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        貉源犬瘟熱病毒昌黎株的分離鑒定及其H基因序列分析

        2015-04-12 00:46:55王建科程悅寧馬增軍劉曜綜
        關(guān)鍵詞:貉子犬瘟熱核苷酸

        王建科,芮 萍,程悅寧,馬增軍*,劉曜綜

        (1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春,130112;2 河北科技師范學(xué)院,河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

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        貉源犬瘟熱病毒昌黎株的分離鑒定及其H基因序列分析

        王建科1,芮 萍2,程悅寧1,馬增軍*2,劉曜綜2

        (1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春,130112;2 河北科技師范學(xué)院,河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

        為了解河北省毛皮動(dòng)物犬瘟熱病毒的流行及遺傳變異情況,采用 Vero 細(xì)胞從具有犬瘟熱臨床癥狀的貉肺臟樣品中分離出一株病毒,經(jīng)過間接免疫熒光、RT-PCR和動(dòng)物回歸試驗(yàn)等鑒定,分離的病毒為犬瘟熱病毒(CDV),命名為 CDV CL14株。對(duì)該病毒血凝蛋白H基因進(jìn)行克隆測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析表明,CDV CL14分離株屬于Asia-1型,為我國的流行毒株,H基因核苷酸及其編碼氨基酸序列與我國流行毒株有較高的同源性,其中核苷酸同源性最高的為 HeB(09)1株和 LN-13-1株,同源性同為 99.1%,而氨基酸同源性最高的為 LN-13-1株,同源性為 99.3%。

        犬瘟熱病毒;H基因;分離;鑒定

        犬瘟熱(Canine distemper, CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)引起的多種動(dòng)物感染的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,是水貂、狐貍和貉子等毛皮動(dòng)物的主要傳染病之一,給毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。該病臨床上以雙相熱、卡他性鼻炎及隨后引起的支氣管炎、卡他性肺炎、嚴(yán)重的胃腸炎、神經(jīng)等癥狀為主要特征。CDV自然感染宿主有食肉目所有8個(gè)科,以及偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動(dòng)物,CDV自然感染的動(dòng)物范圍還有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì),其危害性也越來越大,大熊貓也有感染發(fā)病的報(bào)道[3],甚至從患有 Paget’s 疾病的病人體內(nèi)檢測(cè)到了CDV的核酸存在[4]。

        2014年8月,河北省昌黎縣某貉子養(yǎng)殖場(chǎng)的當(dāng)年生幼貉,突然出現(xiàn)了咳嗽、嘔吐、腹瀉等癥狀,個(gè)別貉子還出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀;病貉眼瞼周圍有膿性分泌物,鼻鏡干燥;動(dòng)物剖檢發(fā)現(xiàn),脾臟腫大,膀胱黏膜有出血點(diǎn),肺臟表面出血。本研究從病貉臟器內(nèi)分離出一株病毒,經(jīng)過鑒定為CDV,并且對(duì)其H基因進(jìn)行了克隆測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析。

        1 材料和方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        Vero細(xì)胞、陽性對(duì)照株CDV3疫苗株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;健康貉子引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地;CDV抗原檢測(cè)試紙條引自韓國BioNote, Lnc.;CDV N蛋白單克隆抗體引自VMRD公司,F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠二抗引自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;Trizol Reagent引自Life Technologies公司;反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV,RNasin,Taq聚合酶,dNTPs,DNA Marker,pMD18-T引自 TaKaRa公司。

        1.2 樣品處理

        采集河北省昌黎縣某貉場(chǎng)疑似犬瘟熱的貉子病料5例,經(jīng)CDV抗原試紙條檢測(cè)為陽性,無菌取死亡貉子肺臟樣品加MEM培養(yǎng)基制成1∶10的乳劑,8 000 r/min離心10 min,取上清,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,置于-80 ℃ 冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 病毒分離

        將上述處理好的病料樣品接種于長成單層的Vero細(xì)胞,于37 ℃ CO2的體積分?jǐn)?shù)為0.05條件下培養(yǎng),并逐日觀察細(xì)胞病變(CPE);如無CPE連續(xù)盲傳培養(yǎng),至第4代仍無CPE可認(rèn)定為陰性。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。陽性培養(yǎng)物凍融3次后于 -80 ℃ 冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4 病毒電鏡鑒定

        取已出現(xiàn)CPE的第4代病毒Vero細(xì)胞培養(yǎng)物,凍融3次后收毒,5 000 r/min離心10 min,取上清液用質(zhì)量濃度為20 g/L的磷鎢酸負(fù)染進(jìn)行電鏡觀察。

        1.5 RT-PCR鑒定

        參照王鳳雪等[5]的方法,引物對(duì)H1:5′-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3′和H2:5′-CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,采用Trizol試劑提取病毒RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增,對(duì)分離病毒進(jìn)行分子生物學(xué)試驗(yàn)鑒定。

        1.6 病毒理化性質(zhì)鑒定

        對(duì)分離病毒進(jìn)行理化學(xué)特征鑒定。參考程悅寧[6]的方法對(duì)分離株病毒進(jìn)行核酸型、氯仿、乙醚、pH 3.0耐酸及60 ℃耐熱試驗(yàn)鑒定。同時(shí)設(shè)立不作處理的正常對(duì)照組。

        1.7 間接免疫熒光鑒定

        向長成單層的Vero細(xì)胞接CDV CL14株第4代病毒,48 h后用預(yù)冷的質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛溶液室溫固定30 min,PBS洗滌3次,每次5 min;加入用PBS 100倍稀釋的CDV單抗,37 ℃孵育45 min,PBS洗滌3次,每次5 min;加入1 000倍稀釋的二抗,37 ℃孵育45 min,PBS洗滌3次,每次5 min;熒光顯微鏡下檢查有無特異性的熒光。同時(shí)設(shè)置CDV3疫苗株對(duì)照。

        1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

        選擇CDV中和抗體于 l∶2的3月齡健康貉子10只,隨機(jī)分為2組,每組5只。人工感染組5只經(jīng)皮下注射,攻毒劑量為2 mL(2×104.5TCID50);對(duì)照組5只,相同方式注射2 mL Vero細(xì)胞培養(yǎng)物,分別隔離觀察飼養(yǎng)15 d,每天觀察臨床癥狀;并于攻毒第3天開始收集攻毒貉子肛拭子;試驗(yàn)第15天撲殺全部貉子進(jìn)行大體解剖觀察。

        1.9H基因序列分析

        參照ZHAO JJ et al[7]建立的方法,略作改進(jìn)進(jìn)行CDVH基因的擴(kuò)增和測(cè)序,引物對(duì)H3:5′-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3′和H4:5′-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,RNA提取及RT-PCR參考文獻(xiàn)記載的方法進(jìn)行,對(duì)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Lasergene生物軟件的SeqMan進(jìn)行拼接,對(duì)H基因和GenBank中登錄的CDV參考毒株進(jìn)行同源性比較,并用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

        2 結(jié) 果

        2.1 病毒分離

        應(yīng)用 Vero 細(xì)胞對(duì)貉肺臟樣品進(jìn)行病毒分離。在接毒細(xì)胞的前2代未見明顯病變,盲傳至第3代時(shí),細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、脫落以及細(xì)胞融合成巨細(xì)胞等出現(xiàn)典型的CDV細(xì)胞病變(圖 1)。結(jié)果從送檢的樣品中分離獲得1株CDV病毒,命名為CDV CL14株。

        2.2 病毒電鏡鑒定

        取分離毒CDV CL14株第4代細(xì)胞培養(yǎng)物,經(jīng)過處理后在透射電鏡下可見圓形病毒粒子,有囊膜、可以看到纖突,該病毒粒子直徑大約300 nm(圖2),具有典型的犬瘟熱病毒粒子的形態(tài)特征。

        2.3 RT-PCR

        取發(fā)病貉子的肺臟提取總RNA,應(yīng)用引物H1和H2能成功擴(kuò)增出335 bp的目的片段,與預(yù)期大小一致的。PCR結(jié)果驗(yàn)證了此貉子感染了CDV。圖3為病貉肺臟RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。

        圖3 CDV CL14株RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果M:DNA maker,1:CDV3陽性對(duì)照,2:CDV CL株,3:陰性對(duì)照

        2.4 病毒的理化性質(zhì)鑒定

        CDV CL14株經(jīng)FUDR處理后其TCID50與對(duì)照組差值小于1個(gè)對(duì)數(shù)(log 10),表明分離病毒的核酸為RNA。CDV CL14經(jīng)氯仿、乙醚、pH 3.0的酸及60 ℃熱處理后,其TCID50與對(duì)照組差值均大于2個(gè)對(duì)數(shù),說明該病毒有囊膜,對(duì)氯仿、乙醚及酸敏感而不耐熱(具體數(shù)據(jù)未列出),以上結(jié)果符合CDV的特性。

        2.5 間接免疫熒光鑒定

        經(jīng)間接免疫熒光染色后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示,接種病毒液的 Vero 細(xì)胞漿中出現(xiàn)特異性亮綠熒光,而正常對(duì)照細(xì)胞胞漿中無特異性熒光,同時(shí)可以看到 CDV3 陽性對(duì)照的 Vero 細(xì)胞中也能看到特異性的熒光(圖4)。

        圖4 CDV CL14 株間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果A:CDV3陽性對(duì)照,B:CDV CL14株,C:正常細(xì)胞對(duì)照

        2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

        試驗(yàn)組貉子在第5天試驗(yàn)組動(dòng)物開始出現(xiàn)體溫升高現(xiàn)象,隨后伴隨著厭食、嘔吐現(xiàn)象,眼部結(jié)膜炎和胃腸道炎癥等臨床癥狀出現(xiàn)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,試驗(yàn)組貉子從第5天開始可以肛拭子檢測(cè)到病毒核酸。攻毒后第15天,對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂死后進(jìn)行大體檢剖觀察,試驗(yàn)組動(dòng)物膀胱內(nèi)壁大量出血斑,肺臟出血淤血,出現(xiàn)萎縮性壞死,胸腔積液,肝臟壞死。對(duì)照貉子表現(xiàn)正常,無上述臨床表現(xiàn)和病理變化。

        2.7H基因序列分析

        取CDV CL14株第5代細(xì)胞毒提取總RNA,應(yīng)用引物H3和H4能成功擴(kuò)增出1 879 bp 的目的片段,與預(yù)期大小一致(圖5)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、純化后,克隆到pMD18-T載體中。選取鑒定陽性重組子送公司測(cè)序。H基因序列測(cè)定結(jié)果表明,該基因全長均為1 824個(gè)核苷酸,編碼607個(gè)氨基酸。將該病毒H基因序列與GenBank中核苷酸序列經(jīng)過BLAST檢索發(fā)現(xiàn)同源性最高的均為CDVH基因序列,應(yīng)用Lasergene生物軟件中的MegAlign對(duì)CDV CL14及參考株的H基因序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn),該病毒與國內(nèi)流行的參考毒株的核苷酸和氨基酸均有較高的同源性,其中核苷酸同源性最高的為HeB(09)1株和LN-13-1株,同源性同為99.1%,而氨基酸同源性最高的為LN-13-1株,同源性為99.3%;而與美國疫苗株Onderstpoort的同源性最低,核苷酸和氨基酸的同源性分別為90.5%和90.4%。利用MEGA6.0軟件以Neighbor-joining法,對(duì)分離株以及GenBank中不同基因型的參考毒株的H基因編碼的氨基酸序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6),表明分離毒株CDV CL14株屬于Asia-1型。

        圖5 CDV CL14株H基因擴(kuò)增結(jié)果M:DNA maker,1:CDV3陽性對(duì)照,2:陰性對(duì)照,3:CDV CL株

        圖6 犬瘟熱病毒H蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹

        3 討 論

        本次研究從犬瘟熱病貉肺臟中分離出1株病毒,經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、理化特性鑒定、間接免疫熒光試驗(yàn)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)鑒定和RT-PCR等分子生物學(xué)鑒定,分離的病毒為犬瘟熱病毒,并對(duì)分離病毒H基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析,表明河北省昌黎縣毛皮動(dòng)物群體中流行的CDV屬于Asia-1型。

        H基因常被用于CDV的基因分型,已報(bào)道的有8個(gè)基因型,分別為Asia-1型,Asia-2型,Asia-3型,Europe型,European wildlife型,Arctic-like型,America-1型和America-2型,而我國流行毒株最多的為Asia-1型[7~9]。遺傳進(jìn)化分析表明,本次研究分離毒株屬于Asia-1型,為我國的流行毒株。對(duì)H蛋白的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),該分離株的H蛋白有9個(gè)N-糖基化位點(diǎn),分別位于19-21,149-151,309-311,391-393,422-424,456-458,584-586,587-589 和 603-605 位,這與之前報(bào)道的我國流行毒株保持一致[8]。

        試驗(yàn)表明,分離的病毒為強(qiáng)毒株,動(dòng)物回歸試驗(yàn)可使貉子感染并出現(xiàn)犬瘟熱典型癥狀。本次試驗(yàn)擴(kuò)增的H基因全長1 824 bp,編碼607個(gè)氨基酸,與之前報(bào)道的大小一致[10],對(duì)CDV CL14分離株的H基因核苷酸和蛋白氨基酸序列分析結(jié)果表明,該分離株與國內(nèi)的流行毒株有較高的同源性,其中核苷酸同源性最高的為HeB(09)1株和LN-13-1株,同源性同為99.1%,而氨基酸同源性最高的為LN-13-1株,同源性為99.3%,從而判斷該株病毒為我國目前流行的毒株之一。

        [1] 程悅寧,易立,司方方,等.我國毛皮動(dòng)物主要傳染病防控現(xiàn)狀及防控建議[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2013,17(1):49-54.

        [2] 李天松,王磊,王勝樂,等.不同宿主來源犬瘟熱病毒的分離及致病相關(guān)基因序列分析[J].中國獸醫(yī)雜志,2012,48(7):3-7.

        [3] 金藝鵬,劉巧榮,孫明,等.大熊貓?jiān)慈翢岵《净蚪M遺傳特征分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,48(7):1 445-1 452.

        [4] Gordon M T,Anderson D C,Sharpe P T.Canine distemper virus localised in bone cells of patients with Paget’s disease[J].Bone,1991,12(3):195-201.

        [5] 王鳳雪,閆喜軍,邵西群,等.毛皮動(dòng)物犬瘟熱RT-PCR方法的建立與應(yīng)用[J].特產(chǎn)研究,2005(4):14-17.

        [6] 程悅寧.犬瘟熱病毒SY-12株的分離鑒定及其全基因組序列測(cè)定與分析[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

        [7] Zhao J J,Yan X J,Chai X L,et al.Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of canine distemper virus strains detected from breeding foxes,raccoon dogs and minks in China[J].Veterinary microbiology,2010,140(1-2):34-42.

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        Isolation and Identification of Raccoon Dog Canine Distemper Virus Changli Isolate and Sequence Analysis ofHgene

        WANG Jian-ke1,RUI Ping2,CHENG Yue-ning1,MA Zeng-jun2,LIU Yao-zong2
        (1 Jilin Provincial Key Laboratory for Molecular Biology of Special Economic Animals,Institute of Special Animal and Plant Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun Jilin,130112;China 2 Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province, Hebei Normal University of Science & Techology;China)

        To better understand the prevalence and genetic variation of canine distemper virus (CDV) in Hebei province, we isolated a virus from raccoon dog with Vero. This virus strain, named as CDV CL14, was identified as CDV from results of morphology indirect immunofluorescence, RT-PCR and artificial infection of raccoon dogs. Cloning and phylogenetic analysis of theHgene, the results indicated CDV CL corresponds to the Asia-1 genotype and it is the prevalent strain in China. TheHgene shared higher homology with prevalent strain in China. The highest degree of nucleotide homology with HeB(09)1 strain and LN-13-1 strains was 99.1%, and the highest degree of deduced amino acids homology with LN-13-1 strain was 99.3%.

        canine distemper virus;Hgene;isolation;identification

        河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):13226609D);河北省畜牧局計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào):2011-1-19);吉林省省級(jí)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略調(diào)整引導(dǎo)資金專項(xiàng)(項(xiàng)目編號(hào):2014Y139);吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物生物制品科技創(chuàng)新中心資助研究項(xiàng)目。

        2015-06-12; 修改稿收到日期: 2015-06-24

        10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.003

        S852.65+5

        A

        1672-7983(2015)03-0012-05

        王建科(1982-),男,博士研究生,助理研究員。主要研究方向:毛皮動(dòng)物疾病防控。

        (責(zé)任編輯:朱寶昌)

        *通訊作者,男,教授,博士。主要研究方向:獸醫(yī)病原微生物學(xué)。E-mail:mzj6699@126.com。

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