張永改，郭 敏，張大山，劉偉蘭，李祥龍*，周榮艷，李蘭會

(1 河北科技師范學院，河北 秦皇島，066004；2 河北農業(yè)大學；3 河北省定州市第二中學)

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山羊Agouti基因啟動子活性區(qū)域探究

張永改1,2,3，郭 敏1，張大山1，劉偉蘭2，李祥龍1*，周榮艷2，李蘭會2

(1 河北科技師范學院，河北 秦皇島，066004；2 河北農業(yè)大學；3 河北省定州市第二中學)

對前期拼接獲得的12 847 bp山羊Agouti基因序列(EF587236和JN651404)進行啟動子活性區(qū)域預測，確定候選啟動子區(qū)為6 450～7 100 bp，得到一個長度為2 537 bp的DNA片段，在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個典型轉錄因子結合位點TATA框，并預測到HSF，SYR，GATA-1，Nkx-2，ADR1等多個轉錄因子結合位點；山羊基因組序列(登錄號：AJPT01136617.1)中有兩段序列與牛的預測啟動子promoter A和promoter B同源性較高，據(jù)此設計引物擴增目的片段，同時構建12個熒光素酶報告基因質粒，瞬時轉染人皮膚黑素瘤細胞A375和293T細胞檢測目的片段是否具有Agouti基因啟動子活性。結果表明，所構建的目的片段質粒與陰性對照相比無顯著差異，說明所獲得的目的片段不具有啟動子活性。

山羊；Agouti基因；啟動子

Agouti是指被毛具有黑色底色，尖端呈黃色特征皮毛的刺豚鼠，該詞來源于南美土著印第安部落，最初將與此被毛特征相關的基因座命名為Agouti[1]，現(xiàn)在動物毛色已成為辨別其外貌的主要特征之一[2]。Agouti是黑素皮質素受體信號轉導的重要調控基因之一，在人(Homosapiens)、雞(Gallusgallus)、牛(Bostaurus)、豬(Susscrofa)、綿羊(Ovisaries)和嚙齒類等許多動物體內被發(fā)現(xiàn)[3～5]。Agouti基因含有多個等位基因，結構復雜，并且在不同物種中具有較高的同源性。山羊Agouti基因包含內含子1(531 bp)、外顯子2(169 bp)、內含子2(1 318 bp)、外顯子3(3 463 bp)和外顯子4(177 bp)[6～8]。采用熒光定量PCR技術證明，不同毛色山羊皮膚組織中Agouti基因mRNA表達量為白色>黑色>棕色山羊，說明不同毛色山羊皮膚組織中的mRNA表達量不同，5’UTR變異對不同毛色山羊Agouti基因mRNA表達量有影響[9]。在所獲得的山羊Agouti基因12 847 bp序列中對基因編碼區(qū)上游進行啟動子活性區(qū)域預測，利用TFSEARCH軟件進行轉錄因子結合位點分析，檢測到GATA-2，GATA-3，Oct-1，CdxA，HSF，GATA-1，STRE，ADR1，AP-2和AP-1等多個轉錄因子結合位點，確定候選啟動子區(qū)為6 450～7 100 bp[10]。尋找Agouti基因啟動子區(qū)域是研究Agouti基因重要環(huán)節(jié)，該工作對研究該基因遺傳的分子生物學基礎、指導山羊品種改良、選育及品種特異性研究具備重要理論和實踐意義，同時能為我國地方山羊品種群體遺傳的結構、分化及其多樣性研究提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本次試驗所用樣品來自河北農業(yè)大學動物科技學院實驗室保存的太行山羊肝臟組織樣品，利用酚氯仿抽提法提取山羊肝臟組織基因組DNA。PCR擴增、細胞培養(yǎng)與轉染等所用試劑購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 目的片段引物設計及擴增

利用Primer Premier 5.0軟件，對擴增的2 537 bp序列分別設計不同長度的缺失片段，構建12個含有該片段的質粒(表1，分別以片段的起止位置命名)。在全長2 537 bp片段中不包含KpnⅠ，SmaⅠ，HindⅢ酶切位點，上述3種酶的酶切位點可作為參考的限制性酶切位點。在正反向引物的5’端分別引入KpnⅠ，SmaⅠ，HindⅢ酶切位點及相應的保護堿基以便于克隆。

PCR反應總體系為40 μL：滅菌水12 μL，2×Taq Mastermix 20 μL，模板基因組、cDNA 2 μL和正反引物各3 μL。

PCR反應條件：預變性，94 ℃,5 min；變性，94 ℃，30 s；退火30 s；延伸，72 ℃，根據(jù)片段大小確定延伸時間，35個循環(huán)；終延伸，72 ℃，10 min。

表1 擴增山羊Agouti 基因啟動子預測區(qū)序列引物

注：小寫字母為引入的保護堿基，下劃線處為限制性酶切位點；大寫字母為引物特異性序列。

1.3 目的片段的克隆及鑒定

連接pMD-19T載體體系：0.5 μL PMD-19T vector，0.5～2.0 μL PCR回收產物，2.5 μL Slution I ，滅菌的去離子水補齊到5 μL。然后離心混勻，16 ℃連接過夜然后用TransⅠ-T1感受態(tài)轉化。過夜37 ℃搖床培養(yǎng)，利用通用引物，吸取1 μL菌液為模板做菌液PCR鑒定，選取陽性克隆，送華大基因公司測序鑒定。

1.4 重組質粒構建及鑒定

以回收的目的片段和酶切后的pGL3-Basic載體10∶1比例連接，用T4 DNA連接酶將目的片段連接到pGL3-basic載體上，構建含熒光素酶報告基因的重組質粒。菌液PCR鑒定后選陽性克隆，雙酶切鑒定后華大基因進行測序鑒定。

1.5 細胞培養(yǎng)、轉染及檢測

在24孔培養(yǎng)板用胎牛血清體積分數(shù)為0.10的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細胞和A375細胞。培養(yǎng)條件為： CO2的體積分數(shù)為0.05，37 ℃溫箱培養(yǎng)，24 h后當細胞匯合度達80%～90%且細胞生長狀態(tài)良好時， 再根據(jù)Lipofectamine 2000脂質體轉染說明進行轉染實驗，最后輕輕晃動孔板使之混勻，放入CO2的體積分數(shù)為0.05，37 ℃溫箱培養(yǎng)。轉染6 h后，用相應的含血清的正常細胞培養(yǎng)液換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲細胞。用1×PBS洗滌轉染細胞1～2次，加入報告基因細胞裂解液裂解細胞和熒光劑用于檢測。

圖1 山羊基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2 結果與分析

2.1 山羊基因組DNA的提取結果

提取的DNA條帶致密、整齊、清晰，并且無明顯拖尾(圖1)，說明DNA完整性較好，不需要純化，可稀釋后直接做模板進行后續(xù)PCR擴增。

2.2 目的片段啟動子區(qū)活性驗證

2.2.1 目的片段序列比對及擴增結果 目的片段A和B與云南黑山羊Agouti基因部分序列(登錄號為AJPT01136617.1)同源性分別達92%和94%，其他片段同源性100%。利用模山羊基因組，TransStart Taq酶及引物進行PCR擴增，質量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約750，2 500 bp處有明亮條帶(圖2)。

圖2 山羊Agouti基因啟動子預測區(qū) PCR擴增結果

2.2.2 重組質粒pMD19-T/2537/A/B的PCR鑒定與雙酶切鑒定 利用重組質粒pMD19-T/2537和pMD19-T-A以及pMD19-T-B為模板，NS0和NA0為引物進行PCR擴增。質量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約2 500，750 bp處有明亮條帶(圖3)。

利用限制性內切酶HindⅢ和KpnⅠ對重組質粒pMD19-T/2537和pMD19-T-A,pMD19-T-B進行雙酶切，質量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖4)。

2.2.3 重組質粒pGL3-Basic/px/A/B的PCR與雙酶切鑒定 利用重組質粒pGL3-Basic/px/A/B為模板及相應引物進行PCR擴增，質量濃度為10.0 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果圖譜為圖5，雙酶切電泳結果見圖6。

2.2.4 測序鑒定 將上述經PCR和酶切鑒定正確的重組質粒pGL3-Basic/px/A/B送北京華大基因有限公司進行測序。結果表明，克隆到的目的片段與pGL3-Basic/px中所得山羊Agouti基因序列相似性高達90%以上，表明已成功構建了12個包含山羊Agouti基因重組質粒。

2.2.5 細胞轉染及目的片段啟動子活性鑒定 對A375細胞和293T細胞分別進行綠色熒光蛋白轉染，結果表明，在m(脂質體)∶m(質?？偭?為1∶1時，轉染效率最高，約為85%(圖7，圖8)，不同轉染比例的結果見表2。

圖3 重組質粒pMD19-T-2537和pMD-T-A，pMD-T-B的PCR產物電泳圖

圖4 質粒pMD19-T/2537和pMD-T-A，pMD-T-B雙酶切電泳圖

圖5 重組質粒pGL3-Basic/px/A/B PCR產物電泳圖

圖6 重組質粒pGL3-Basic/px/A/B雙酶切電泳圖

圖7 A375細胞轉染綠色熒光蛋白 圖8 293T細胞轉染綠色熒光蛋白

根據(jù)試驗設計，在m(脂質體)∶m(質?？偭?為1∶1時，進行雙熒光素酶報告基因兩種質粒最佳比例的探索，結果表明，A375細胞轉染pGL-3 Control和pRL-TK最佳比例為100∶1，293T細胞的最佳比例為800∶1(圖9)。

根據(jù)所探索的最佳轉染效率結果，轉染體系見表3。

報告基因載體瞬時轉染A375細胞及293T細胞。48 h后收獲細胞并裂解細胞，計算相對Luc活性值。綜合多次實驗結果，用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,A375細胞和293T細胞陽性對照Luc值遠高于陰性對照，說明細胞轉染的效果比較好，陰性對照與pGL3-Basic/px/A/B的Luc值相比差異不顯著(p>0.05),說明pGL3-Basic/px/A/B均不具備啟動子活性(表4)。

表2 不同lip和GFP質粒比例對細胞轉染效率的影響 %

圖9 不同pGL-3 Control和pRL-TK比例的Luc相對活性值

表3 A375和293T細胞的轉染體系

表4 A375和293T細胞中片段pGL3-Basic/px/A/B的Luc活性比值

3 討 論

實驗室前期所測山羊Agouti基因部分序列(EF587236.2)與(JN651404)拼接序列長度為12 847 bp，預測出山羊Agouti基因候選啟動子區(qū)為6 450～7 100 bp。將綿羊CH243-455O4的反向互補序列與12 847 bp(EF587236+JN651404)的拼接序列進行比對分析，獲得12 847 bp序列之前的部分序列，拼接后得到長度為27 793 bp的山羊Agouti基因部分基因組序列。比對發(fā)現(xiàn)，這條長達27 793 bp的基因序列與NCBI中部分山羊Agouti基因片段(登錄號為AJPT01136619.1，AJPT011366120.1，AJPT01136621.1，AJPT01136622.1，AJPT01136623.1)的部分序列都能比對上，并可以形成連續(xù)的片段。通過本次實驗中所獲得的片段，將山羊基因組片段(登錄號為AJPT01136617.1，AJPT011366118.1，AJPT011366119.1)的所有序列拼接起來，直到與前期獲得的27 793 bp片段有重合部分，這樣就獲得與27 793 bp拼接序列共36 067 bp，再加上之前的27 793 bp共63 860 bp，這樣從所得的63 860 bp的序列來看，前期選取的候選啟動子區(qū)域范圍為56 180～58 717 bp，這2 537 bp的候選區(qū)域包括了Agouti基因外顯子2的前44 bp。根據(jù)Michael等[11]對牛的預測啟動子片段promoter A和promoter B與山羊基因組序列(登錄號為AJPT01136617.1)比對，結果：promoter A與山羊基因組序列(登錄號為AJPT01136617.1)1 472～2 011 bp位置相對應。Promoter B與山羊基因組序列(登錄號為AJPT01136617.1)3 068～3 632 bp位置相對應，但是promoter B的前100 bp沒有比對上。通過實驗構建所獲得的目的片段重組質粒轉染細胞驗證結果為：所獲得目的片段均無啟動子活性。從本次實驗所選取的區(qū)域與實驗室前期所選取的區(qū)域中間有16 481 bp。經過試驗探索，接下來的工作可以從以下兩方面進行：在這16 481 bp范圍內，以2 000 bp為一個片段，可以逐段預測，根據(jù)預測結果并進行blast比對，來尋找一段保守性強，并且預測值高的片段進行啟動子區(qū)尋找；根據(jù)前期課題組對5’非翻譯區(qū)外顯子1剪接體類型的研究，根據(jù)各種類型剪接體在基因組的相對位置，找到最靠近5’端剪接體之前的序列，預測啟動子活性并進行試驗驗證；基于Norris等[12]對白色綿羊的ITCH啟動子控制ASIP的表達的研究來設計引物，對其試驗驗證。

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Explore of Promoter Activity Area of GoatAgoutiGene

ZHANG Yong-gai1,2,3,GUO Min1,ZHANG Da-shan1,LIU Wei-lan2, LI Xiang-long1,ZHOU Rong-yan2,LI Lan-hui2
(1 Hebei Normal University of Science & Technology,Qinhuangdao Hebei,066004;2 Agricultural University of Hebei;3 Dingzhou Second Middle School;China)

The candidate promoter region (6 450-7 100 bp) of goatAgoutigene was predicted using the sequence joined from JN651404 and EF587236.2. The fragment of 2 537 bp was obtained, in which a typical transcription factor binding sites of TATA box was found, and other transcription factor binding sites (HSF, SYR, GATA-1, ADR1 and Nkx-2) were also predicted. Twelve luciferase reporter gene plasmids were constructed based on two parts of goat genome sequence of AJPT01136617.1 which had higher homology with cattle predicted promoters A and B. Then luciferase reporter gene plasmids were transiently transfected into cells of A375 and 293T to determine whether the fragments hadAgoutigene promoter activity. The results showed that the constructed plasmids had no significant difference compared with negative control, indicating the fragments had no promoter activity.

goat;Agoutigene;promoter

國家自然科學基金資助項目(項目編號：31172196)；河北省應用基礎研究計劃重點基礎研究資助項目(項目編號：15962901D)。

，男，博士，教授，博士研究生導師。主要研究方向：動物遺傳育種。E-mail：lixianglongcn@yahoo.com。

2015-09-15

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.001

S827.2

A

1672-7983(2015)03-0001-07

張永改(1987-)，女，碩士。主要研究方向：動物遺傳學。

(責任編輯：朱寶昌)