姚基偉，楊 偉，丁 杰，萬 凌，王浩宇，李前偉，李為兵，李川海，鄢俊安 (.重慶市人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，重慶4047;.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍泌尿外科研究所，重慶400038)

環(huán)境是人類生存和發(fā)展的基礎(chǔ)，生殖健康是人類進(jìn)化和繁衍的必要條件。然而近50 年來男性生殖健康水平逐年下降［1］，在眾多影響因素中，環(huán)境污染因素一直都是國際上研究的熱點(diǎn)［2］。汽車尾氣污染是環(huán)境污染的主要組成部分［3］，是引發(fā)霧霾天氣的罪魁禍?zhǔn)字?。隨著國家經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和城市化的推進(jìn)，汽車的保有量持續(xù)上升［4］，由此帶來的汽車尾氣污染將會更加嚴(yán)重。國外研究表明，長期暴露于汽車尾氣中的特殊人群均可出現(xiàn)生殖健康受損［5］。汽車尾氣的生殖毒性及機(jī)制的研究國內(nèi)報(bào)道較少，主要原因之一就是沒有較為可靠的尾氣染毒模型。因此，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建一套有效可行的汽車尾氣染毒裝置和方法，并運(yùn)用其初步探討汽車尾氣對雄鼠生殖系統(tǒng)的影響，為相關(guān)分子機(jī)制的研究創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

24 只清潔級雄性(SPF 級)C57BL/6 小鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心，9 ～10 周齡，體質(zhì)量23 ～25 g;提供充足飲食飲水，室溫(22 ±1)℃，光照與黑暗周期均為12 h(7 ∶00 ～19 ∶00)，汽車尾氣染毒時間為每天14 ∶00 ～20 ∶00。

1.2 染毒裝置

染毒裝置由發(fā)電機(jī)(伊藤動力)及其進(jìn)氣口、小型風(fēng)扇及其進(jìn)氣口、排氣管、采樣口、和自制玻璃染毒柜5 個部分構(gòu)成。發(fā)電機(jī)產(chǎn)生汽車尾氣從進(jìn)氣口進(jìn)入染毒裝置內(nèi)，小型風(fēng)扇持續(xù)向染毒柜內(nèi)通入空氣，排氣管實(shí)現(xiàn)染毒柜內(nèi)的氣體與外界氣體進(jìn)行交換，運(yùn)用氧含量檢測儀(?，擜R8100)于采樣口檢測氧含量。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

首先設(shè)計(jì)自制汽車尾氣染毒裝置(圖1a)，并根據(jù)設(shè)計(jì)構(gòu)建染毒模型。將24 只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為尾氣暴露組和對照組，各12 只。尾氣暴露組放入染毒裝置內(nèi)且持續(xù)向其通汽車尾氣4 min，間隔20 min 后再次通注尾氣;以此類推每天循環(huán)6 h 且持續(xù)40 d;對照組則暴露于正常空氣中。染毒結(jié)束后用天平稱取2 組小鼠的體質(zhì)量及睪丸、附睪尾的質(zhì)量，記錄并比較各組質(zhì)量。取附睪尾的精子制成精子懸液。利用計(jì)算機(jī)輔助精液分析技術(shù)來評估精子總數(shù)、總活動力和前向運(yùn)動力［6］;取部分精子懸液加入4%多聚甲醛固定，吸取適量固定后的精子標(biāo)本推片晾干用2%的伊紅染色2 h，清水沖洗干燥后計(jì)數(shù)完整精子(500 條/只)中的畸形精子數(shù)，并計(jì)算精子畸形率。心臟抽取血離心取上清;取0.1 g 睪丸組織并勻漿。按照活性氧(ROS)測定試劑盒的說明書進(jìn)行血和睪丸ROS 含量進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 汽車尾氣染毒動物模型的構(gòu)建

持續(xù)染毒裝置內(nèi)(圖1b)通尾氣1 ～4 min 小鼠活動逐漸減弱或躁動，平均5 min 左右出現(xiàn)窒息死亡。故我們將通注尾氣時間保守地設(shè)定為4 min，此時染毒裝置內(nèi)的氧氣含量為(17.33 ±0.09)%。4 min 后關(guān)閉發(fā)動機(jī)，關(guān)閉5 min、10 min 和15 min 后，染毒裝置內(nèi)對應(yīng)的氧氣含量分別為(19.80 ±0.17)%、(20.20 ± 0.06)% 和(20.53 ± 0.03)%，見 圖1c。15 min后氧氣含量與大氣中的含量相近，但裝置內(nèi)尾氣的含量仍然較高;20 min 后裝置內(nèi)尾氣的氣味較弱。因此，設(shè)定每次通氣的時間間隔為20 min。

圖1 汽車尾氣染毒裝置及染毒動物模型的構(gòu)建

2.2 汽車尾氣暴露對生殖系統(tǒng)的影響

尾氣暴露組小鼠平均體質(zhì)量和睪丸質(zhì)量與對照組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，但附睪質(zhì)量較對照組明顯下降(P ＜0.01)，見表1。評估2 組小鼠精液質(zhì)量時，在運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助靜液分析技術(shù)檢測小鼠精液質(zhì)量的過程中，其中4 個樣品(每組各2 只小鼠)由于所使用的培養(yǎng)基受到污染導(dǎo)致精子大量死亡，無法滿足實(shí)驗(yàn)需求而排除。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠精子數(shù)目、總活動力和前向活動力均明顯高于尾氣暴露組(P ＜0.01)，而精子畸形率低于尾氣暴露組(P ＜0.01)，見表2。

表1 小鼠體質(zhì)量及生殖腺質(zhì)量變化(n=12，g)

表2 2 組小鼠精液質(zhì)量對比(n=10)

2.3 小鼠血和睪丸組織中ROS 的變化

實(shí)驗(yàn)中由于每組各2 只小鼠的血液無法滿足ROS 檢測而被排除。因此本組結(jié)果中各組都只有10 個樣品。尾氣暴露組小鼠血ROS 為(952.692 ±7.35)U/mL，睪丸組織中的ROS 為(48.948 ± 1.294)U/mgogrot，均 明 顯 高 于 對 照 組 小 鼠 的(335.498 ±5.509)U/mL 和(20.746 ±0.649)U/mgogrot，2 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，表明汽車尾氣暴露可能增加血液和生殖系統(tǒng)活性氧含量。

3 討論

在各類環(huán)境污染中，汽車尾氣引發(fā)的大氣污染及其對人類健康的危害，逐漸被全世界視為研究的重點(diǎn)。汽車尾氣成分復(fù)雜，含多種化學(xué)物質(zhì)，其主要分為有害氣體和顆粒物［7］。較長時間暴露于尾氣環(huán)境中，可造成機(jī)體多個系統(tǒng)損傷，主要表現(xiàn)在呼吸系統(tǒng)［8-9］、內(nèi)分泌系統(tǒng)［10］、心腦血管系統(tǒng)［11］以及生殖系統(tǒng)等損傷［12］。而我們課題組則密切關(guān)注著汽車尾氣對生殖方面的不利影響。

構(gòu)建可靠的汽車尾氣染毒裝置是開展該方向研究的前提條件。目前國內(nèi)外已報(bào)道了多種汽車尾氣染毒模型的構(gòu)建方法，常見的染毒模型主要包括腹腔注射或咽后壁注射機(jī)動車尾氣顆粒物(認(rèn)可度較高)［11］、機(jī)動車怠速持續(xù)釋放汽車尾氣［13］、大流量氣體采樣器收集汽車尾氣提取物后腹腔注射、自制染毒缸、直接暴露于車流量較大的環(huán)境中等方法，建模周期、染毒時間和效果參差不齊。為了解決上述問題，我們設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一套簡單、科學(xué)有效的汽車尾氣染毒裝置，通過對裝置內(nèi)氧氣濃度的測定以及小鼠致死時間的監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)了在實(shí)驗(yàn)小鼠存活的狀態(tài)下，提高單位時間內(nèi)小鼠吸收汽車尾氣量的目的，成功構(gòu)建了有效且建模周期短的尾氣染毒模型。

以人群為研究對象的研究［14］結(jié)果提示，汽車尾氣對男性生殖系統(tǒng)的最直接的影響表現(xiàn)在男性精液質(zhì)量下降(精子密度、精子活力、精子活率等各方面較正常人均有所下降)。通過對雄鼠的研究，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過本自制汽車尾氣染毒裝置染毒40 d 后可以引起雄鼠精液質(zhì)量下降，該結(jié)果與上述報(bào)道的現(xiàn)象相似;同時，我們還發(fā)現(xiàn)小鼠的附睪也發(fā)生一定程度的萎縮。由于精子從精原細(xì)胞發(fā)育為成熟的精子細(xì)胞的環(huán)節(jié)繁雜、相關(guān)調(diào)控因素眾多，汽車尾氣作用于其中的任何一個過程均會影響到最后的精液質(zhì)量的高低。結(jié)合國內(nèi)外現(xiàn)有報(bào)道，汽車尾氣損傷雄性生殖健康(尤其是精液質(zhì)量下降)的初步機(jī)制可能與以下幾個方面的原因有關(guān):①直接損傷生殖細(xì)胞;②影響下丘腦－垂體－性腺軸(內(nèi)分泌失調(diào)、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物);③氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)的過氧化損傷［15］;④誘導(dǎo)睪丸中基因表達(dá)的改變等。我們在研究中也發(fā)現(xiàn)尾氣暴露組血液和睪丸內(nèi)ROS的含量上升，同樣印證了汽車尾氣可能激活機(jī)體乃至睪丸組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但具體是通過何種途徑引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)仍有待明確。

綜上所述，隨著全國汽車保有量的持續(xù)增加，尾氣排放所帶來的環(huán)境問題(尤其是霧霾)的關(guān)注度逐步增加。汽車尾氣可能給機(jī)體帶來的不利影響及機(jī)制有待深入研究，尤其是對男性生殖健康的影響方面。本研究構(gòu)建的汽車尾氣的染毒裝置和染毒方法，為我們在該方向上進(jìn)一步深入研究具體的作用靶點(diǎn)創(chuàng)造了條件，從而有益于尋找到新的預(yù)防和診治的切入點(diǎn)。

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