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        2種復(fù)方制劑對(duì)中華鱉非特異性免疫功能的作用效果

        2015-04-11 08:39:02周冬仁羅毅志葉雪平潘曉藝陳建明沈斌乾
        貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年6期
        關(guān)鍵詞:散組金蓮溶菌酶

        周冬仁,羅毅志,葉雪平,潘曉藝,陳建明,沈斌乾

        (浙江省淡水水產(chǎn)研究所,浙江 湖州313001)

        中華鱉分布于中國(guó)、日本、越南北部、韓國(guó)、泰國(guó)等,浙江地區(qū)中華鱉養(yǎng)殖主要以日本品系及太湖品系為主。中華鱉生長(zhǎng)緩慢,抗病力強(qiáng),對(duì)自然生活環(huán)境要求較高。在人工養(yǎng)殖條件下,受到高密度、水質(zhì)惡化、溫室等條件的影響,鱉抗病力下降,病害嚴(yán)重。目前,腮腺炎、白底板、胃穿孔、紅底板等疾病在中華鱉生產(chǎn)中較為常見(jiàn)[1]。養(yǎng)殖戶高頻度、高劑量使用各類(lèi)化學(xué)藥物和抗生素,使病害得到一定程度的扼制,但對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)品質(zhì)量安全造成了負(fù)面影響,不利于中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此,在探索治療手段的同時(shí),提高中華鱉自身的免疫力和抗病力,也是解決中華鱉病害防控的有效途徑之一。

        中華鱉屬于低等爬行綱動(dòng)物,沒(méi)有完善的免疫系統(tǒng),非特異性免疫在系統(tǒng)發(fā)育上比特異性免疫早,與高等脊椎動(dòng)物相比,中華鱉在防御疾病時(shí)更依賴(lài)于非特異性免疫。中華鱉的非特異性免疫功能不僅是防御疾病的第一道屏障,更在整個(gè)免疫系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[2]。目前,用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的免疫增強(qiáng)劑有甘草多糖、酵母細(xì)胞壁、脂多糖、黃芪多糖、穿心蓮提取物、半胱胺等。中草藥提取物及多糖能增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的非特異性免疫功能,作為免疫增強(qiáng)劑目前已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[3]。覃川杰等[4]研究表明,茯苓多糖對(duì)中華鱉的非特異性免疫功能有增強(qiáng)作用。孟兆娜等[5]研究表明,復(fù)方中藥添加劑可以增強(qiáng)鏡鯉血清轉(zhuǎn)氨酶及紅細(xì)胞抗氧化酶活性。施偉達(dá)等[6]研究表明,植物免疫增強(qiáng)劑對(duì)中華鱉肝臟SOD和CAT 酶活性的改善有明顯作用。為評(píng)價(jià)芪草多糖、金蓮免疫散復(fù)方制劑對(duì)中華鱉非特異性免疫功能的影響,筆者于2013年年末在湖州中湖農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司進(jìn)行了2種復(fù)方制劑對(duì)中華鱉幾種非特異性免疫功能的影響試驗(yàn),以期為中草藥復(fù)方制劑在中華鱉養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 中華鱉及飼養(yǎng)池

        試驗(yàn)中華鱉為孵出的同一批稚鱉。在同一個(gè)溫室大棚內(nèi)隨機(jī)選取9個(gè)條件相同的飼養(yǎng)池,每池放養(yǎng)1 000只。每個(gè)飼養(yǎng)池面積25m2,池深1.2m,池底呈圓鍋底狀,中間為排污口,水深0.7 m,中央設(shè)8m2的石棉瓦投食臺(tái)。

        1.2 中草藥免疫制劑

        芪草多糖:以黃芪多糖、甘草多糖、金銀花為主要原料配制。金蓮免疫散:以金銀花、穿心蓮、大青葉和虎杖等的提取物為主要原料配制。將原料70℃烘干12h,粉碎至80目,按配方比例配制后混勻,由浙江省淡水水產(chǎn)研究所生物制劑廠提供。

        1.3 飼養(yǎng)管理

        隨機(jī)將9個(gè)飼養(yǎng)池分為3組,對(duì)照組:飼喂商品稚鱉飼料(CP47);芪草多糖組:飼喂商品稚鱉飼料+芪草多糖2g/kg;金蓮免疫散組:飼喂商品稚鱉飼料+金蓮免疫散2g/kg。中華鱉放養(yǎng)后,先用商品稚鱉飼料馴食3 周后正式試驗(yàn),試驗(yàn)期60d。投喂飼料均為現(xiàn)用現(xiàn)配的軟顆粒,開(kāi)始時(shí)粒徑為1.5mm,30d后粒徑為2mm。每天喂食2次,試驗(yàn)初期投飼率約為體重的6%,30d后降為4%。試驗(yàn)期間,每周從中間排污口少量排出污水,并加注新水,換水約10%。水溫控制在31℃左右。

        1.4 血清采集及指標(biāo)測(cè)定

        試驗(yàn)61d時(shí)每池隨機(jī)撈取中華鱉3只,用丁香酚麻醉后擦干體表水分,用止血鉗拉住頭部,手術(shù)剪剪開(kāi)頸部血管,采取血液儲(chǔ)存于采血管內(nèi),于37℃放置2h,待血清完全析出后置于4℃冰箱中備用。

        血清超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性:采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)和堿性磷酸酶(AKP)活性:用試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)測(cè)定。溶菌酶(Lysozyme)活性:溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于SIGMA 公司,用0.1 mol/L PBS 將微球菌(南京建成生物技術(shù)研究所)配制成0.2mg/mL 菌懸液,每個(gè)樣品取血清0.05mL加入到3.0mL 菌懸液中混勻,立即在550nm 下測(cè)定A0值;然后在28℃水浴中溫育30min,置于4℃冰浴8 min 終止反應(yīng),再測(cè)定550nm下的A 值計(jì)算溶菌酶活性。

        溶菌酶活性=(A0-A)/A。

        1.5 抗菌力測(cè)定

        腹腔注射嗜水氣單胞菌菌液濃度為1×109cfu/mL,每只中華鱉注射劑量為0.1 mL,放養(yǎng)于同樣規(guī)格的缸中,每天觀察死亡情況,觀察15d,統(tǒng)計(jì)死亡率,計(jì)算攻毒存活率。每個(gè)平行試驗(yàn)做3組,每組15只。

        攻毒存活率=(1-死亡數(shù)/總數(shù))×100%。

        1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

        試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。用SPSS11.5 軟 件 進(jìn) 行 單 因 子 方 差 分 析(One-way ANOVA),檢驗(yàn)不同組間各指標(biāo)是否存在顯著性差異,若有顯著差異(P<0.05),則作Duncan 氏多重比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1非特異性免疫酶的活性

        從表1看出,中華鱉的堿性磷酸酶活性金蓮免疫散組為8.44 U/mL,顯著高于對(duì)照組;芪草多糖組為7.79U/mL,與對(duì)照組和金蓮免疫散組間差異均不顯著。超氧化物歧化酶活性金蓮免疫散組、芪草多糖組分別為112.88 U/mL 和116.54 U/mL,均顯著高于對(duì)照組,金蓮免疫散組與芪草多糖組間差異不顯著。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性各組間差異不顯著。溶菌酶活性金蓮免疫散組、芪草多糖組均為0.85IU/mL,均顯著高于對(duì)照組,金蓮免疫散組與芪草多糖組間差異不顯著。

        表1 試驗(yàn)各組中華鱉非特異性免疫酶的活性Table 1 Effect of two compound preparations on nonspecific immune enzyme activity of T.Sinensis

        表2 試驗(yàn)各組中華鱉攻毒15d內(nèi)的存活率Table 2 Survival rate of different treatments within 15dof T.Sinensis

        2.2 抗菌力

        從表2看出,金蓮免疫散組中華鱉15d內(nèi)的平均存活率為71.11%,芪草多糖組為68.89%,對(duì)照組為55.33%,金蓮免疫散組、芪草多糖組分別比對(duì)照組高15.78百分點(diǎn)和13.56百分點(diǎn),但各組間差異不顯著。

        3 結(jié)論與討論

        1)超氧化物歧化酶(SOD)是一種源于生命體的活性物質(zhì),能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì),是反映動(dòng)物機(jī)體非特異性免疫功能的重要生理指標(biāo)。超氧化物歧化酶廣泛存在于生物體內(nèi),是一切需氧有機(jī)體清除超氧陰離子自由基、保護(hù)機(jī)體免受傷害的一種關(guān)鍵金屬酶,其活性與動(dòng)物的免疫水平密切相關(guān),是重要的抗氧化酶之一[7]。試驗(yàn)結(jié)果表明,在飼料中添加復(fù)方中草藥制劑后,中華鱉血清中超氧化物歧化酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05),但金蓮免疫散組和芪草多糖組間差異不顯著(P>0.05)。

        2)溶菌酶(Lysozyme)又稱(chēng)胞壁質(zhì)酶(muramidase)或N-乙 酰 胞 壁 質(zhì) 聚 糖 水 解 酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶[8]。主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁,使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解,溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合,與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽,使病毒失活[9]。因此,該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用,測(cè)定中華鱉的溶菌酶活性,可以在一定程度上反映其非特異性體液免疫狀態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果表明,飼料中添加復(fù)方制劑金蓮免疫散、芪草多糖能顯著(P<0.05)提高溶菌酶的活性。

        3)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種過(guò)氧化物分解酶。趙燕等[10]研究表明,口服半胱胺能提高中華鱉谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性。王宏芳等[11]研究表明,松茸多糖能提高小鼠血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性。試驗(yàn)結(jié)果表明,金蓮免疫散和芪草多糖復(fù)方制劑對(duì)中華鱉谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性無(wú)顯著影響,具體原因有待于進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

        4)堿性磷酸酶(AKP)是一組同功酶,可作為判斷水產(chǎn)動(dòng)物免疫能力的參考指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明,金蓮免疫散能顯著提高中華鱉的堿性磷酸酶活性,芪草多糖也能提高其活性。與劉巖等[12]用甘露糖醛酸多糖注射對(duì)蝦,王明華等[13]用中草藥煎液投喂日本沼蝦的結(jié)果一致。表明,金蓮免疫散、芪草多糖對(duì)中華鱉具有免疫增強(qiáng)作用。

        5)試驗(yàn)結(jié)果表明,金蓮免疫散組、芪草多糖組的攻毒存活率分別比對(duì)照組高15.78 百分點(diǎn)和13.56百分點(diǎn),證明金蓮免疫散、芪草多糖制劑能提高中華鱉的非特異性免疫功能。

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