王建科，芮 萍，程悅寧，馬增軍*，劉曜綜

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春，130112；2 河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

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貉源犬瘟熱病毒昌黎株的分離鑒定及其H基因序列分析

王建科1，芮 萍2，程悅寧1，馬增軍*2，劉曜綜2

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春，130112；2 河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

為了解河北省毛皮動(dòng)物犬瘟熱病毒的流行及遺傳變異情況，采用 Vero 細(xì)胞從具有犬瘟熱臨床癥狀的貉肺臟樣品中分離出一株病毒，經(jīng)過間接免疫熒光、RT-PCR和動(dòng)物回歸試驗(yàn)等鑒定，分離的病毒為犬瘟熱病毒(CDV)，命名為 CDV CL14株。對(duì)該病毒血凝蛋白H基因進(jìn)行克隆測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析表明，CDV CL14分離株屬于Asia-1型，為我國的流行毒株，H基因核苷酸及其編碼氨基酸序列與我國流行毒株有較高的同源性，其中核苷酸同源性最高的為 HeB(09)1株和 LN-13-1株，同源性同為 99.1%，而氨基酸同源性最高的為 LN-13-1株，同源性為 99.3%。

犬瘟熱病毒；H基因；分離；鑒定

犬瘟熱(Canine distemper, CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)引起的多種動(dòng)物感染的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是水貂、狐貍和貉子等毛皮動(dòng)物的主要傳染病之一，給毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1，2]。該病臨床上以雙相熱、卡他性鼻炎及隨后引起的支氣管炎、卡他性肺炎、嚴(yán)重的胃腸炎、神經(jīng)等癥狀為主要特征。CDV自然感染宿主有食肉目所有8個(gè)科，以及偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動(dòng)物，CDV自然感染的動(dòng)物范圍還有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)，其危害性也越來越大，大熊貓也有感染發(fā)病的報(bào)道[3]，甚至從患有 Paget’s 疾病的病人體內(nèi)檢測(cè)到了CDV的核酸存在[4]。

2014年8月，河北省昌黎縣某貉子養(yǎng)殖場(chǎng)的當(dāng)年生幼貉，突然出現(xiàn)了咳嗽、嘔吐、腹瀉等癥狀，個(gè)別貉子還出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀；病貉眼瞼周圍有膿性分泌物，鼻鏡干燥；動(dòng)物剖檢發(fā)現(xiàn)，脾臟腫大，膀胱黏膜有出血點(diǎn)，肺臟表面出血。本研究從病貉臟器內(nèi)分離出一株病毒，經(jīng)過鑒定為CDV，并且對(duì)其H基因進(jìn)行了克隆測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

Vero細(xì)胞、陽性對(duì)照株CDV3疫苗株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；健康貉子引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所毛皮動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地；CDV抗原檢測(cè)試紙條引自韓國BioNote, Lnc.；CDV N蛋白單克隆抗體引自VMRD公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠二抗引自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；Trizol Reagent引自Life Technologies公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，RNasin，Taq聚合酶，dNTPs，DNA Marker，pMD18-T引自 TaKaRa公司。

1.2 樣品處理

采集河北省昌黎縣某貉場(chǎng)疑似犬瘟熱的貉子病料5例，經(jīng)CDV抗原試紙條檢測(cè)為陽性，無菌取死亡貉子肺臟樣品加MEM培養(yǎng)基制成1∶10的乳劑，8 000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，置于-80 ℃ 冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒分離

將上述處理好的病料樣品接種于長成單層的Vero細(xì)胞，于37 ℃ CO2的體積分?jǐn)?shù)為0.05條件下培養(yǎng)，并逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)；如無CPE連續(xù)盲傳培養(yǎng)，至第4代仍無CPE可認(rèn)定為陰性。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。陽性培養(yǎng)物凍融3次后于 -80 ℃ 冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒電鏡鑒定

取已出現(xiàn)CPE的第4代病毒Vero細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次后收毒，5 000 r/min離心10 min，取上清液用質(zhì)量濃度為20 g/L的磷鎢酸負(fù)染進(jìn)行電鏡觀察。

1.5 RT-PCR鑒定

參照王鳳雪等[5]的方法，引物對(duì)H1：5′-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3′和H2：5′-CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，采用Trizol試劑提取病毒RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增，對(duì)分離病毒進(jìn)行分子生物學(xué)試驗(yàn)鑒定。

1.6 病毒理化性質(zhì)鑒定

對(duì)分離病毒進(jìn)行理化學(xué)特征鑒定。參考程悅寧[6]的方法對(duì)分離株病毒進(jìn)行核酸型、氯仿、乙醚、pH 3.0耐酸及60 ℃耐熱試驗(yàn)鑒定。同時(shí)設(shè)立不作處理的正常對(duì)照組。

1.7 間接免疫熒光鑒定

向長成單層的Vero細(xì)胞接CDV CL14株第4代病毒，48 h后用預(yù)冷的質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛溶液室溫固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；加入用PBS 100倍稀釋的CDV單抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌3次，每次5 min；加入1 000倍稀釋的二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌3次，每次5 min；熒光顯微鏡下檢查有無特異性的熒光。同時(shí)設(shè)置CDV3疫苗株對(duì)照。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

選擇CDV中和抗體于 l∶2的3月齡健康貉子10只，隨機(jī)分為2組，每組5只。人工感染組5只經(jīng)皮下注射，攻毒劑量為2 mL(2×104.5TCID50)；對(duì)照組5只，相同方式注射2 mL Vero細(xì)胞培養(yǎng)物，分別隔離觀察飼養(yǎng)15 d，每天觀察臨床癥狀；并于攻毒第3天開始收集攻毒貉子肛拭子；試驗(yàn)第15天撲殺全部貉子進(jìn)行大體解剖觀察。

1.9H基因序列分析

參照ZHAO JJ et al[7]建立的方法，略作改進(jìn)進(jìn)行CDVH基因的擴(kuò)增和測(cè)序，引物對(duì)H3：5′-TTAGGGCTCAGGTAGTCCA-3′和H4：5′-CTAAGKCCAATTGARATGTGT-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，RNA提取及RT-PCR參考文獻(xiàn)記載的方法進(jìn)行，對(duì)測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Lasergene生物軟件的SeqMan進(jìn)行拼接，對(duì)H基因和GenBank中登錄的CDV參考毒株進(jìn)行同源性比較，并用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離

應(yīng)用 Vero 細(xì)胞對(duì)貉肺臟樣品進(jìn)行病毒分離。在接毒細(xì)胞的前2代未見明顯病變，盲傳至第3代時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)拉網(wǎng)、脫落以及細(xì)胞融合成巨細(xì)胞等出現(xiàn)典型的CDV細(xì)胞病變(圖 1)。結(jié)果從送檢的樣品中分離獲得1株CDV病毒，命名為CDV CL14株。

2.2 病毒電鏡鑒定

取分離毒CDV CL14株第4代細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)過處理后在透射電鏡下可見圓形病毒粒子，有囊膜、可以看到纖突，該病毒粒子直徑大約300 nm(圖2)，具有典型的犬瘟熱病毒粒子的形態(tài)特征。

2.3 RT-PCR

取發(fā)病貉子的肺臟提取總RNA，應(yīng)用引物H1和H2能成功擴(kuò)增出335 bp的目的片段，與預(yù)期大小一致的。PCR結(jié)果驗(yàn)證了此貉子感染了CDV。圖3為病貉肺臟RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。

圖3 CDV CL14株RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DNA maker，1：CDV3陽性對(duì)照，2：CDV CL株，3：陰性對(duì)照

2.4 病毒的理化性質(zhì)鑒定

CDV CL14株經(jīng)FUDR處理后其TCID50與對(duì)照組差值小于1個(gè)對(duì)數(shù)(log 10)，表明分離病毒的核酸為RNA。CDV CL14經(jīng)氯仿、乙醚、pH 3.0的酸及60 ℃熱處理后，其TCID50與對(duì)照組差值均大于2個(gè)對(duì)數(shù)，說明該病毒有囊膜，對(duì)氯仿、乙醚及酸敏感而不耐熱(具體數(shù)據(jù)未列出)，以上結(jié)果符合CDV的特性。

2.5 間接免疫熒光鑒定

經(jīng)間接免疫熒光染色后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，接種病毒液的 Vero 細(xì)胞漿中出現(xiàn)特異性亮綠熒光，而正常對(duì)照細(xì)胞胞漿中無特異性熒光，同時(shí)可以看到 CDV3 陽性對(duì)照的 Vero 細(xì)胞中也能看到特異性的熒光(圖4)。

圖4 CDV CL14 株間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果A：CDV3陽性對(duì)照，B：CDV CL14株，C：正常細(xì)胞對(duì)照

2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

試驗(yàn)組貉子在第5天試驗(yàn)組動(dòng)物開始出現(xiàn)體溫升高現(xiàn)象，隨后伴隨著厭食、嘔吐現(xiàn)象，眼部結(jié)膜炎和胃腸道炎癥等臨床癥狀出現(xiàn)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組貉子從第5天開始可以肛拭子檢測(cè)到病毒核酸。攻毒后第15天，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂死后進(jìn)行大體檢剖觀察，試驗(yàn)組動(dòng)物膀胱內(nèi)壁大量出血斑，肺臟出血淤血，出現(xiàn)萎縮性壞死，胸腔積液，肝臟壞死。對(duì)照貉子表現(xiàn)正常，無上述臨床表現(xiàn)和病理變化。

2.7H基因序列分析

取CDV CL14株第5代細(xì)胞毒提取總RNA，應(yīng)用引物H3和H4能成功擴(kuò)增出1 879 bp 的目的片段，與預(yù)期大小一致(圖5)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、純化后，克隆到pMD18-T載體中。選取鑒定陽性重組子送公司測(cè)序。H基因序列測(cè)定結(jié)果表明，該基因全長均為1 824個(gè)核苷酸，編碼607個(gè)氨基酸。將該病毒H基因序列與GenBank中核苷酸序列經(jīng)過BLAST檢索發(fā)現(xiàn)同源性最高的均為CDVH基因序列，應(yīng)用Lasergene生物軟件中的MegAlign對(duì)CDV CL14及參考株的H基因序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，該病毒與國內(nèi)流行的參考毒株的核苷酸和氨基酸均有較高的同源性，其中核苷酸同源性最高的為HeB(09)1株和LN-13-1株，同源性同為99.1%，而氨基酸同源性最高的為LN-13-1株，同源性為99.3%；而與美國疫苗株Onderstpoort的同源性最低，核苷酸和氨基酸的同源性分別為90.5%和90.4%。利用MEGA6.0軟件以Neighbor-joining法，對(duì)分離株以及GenBank中不同基因型的參考毒株的H基因編碼的氨基酸序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，表明分離毒株CDV CL14株屬于Asia-1型。

圖5 CDV CL14株H基因擴(kuò)增結(jié)果M：DNA maker，1：CDV3陽性對(duì)照，2：陰性對(duì)照，3：CDV CL株

圖6 犬瘟熱病毒H蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討 論

本次研究從犬瘟熱病貉肺臟中分離出1株病毒，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、理化特性鑒定、間接免疫熒光試驗(yàn)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)鑒定和RT-PCR等分子生物學(xué)鑒定，分離的病毒為犬瘟熱病毒，并對(duì)分離病毒H基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，表明河北省昌黎縣毛皮動(dòng)物群體中流行的CDV屬于Asia-1型。

H基因常被用于CDV的基因分型，已報(bào)道的有8個(gè)基因型，分別為Asia-1型，Asia-2型，Asia-3型，Europe型，European wildlife型，Arctic-like型，America-1型和America-2型，而我國流行毒株最多的為Asia-1型[7～9]。遺傳進(jìn)化分析表明，本次研究分離毒株屬于Asia-1型，為我國的流行毒株。對(duì)H蛋白的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該分離株的H蛋白有9個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別位于19-21，149-151，309-311，391-393，422-424，456-458，584-586，587-589 和 603-605 位，這與之前報(bào)道的我國流行毒株保持一致[8]。

試驗(yàn)表明，分離的病毒為強(qiáng)毒株，動(dòng)物回歸試驗(yàn)可使貉子感染并出現(xiàn)犬瘟熱典型癥狀。本次試驗(yàn)擴(kuò)增的H基因全長1 824 bp，編碼607個(gè)氨基酸，與之前報(bào)道的大小一致[10]，對(duì)CDV CL14分離株的H基因核苷酸和蛋白氨基酸序列分析結(jié)果表明，該分離株與國內(nèi)的流行毒株有較高的同源性，其中核苷酸同源性最高的為HeB(09)1株和LN-13-1株，同源性同為99.1%，而氨基酸同源性最高的為LN-13-1株，同源性為99.3%，從而判斷該株病毒為我國目前流行的毒株之一。

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Isolation and Identification of Raccoon Dog Canine Distemper Virus Changli Isolate and Sequence Analysis ofHgene

WANG Jian-ke1,RUI Ping2，CHENG Yue-ning1,MA Zeng-jun2,LIU Yao-zong2
(1 Jilin Provincial Key Laboratory for Molecular Biology of Special Economic Animals,Institute of Special Animal and Plant Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun Jilin,130112;China 2 Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine in Hebei Province, Hebei Normal University of Science & Techology;China)

To better understand the prevalence and genetic variation of canine distemper virus (CDV) in Hebei province, we isolated a virus from raccoon dog with Vero. This virus strain, named as CDV CL14, was identified as CDV from results of morphology indirect immunofluorescence, RT-PCR and artificial infection of raccoon dogs. Cloning and phylogenetic analysis of theHgene, the results indicated CDV CL corresponds to the Asia-1 genotype and it is the prevalent strain in China. TheHgene shared higher homology with prevalent strain in China. The highest degree of nucleotide homology with HeB(09)1 strain and LN-13-1 strains was 99.1%, and the highest degree of deduced amino acids homology with LN-13-1 strain was 99.3%.

canine distemper virus;Hgene;isolation;identification

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：13226609D)；河北省畜牧局計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2011-1-19)；吉林省省級(jí)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略調(diào)整引導(dǎo)資金專項(xiàng)(項(xiàng)目編號(hào)：2014Y139)；吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物生物制品科技創(chuàng)新中心資助研究項(xiàng)目。

2015-06-12; 修改稿收到日期: 2015-06-24

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2015.03.003

S852.65+5

A

1672-7983(2015)03-0012-05

王建科(1982-)，男，博士研究生，助理研究員。主要研究方向：毛皮動(dòng)物疾病防控。

(責(zé)任編輯：朱寶昌)

*通訊作者，男，教授，博士。主要研究方向：獸醫(yī)病原微生物學(xué)。E-mail:mzj6699@126.com。