甘 蕾，李 真，吳曉華，應德美，陳莉萍 (第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院婦產科，重慶400037)

黃體和胎盤組織分泌的孕激素(progesterone，P)對維持妊娠有至關重要的作用，在對孕激素與代謝相關性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，孕激素可引起糖耐量降低，增加胰島素抵抗(insulin resistance，IR)［1］，還可調控脂蛋白脂酶活性，促進脂質合成［2］，引起糖脂代謝失衡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)妊娠期糖耐量異常的患者血瘦素(leptin，LEP)濃度變化與孕激素水平相關［3］。孕激素水平增高，可否引起瘦素功能異常，參與妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)發(fā)生，尚待探討。孕期胎盤組織可合成瘦素［4］，瘦素的生物功能除了與瘦素濃度的相關外還與瘦素受體密切相關，其中可溶性的瘦素受體(soulbe leptin receptor，SLR)被認為是瘦素敏感性的標志［5］。SLR 參與體內瘦素的運輸、調控瘦素的濃度，影響瘦素的生物活性［6］。而對SLR 的研究，并未發(fā)現(xiàn)編碼SLR 生成的基因片段［5］，有學者提出SLR 可能是基質金屬蛋白酶10 (a disintegrin and metalloprotease 10，ADAM10)介導長型瘦素受體(leptin receptor，Ob-R)胞外區(qū)脫落產生［5］?；诖耍緦嶒炌ㄟ^體外培養(yǎng)早孕人絨毛細胞滋養(yǎng)層細胞，探討不同濃度孕激素對人絨毛滋養(yǎng)層細胞表達的ADAM10、Ob-R及分泌SLR、LEP 的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

絨毛組織采集于第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院婦產科門診，正常妊娠6 ～10 周，經超聲證實為宮內妊娠，自愿選擇人工流產終止妊娠的健康婦女，經負壓吸宮術獲得的絨毛組織。將其置于預冷的含有雙抗的無菌DMEM-F12 培養(yǎng)基內，迅速轉移至超凈工作臺中分離培養(yǎng)細胞。本研究遵循第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院生物醫(yī)學研究倫理委員會所制定的倫理學標準，得到該委員會的批準。

1.2 人早孕絨毛滋養(yǎng)層細胞的分離、培養(yǎng)

用DMEM-F12 培養(yǎng)基反復沖洗絨毛組織，去除血污、蛻膜及肉眼可見的血管組織，用眼科剪剪碎為1 mm ×1 mm 左右大小的碎屑。加入適量的0.25% 的胰蛋白酶在常溫下消化20 min，其間進行適當?shù)卮荡?，任其自然沉淀，?∶1 的體積加入含有20%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基中和胰酶作用，吸出上清液，未消化組織重復消化2 次，將吸取的上清液經200目篩網(wǎng)濾過，吸取濾過液于離心管中，以800 r/min ×5 min 離心，倒掉上清液，加入含有20%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基，反復吹打，吸入培養(yǎng)瓶內，放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后，換掉一半的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，換液，以后每隔48 h 換液1 次。

1.3 人絨毛滋養(yǎng)層細胞鑒定

培養(yǎng)的第一代細胞，采用S-P 法檢測細胞內抗－細胞角蛋白7 抗體和抗－細胞波形蛋白抗體，進行滋養(yǎng)層細胞鑒定。

1.4 不同濃度孕激素培養(yǎng)人絨毛滋養(yǎng)層細胞

采用胰蛋白酶消化后生長狀態(tài)良好的滋養(yǎng)層細胞，臺盼藍染色、計數(shù)、按每孔1 ×106/mL 接種于12 孔板中。使用無血清的DMEM-F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，觀察細胞貼壁情況，吸掉培養(yǎng)基，分為4 組，分別加入含有0、100、150、200 ng/mL 孕激素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后收集細胞及上清液。

1.5 WB 法檢測細胞內ADAM10、Ob-R 的表達

采用PMSF/RIPA 裂解液說明書上的步驟提取蛋白，用BCA 試劑盒檢測蛋白含量，計算上樣量，取蛋白樣品50 μg 進行電泳、轉膜、封閉、孵育一抗，4 ℃冰箱隔夜孵育，TBST 洗膜，孵育二抗，洗膜，ECL 發(fā)光液反應，曝光。凝膠成像系統(tǒng)掃描儀成像。用Image J 軟件進行定量分析。

1.6 ELISA 法檢測上清液中SLR、LEP 的表達量

根據(jù)ELISA 試劑盒上的相關操作說明，檢測細胞上清液中SLR 及LEP 的表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，單因素方差分析比較各物質組間差異性，結果用均數(shù)±標準差表示。采用Pearson 檢驗各物質間的相關性。P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義，P ＜0.01 表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 胰蛋白酶消化法培養(yǎng)人絨毛滋養(yǎng)層細胞

倒置顯微鏡下見細胞呈上皮細胞樣生長，細胞體積大呈長多邊形，胞漿豐富，核呈卵圓形，個別細胞呈纖維細胞樣，生長成片(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的人絨毛滋養(yǎng)層細胞(×200)

2.2 免疫組化法鑒定人絨毛滋養(yǎng)層細胞

DAB 顯色后的陽性信號為胞漿中呈棕黃色顆粒，胎盤組織滋養(yǎng)層細胞的角蛋白染色陽性，著色于胞漿(圖2a)，波形蛋白染色陰性(圖2b)。體外培養(yǎng)的細胞中細胞角蛋白陽性率約90%。

圖2 免疫組化法鑒定人絨毛滋養(yǎng)層細胞

2.3 孕激素影響細胞內ADAM10 和Ob-R 的表達

人胎盤絨毛滋養(yǎng)層細胞表達ADAM10 的含量隨著與激素濃度的增加而增加(P ＜0.05)。孕激素對Ob-R 隨著孕激素濃度的增高組間兩兩比較無顯著性差異(P ＞0.05)，但仍可看出隨著孕激素濃度的增高，Ob-R 的表達有逐漸上升趨勢(圖3，表1)。

圖3 WB 法檢測不同濃度孕激素對ADAM10 及Ob-R 的影響

2.4 孕激素影響細胞對SLR、LEP 的分泌

胎盤組織合成和分泌的SLR 隨著孕激素濃度增加而逐漸減少(P ＜0.01)，而LEP 含量隨著孕激素濃度的增加而增加(P ＜0.01)，見表2。

表1 不同濃度孕激素對胎盤人絨毛滋養(yǎng)層細胞表達ADAM10、Ob-R 的影響(±s)

表1 不同濃度孕激素對胎盤人絨毛滋養(yǎng)層細胞表達ADAM10、Ob-R 的影響(±s)

* :與對空白組(0 ng/mL)比較，P ＜0.05;#:與對空白組(0 ng/mL)比較，P ＜0.01

?

表2 不同濃度孕激素對胎盤人絨毛滋養(yǎng)層細胞分泌SLR 及LEP 的影響(±s)

表2 不同濃度孕激素對胎盤人絨毛滋養(yǎng)層細胞分泌SLR 及LEP 的影響(±s)

* :與對空白組(0 ng/mL)比較，P ＜0.01

?

2.5 Pearson 檢驗各因素之間相關性結果

采用SPSS 19.0 軟件分析比較人絨毛滋養(yǎng)層細胞表達的各物質之間的相關性。SLR 的表達與LEP 的表達存在顯著性負相關(R= －0.949，P ＜0.01)，ADAM10 與Ob-R 的表達不存在明顯相關性(R= －0.425，P ＞0.05)。

3 討論

3.1 孕激素與GDM 發(fā)生的相關性

妊娠期糖尿病是指妊娠期首次發(fā)生或者發(fā)現(xiàn)的任何程度的糖耐量異常，其病理特征是高胰島素血癥、高瘦素血癥所伴隨的糖脂代謝紊亂。國內外對孕激素與妊娠期糖尿病的相關性研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖耐量異常的患者血孕激素水平顯著高于正常妊娠產婦［3，7］。而關于口服避孕藥與GDM 相關性的研究，發(fā)現(xiàn)孕齡期女性孕前使用口服避孕藥GDM 發(fā)生率增高［8］，有GDM 史女性服用孕激素類避孕藥產后5 ～10 年發(fā)生2型糖尿病風險約為20% ～60%［9］。此外，關于孕激素治療復發(fā)性流產人群，研究發(fā)現(xiàn)其可導致糖耐量降低和GDM 的發(fā)生率增加［8，10］。

孕激素參與GDM 發(fā)生主要是通過影響糖脂代謝所致。孕激素可導致空腹血糖升高及胰島素抵抗。Yeung 等［11］發(fā)現(xiàn)人黃體期胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模式(HOMA-IR)與血清孕激素水平增加相關。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，外源性地給予大鼠孕激素可導致胰島素敏感性下降而血糖增高［12-13］，此外，Sissan 等［14］研究發(fā)現(xiàn)孕激素可通過抑制肝臟蘋果酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性，導致葡萄糖利用障礙，血糖升高。而關于孕激素影響脂代謝主要表現(xiàn)為影響脂蛋白酯酶的活性［1］。Sissan 等［14］研究還發(fā)現(xiàn)孕激素可增加脂肪組織脂蛋白酯酶的活性，使脂肪組織分解增加，血脂升高。

3.2 孕激素調控瘦素功能發(fā)揮影響GDM 發(fā)病

GDM 的發(fā)病通常在孕激素水平很高的妊娠中期［15］，說明孕激素在GDM 發(fā)生和發(fā)展進程中起著某種作用。而目前臨床上對于孕激素參與糖脂代謝異常的發(fā)病機制尚不清楚，早期研究發(fā)現(xiàn)孕激素對胰島素的分泌及信號傳導有重要作用［8］。近年來隨著對瘦素的深入研究發(fā)現(xiàn)，瘦素與胰島素存在著復雜的關系，他們共同參與調節(jié)糖脂代謝，與妊娠期糖尿病、肥胖、2 型糖尿病等代謝綜合征密切相關。女性妊娠狀態(tài)下血瘦素濃度約為非孕時期的2 ～3 倍，且在孕28 周達到高峰［16］。在對瘦素與GDM 相關性研究發(fā)現(xiàn)，血清瘦素每增加10 ng/mL，GDM 發(fā)生風險相應增加20%［17］。

妊娠期瘦素的合成和分泌受到胎盤組織合成和分泌的多種激素(如人絨毛膜促性腺激素、胎盤泌乳素、雌激素、孕激素等)的影響，關于孕激素與瘦素之間的相關性存在許多矛盾性研究［3，18-20］。目前臨床研究上暫無文獻表明孕激素可通過某種具體的路徑影響瘦素分泌參與GDM 發(fā)生，而瘦素功能的發(fā)揮不僅僅受到瘦素濃度的影響還受到瘦素受體的影響。孕激素是通過調控瘦素的分泌還是通過調控瘦素受體表達參與GDM 發(fā)生，尚不清楚。

瘦素與瘦素受體結合參與細胞信號傳導，瘦素受體的表達是維持正常妊娠所必需的［21］。瘦素受體屬于I 類細胞因子受體家族，其中重要的瘦素受體包括長型受體(Ob-R)-參與細胞內信號轉導和SLR-調控瘦素濃度及瘦素生物活性。人的胎盤滋養(yǎng)層細胞表達瘦素及瘦素受體［22］。從瘦素受體表達來看，GDM 孕婦胎盤上的瘦素受體表達高于正常妊娠孕婦［17］。而對瘦素基因的研究發(fā)現(xiàn)，瘦素受體Gln223Arg 與胰島素抵抗、高瘦素血癥及肥胖密切相關［23-25］。瘦素受體的表達與GDM 發(fā)生相關，而孕激素可否通過某種路徑作用于瘦素受體，目前尚無相關文獻報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)孕激素影響早孕人絨毛滋養(yǎng)層細胞ADAM10的表達及SLR、LEP 分泌，而對Ob-R 的表達無顯著影響。

關于SLR 的研究，并未發(fā)現(xiàn)編碼SLR 合成的特異mRNA，有學者認為SLR 可由金屬蛋白酶參與長型瘦素受體(Ob-R)脫落的產生［26］。Schaab 等［5］發(fā)現(xiàn)ADAM10 參與了SLR 的產生。國外學者在對SLR 與一系列代謝性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，SLR 與肥胖、IR、2 型DM及其他代謝相關危險因子(血壓、甘油三酯濃度、低密度脂蛋白濃度、空腹血糖濃度)呈顯著的負相關，SLR與高密度脂蛋白(HDL)呈正相關，SLR 被認為可以預測糖尿病及代謝綜合征發(fā)生的因子［5］?；诖?，本實驗探討孕激素與人絨毛滋養(yǎng)層細胞內的ADAM10、Ob-R 及上清液中LEP 及SLR 表達的相關性，尋求可能存在的GDM 發(fā)病機制。我們研究發(fā)現(xiàn)SLR 的表達與LEP 的表達存在顯著性負相關(R= －0.949，P=0.000)，ADAM10 與Ob-R 的表達無明顯相關性(R = －0.425，P ＞0.05)。因此，本課題組認為孕激素增高可通某種路徑，調控ADAM10 的表達，影響SLR 的生成，引起瘦素功能發(fā)揮異常，導致糖脂代謝紊亂，參與GDM 發(fā)生。而關于孕激素通過何種路徑影響ADAM10，是本課題組下一步將探討的問題。

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