龍 毅，袁吉虎，許楊珊，楊武德

（貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550002）

石韋為蕨類植物水龍骨科植物石韋〔Pyrrosia lingua（Thunb．）Farwell〕的全草，別名有柄石韋、刀尖藥、石茶葉，其性甘味苦，微寒，歸肺、膀胱經(jīng)，具有清肺泄熱、利水通淋、清熱止血之功效。主要用于淋病、小便不通、出血及肺熱喘咳，屬利水滲濕藥［1］。研究發(fā)現(xiàn)，石韋對(duì)因化療及放療引起的白血球減少癥狀有明顯的升白作用［2］。梅志潔等［3］將小鼠隨機(jī)分成CTX（環(huán)磷酰胺）組、CTX 加石韋大棗小劑量組、CTX 加石韋大棗中劑量組、CTX 加石韋大棗大劑量組，分別用生理鹽水和石韋大棗合劑不同劑量連續(xù)灌喂，連續(xù)觀察對(duì)試驗(yàn)小鼠白細(xì)胞、非特異性免疫功能和粒－單系集落形成單位（CFU－GM）的影響，結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺加石韋大棗合劑大劑量、中劑量組白細(xì)胞下降程度明顯低于單純環(huán)磷酰胺組（P＜0．05），石韋大棗合劑能顯著對(duì)抗CTX 導(dǎo)致的非特異性免疫功能和粒－單系集落形成單位減少。表明，石韋大棗合劑能明顯增強(qiáng)單核－巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能，提高機(jī)體免疫能力，對(duì)人體無(wú)毒副作用，能明顯對(duì)抗環(huán)磷酰胺所致的白細(xì)胞減少。石韋在貴州應(yīng)用廣泛，是貴州各民族常用藥，黔產(chǎn)石韋有明顯的地區(qū)特色和藥用價(jià)值，研究黔產(chǎn)石韋的升白作用有顯著的經(jīng)濟(jì)意義及科學(xué)價(jià)值。因此，筆者所在研究組進(jìn)行了有柄石韋的不同極性部位萃取物對(duì)小鼠白細(xì)胞影響的研究。中藥的水溶液中通常含有氨基酸［4－5］，氨基酸對(duì)于人體營(yíng)養(yǎng)有極其重要的作用，具有調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能、增強(qiáng)免疫力的功效。谷氨酸在醫(yī)學(xué)上主要用于治療肝性昏迷，甘氨酸可用作醫(yī)學(xué)微生物和生物化學(xué)氨基酸代謝研究的用藥以及金霉素緩沖劑、抗帕金森氏病藥物L(fēng)－多巴、維生素B6以及蘇氨酸等氨基酸的合成原料。丙氨酸可預(yù)防腎結(jié)石、協(xié)助葡萄糖代謝，有助緩和低血糖，改善身體能量。亮氨酸可配制氨基酸輸液及綜合氨基酸制劑，可作降血糖劑及植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑。公認(rèn)的具有顯著升白效果的中成藥——阿膠中就含高達(dá)18 種氨基酸成分［6］。植物氨基酸提高白細(xì)胞數(shù)的作用也早有研究證實(shí)［7］。筆 者 等 采 用PITC 作 為 衍 生 試 劑［8］，采 用RP－HPLC梯度洗脫法同時(shí)對(duì)石韋中氨基酸進(jìn)行分析，以期為黔產(chǎn)石韋提高白細(xì)胞數(shù)的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津／lC－20AT），色 譜 柱 為 Welchrom C18 （250 mm×4．6mm，5μm），粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），光學(xué)顯微鏡（CKX－41，OLYMPUS）。

1．1．2 藥材 小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)對(duì)比試驗(yàn)所用藥材采自貴州凱里市雷山縣，鑒定為石韋屬水龍骨科蕨類植物石韋全草。氨基酸成分分析試驗(yàn)所用石韋藥材粉末購(gòu)自貴州百靈制藥廠。氨基酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：100080－200707，包括Leu，Glu，Gly，Ala），PITC（純度標(biāo)示量為99%），購(gòu)自貴州銀華科技有限公司，其他試劑均為分析純。

1．1．3 小白鼠 昆明種，體重18～22g，雌雄各半，清潔級(jí)。由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院提供，合格證號(hào)：SCXK（黔）2002－001。

1．2 黔產(chǎn)石韋不同極性部位萃取物的制備

將所有采集的石韋全株陰干后除去雜質(zhì)并粉碎成粗粉備用。

1）醇提物。將有柄石韋的粗粉用75%乙醇提取3次，合并提取液，水浴60℃揮發(fā)，得流浸膏，提物備用。

2）水提物。將藥材醇提后的藥渣陰干，于溫度約70℃熱水中煎煮3 次，合并濾液至蒸發(fā)皿中蒸干，放入干燥箱內(nèi)干燥，備用。

3）石油醚部位。將醇提物流浸膏用溫水（溫度約為40℃）溶解，用石油醚重復(fù)萃取至無(wú)色即可，合并液，濃縮，置水浴鍋上蒸干，備用。

4）乙酸乙酯部位。將石油醚萃取后的水溶液于水浴鍋上揮發(fā)掉殘余的石油醚后，用乙酸乙酯萃取剩余溶液，合并液，濃縮，干燥備用。

5）正丁醇部位。將乙酸乙酯萃取后的水溶液于水浴鍋上揮發(fā)掉殘余的乙酸乙酯后，用正丁醇萃取，合并液，濃縮，干燥備用。

6）剩余部位。將正丁醇萃取完成后的剩余部位轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上濃縮，待全部水分蒸干后放進(jìn)干燥箱內(nèi)干燥后備用。

1．3 黔產(chǎn)石韋提取物對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響

取小白鼠140只，雌雄各半，隨機(jī)分為14組，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（灌胃阿膠，3g／kg）和給藥組（分別為醇提物大劑量組、小劑量組，水提物大劑量組、小劑量組，石油醚萃取物大劑量組、小劑量組，乙酸乙酯萃取物大劑量組、小劑量組，正丁醇萃取物大劑量組、小劑量組，剩余部位大劑量組、小劑量組；以上各組劑量分別為7g／kg、2．0g／kg，

7g／kg、2．0g／kg，1．0g／kg、0．3g／kg，0．9g／k、0．3g／kg，1．8 g／kg、0．6 g／kg 和3．3 g／kg、1．1g／kg）。分別對(duì)各組小白鼠進(jìn)行斷尾取血40μL，加入盛有280μL白細(xì)胞稀釋液的具塞離心管中，搖均，靜置。取10μL，滴于白細(xì)胞計(jì)數(shù)板，光學(xué)顯微鏡低倍鏡下觀察，記錄計(jì)數(shù)板上第二象限和第四象限上的白細(xì)胞數(shù)，以兩次計(jì)數(shù)的平均值表示小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)基礎(chǔ)值。取血后第2天開(kāi)始給藥，空白對(duì)照組以0．1mL／10g灌胃生理鹽水，陽(yáng)性組以0．3g／mL的阿膠混懸液按0．1mL／10g灌胃給藥，給藥組按相應(yīng)劑量以0．1mL／10g灌胃給藥，連續(xù)10d，每天1次。第11天分別對(duì)各組小白鼠進(jìn)行白細(xì)胞測(cè)定，方法同上。記錄白細(xì)胞數(shù)。

1．4 黔產(chǎn)石韋氨基酸成分分析

1） 色譜條件。色譜柱為 Welchrom C18（250mm×4．6mm，5μm），流動(dòng)相A 為0．1mol／L的醋酸鈉緩沖液（以醋酸鈉pH6．5）－乙腈（93∶7），流動(dòng)相B為乙腈－水（4∶1），檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，柱溫為30℃，流速為1．0mL／min，進(jìn)樣量為5μL，進(jìn)行梯度洗脫。

2）對(duì)照品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取4種氨基酸適量，精密稱定，加入0．1mol／L鹽酸溶液制成每1mL分別含谷氨酸（Glu）0．123mg、甘氨酸（Gly）0．079 2 mg、丙氨酸（Ala）0．065 mg、亮氨酸（Leu）0．072mg溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液1mL、2mL、3mL、5mL和10 mL，分別置25 mL 量瓶中，加入0．1 mol／L PITC－乙腈溶液及1 mol／L 三乙胺－乙腈溶液至刻度，混勻。取溶液10mL，加入正己烷15mL，放置20min，取下層溶液，微孔濾膜（0．45μm）過(guò)濾，得系列濃度溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣色譜檢測(cè)，測(cè)定峰面積。分別以氨基酸對(duì)照品峰面積y 為縱坐標(biāo)，4種氨基酸對(duì)照品濃度x（μg／mL）為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，計(jì)算回歸方程。

3）供試品溶液的制備。稱取研勻后樣品粉末0．6g，精密稱定，置安瓿瓶中，加入水解液（含0．5%苯酚的50%鹽酸溶液）10mL，熔封安瓿，用紗布包裹，于150℃水解1h，放冷，過(guò)濾，并用水清洗濾渣，合并濾液和洗液于蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?．1mol／L鹽酸溶液15mL 分3次溶解洗滌并轉(zhuǎn)移至25mL 容量瓶中，加入0．1mol／L PITC－乙腈溶液［9］及mol／L三乙胺－乙腈溶液各2．5mL，混勻，室溫放置1 h，加50% 乙腈溶液至刻度。取溶液10mL，加入正己烷15mL，放置20 min，取下層溶液，微孔濾膜（0．45μm）過(guò)濾即得。

4）樣品含量測(cè)定。取供試品溶液5 mL，置于25mL 量瓶中，加入0．1mol／L PITC－乙腈溶液及1mol／L三乙胺－乙腈溶液至刻度，混勻。取溶液10mL，加入正己烷15 mL，放置20 min，取下層溶液，微孔濾膜（0．45μm）過(guò)濾所得溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣色譜條件，測(cè)定峰面積，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取相應(yīng)濃度。

1．5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同極性部位的萃取率

由表1可知，不同極性部位的萃取率差異不大。其中，萃取后剩余部位的萃取率最高，達(dá)4．73%；正丁醇部位其次，為2．51%；石油醚部位和乙酸乙酯部位的萃取率較低，分別為1．53%和1．36。

2．2 不同極性部位萃取物對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響

由表2可知，與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組能明顯提高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)；水提物大劑量組、小劑量組，醇提物大劑量組、小劑量組，正丁醇大劑量組、小劑量組和剩余部位大劑量組、小劑量組均能明顯提高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)。其中，陽(yáng)性對(duì)照組、水提物大劑量組、水提物小劑量組、醇提物大劑量組、正丁醇大劑量組、正丁醇小劑量組和剩余部位大劑量組達(dá)0．001顯著水平；醇提物小劑量組和剩余部位小劑量組達(dá)0．01顯著水平。石油醚大劑量組、小劑量組、乙酸乙酯大劑量組和小劑量組對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯影響。其中，水提取物的效果最明顯。

表1 黔產(chǎn)石韋不同提取部位的萃取率Table 1 Extraction rate of different parts of P．petiolosa

表2 黔產(chǎn)石韋各極性萃取物給藥后小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)Table 2 White cell count in peripheral blood of mice injected with extracts with different polarity

表3 黔產(chǎn)石韋中4種氨基酸的含量Table 3 Contents of four kinds of amino acids inP．petiolosa

2．3 黔產(chǎn)石韋氨基酸成分

目前，較少有涉及石韋中氨基酸的成分及含量的研究，本研究表明，黔產(chǎn)石韋中至少含有4種氨基酸，其對(duì)應(yīng)的含量見(jiàn)表3，各種氨基酸含量順序?yàn)楣劝彼幔靖拾彼幔颈彼幔玖涟彼?，這與劉恒霞等在5種蕨類植物中發(fā)現(xiàn)的氨基酸含量順序［10］基本吻合。這4種氨基酸中，谷氨酸的含量最高，因此可以推測(cè)，谷氨酸是黔產(chǎn)石韋水提取物提高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的關(guān)鍵成分。但與劉恒霞等在其他蕨類植物中的發(fā)現(xiàn)不同，黔產(chǎn)石韋中的甘氨酸含量幾乎是丙氨酸或亮氨酸含量的兩倍。這一特殊現(xiàn)象說(shuō)明，甘氨酸很可能對(duì)提高小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)起協(xié)同作用。

3 結(jié)論與討論

本研究采用溶劑法提取了黔產(chǎn)石韋的不同極性化學(xué)部位，并通過(guò)常規(guī)白細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)了不同極性化學(xué)部位對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黔產(chǎn)石韋水提部位、醇提部位、正丁醇部位、剩余部位這些極性較大部位均對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)有明顯升高作用，而石油醚、乙酸乙酯部位這兩個(gè)極性較小部位沒(méi)有明顯升白效果，其中，水提組分升白效果最為顯著。參考過(guò)去的研究工作，氨基酸組分被猜測(cè)為水提部位中主要起升白效果的成分，因此本研究組嘗試應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的HPLC 方法定量分析黔產(chǎn)石韋中氨基酸成分組成及含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黔產(chǎn)石韋中至少含有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和亮氨酸4種氨基酸。4 種氨基酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3．0%。其中以谷氨酸含量最高。

居霞筠研究組的工作顯示［11］，谷氨酸的鋰鹽具有明顯的升高小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)量的作用，除了鋰離子的升白作用外，很可能谷氨酸根離子也參與了作用。因此，結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)谷氨酸是黔產(chǎn)石韋水提取物中起到升白效果的關(guān)鍵成分。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，甘氨酸含量幾乎是丙氨酸或亮氨酸含量的兩倍，這與過(guò)去在其他的蕨類植物中發(fā)現(xiàn)的3種氨基酸含量接近的結(jié)果有明顯區(qū)別。過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸具有細(xì)胞保護(hù)的作用［12］。在黔產(chǎn)石韋的升白過(guò)程中，很可能谷氨酸和甘氨酸均有參與。谷氨酸刺激新的白細(xì)胞生成，而甘氨酸則保護(hù)已有的白細(xì)胞不被機(jī)體或外來(lái)物質(zhì)破壞而發(fā)生凋亡，即黔產(chǎn)石韋的升白效果是谷氨酸和甘氨酸2種氨基酸的協(xié)同作用。

與過(guò)去的研究相比，本研究明確了黔產(chǎn)有柄石韋的各極性組分升白效果的區(qū)別，推測(cè)藥物分子極性很可能會(huì)影響藥材的升白效果，并且詳細(xì)研究了黔產(chǎn)石韋的氨基酸成分，推斷了谷氨酸對(duì)于黔產(chǎn)石韋升白效果的關(guān)鍵作用。對(duì)黔產(chǎn)石韋升白效果的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

［1］ 陰 健，顧海鷗，何希榮，等．中藥現(xiàn)代臨床與應(yīng)用Ⅱ［M］．北京：中國(guó)古籍出版社，1995：104－106．

［2］ 程顯隆，肖新月，鄒秦文，等．柱前衍生化HPLC 法同時(shí)測(cè)定阿膠中4種主要氨基酸的含量［J］．藥物分析雜志，2008，28（12）：1997．

［3］ 梅志潔，李文海，鄧常青．石韋大棗合劑治療環(huán)磷酰胺所致小鼠白細(xì)胞減少癥的實(shí)驗(yàn)研究［J］．湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，22（2）：33－34．

［4］ 袁鑄人．論中藥成分中的氨基酸分析［J］．中成藥，1989，11（6）：46－47．

［5］ 于永輝，籍國(guó)霞，臧恒昌．中藥中氨基酸分析測(cè)定技術(shù)研究進(jìn)展［J］．食品與藥品，2014，16（5）：371－373．

［6］ 金在久．阿膠化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理研究進(jìn)展［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（12）：1301－1302．

［7］ 劉滌塵，胥家紅，薛 雁．田參氨基酸治療88例白細(xì)胞減少癥的療效觀察［J］．臨床醫(yī)學(xué)雜志，1988，4（8）：150．

［8］ 曾文珊，廖海明，楊昭鵬，等．重組人甲狀旁腺激素1－34的氨基酸組成分析［J］．藥物生物技術(shù)，2003，10（2）：108．

［9］ 李 沽，黿玉懿．石韋有效成分的高效液相色譜測(cè)定［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992，27（2）：153．

［10］ 劉恒霞，余 鵬，王慧忠．高效液相色譜測(cè)定蕨類植物中氨基酸含量［J］．氨基酸和生物資源，2011，33（3）：30－33．

［11］ 居霞筠，孫以方．谷氨酸鋰對(duì)動(dòng)物白細(xì)胞影響的研究［J］．蘭州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1992，18（3）：169－171．

［12］ 袁小娟，吳希茜．甘氨酸的生理作用與應(yīng)用［J］．飲料工業(yè)，2011，14（7）：5－7．