatography on DEAE-cellulose,CM-cellulose and gel filteration chromatography by FPLC on superdex 75HR 10/300 column．Combine with the result from FPLC and SDS-PAGE,it was estimated that this ribonuclease was a monomeric protein with a molecular weight of 25 kD．The optimum temperature of this RNase is 60℃,and optimum pH of it is 4．4．The activity of this enzyme toward poly A and poly C was lower than that of t-RNA．

Tyromyces amygdalinus;ribonuclease;purification;characterization

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0063-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．016

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項基金（CARS-24）。

耿雪冉（1988-），女，在讀博士研究生，主要研究方向為藥用與食用真菌。E-mail:gengxueran2007@163．com

**通信作者：王賀祥（1957-），男，博士，教授，主要從事藥用與食用真菌研究。E-mail:hxwang@cau．edu．cn

2015-09-09