姜超張學(xué)文潘映紅

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京，100081）

蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切技術(shù)研究進展

姜超1，2張學(xué)文1潘映紅2

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京，100081）

膠內(nèi)酶切是蛋白質(zhì)組研究中銜接電泳分離和質(zhì)譜鑒定的重要環(huán)節(jié)，對最終的蛋白質(zhì)定性和定量分析結(jié)果有顯著的影響。該技術(shù)自1992年初步建立以來，一直處于不斷完善中，出現(xiàn)了種類繁多的改進方案。為了更有效地利用膠內(nèi)酶切技術(shù)，從凝膠脫色、雜質(zhì)去除、蛋白酶切、肽段提取4個方面歸納整理了近年來蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切技術(shù)的主要研究進展。

蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切；樣品制備；質(zhì)譜分析；電泳分離；技術(shù)進展

DIO： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.009

蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切是銜接電泳分離和質(zhì)譜鑒定之間的重要環(huán)節(jié)。在基于凝膠分離的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)混合物樣品用一維（1-DE）或二維（2-DE）凝膠電泳分離，得到的蛋白條帶或蛋白點被挖出進行膠內(nèi)酶切，然后利用生物質(zhì)譜完成蛋白質(zhì)的分析鑒定，其中膠內(nèi)酶切是實現(xiàn)可靠的蛋白質(zhì)定性和定量分析的一個關(guān)鍵步驟［1］。膠內(nèi)酶切即是將膠內(nèi)的蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)酶（通常是胰蛋白酶）酶切成肽段，再用溶劑將酶切后的肽段從膠內(nèi)提取出來供質(zhì)譜分析，它主要包括凝膠脫色、雜質(zhì)去除、蛋白酶切及肽段提取4個部分，每一部分的實驗細節(jié)均對質(zhì)譜圖譜的質(zhì)量和蛋白鑒定率有明顯影響。膠內(nèi)酶切技術(shù)最早建立于1992年［2］，此后一直處于不斷完善中，出現(xiàn)了種類繁多的改進方案。該技術(shù)的發(fā)展已引起越來越多的關(guān)注，很多專門研究膠內(nèi)酶切技術(shù)的文獻［3-7］陸續(xù)發(fā)表在各類期刊中，有必要進行系統(tǒng)的總結(jié)和分析。

1 染色和脫色

凝膠電泳技術(shù)是一種強有力的蛋白質(zhì)及多肽分離分析工具，而蛋白質(zhì)染色是其中的重要組成部分。染色方法的改進主要集中在如何提高染色靈敏度，操作是否簡捷，成本是否低廉及操作是否安全等方面。傳統(tǒng)的考馬斯亮藍染色法靈敏度較低、染色時間較長、凝膠背景偏深，Gauci等［8］開發(fā)的膠體考馬斯亮藍染色法，有效提高了染色靈敏度，降低了凝膠背景。相比較而言，銀染法的靈敏度更高，但其缺點也很明顯，如耗時長、步驟繁多、線性范圍小等。Quinten等［9］的文獻中還提到用還原糖代替甲醛的銀染方法也取得了較好的靈敏度與質(zhì)譜兼容性。除了考染法和銀染法，也使用一類負染法［10］，包括氯化鉀、氯化銅、氯化鋅、醋酸鹽、氯化鎳和鋅咪唑負染法，其中鋅咪唑負染法較常用。熒染法需要特殊的檢測儀器和昂貴的試劑，且一般情況下每種蛋白僅少量被標(biāo)記，熒染凝膠極少用于后續(xù)質(zhì)譜分析。目前與膠內(nèi)酶切相關(guān)的蛋白質(zhì)染色方法主要有考馬斯亮藍染色法、銀染法和負染法。

負染法不染蛋白，只染背景，不需要進行脫色處理，只需除雜和干燥就可進行酶切?？捡R斯亮藍和銀離子染色后的蛋白質(zhì)在酶切之前必須進行脫色處理，常規(guī)步驟是切取1 mm2膠粒片段放入1.5 mL的EP管中，加入50 μL的脫色液（20%乙腈，50 mmol/L碳酸氫銨，pH 7.0），置于30℃水浴鍋中，共脫色兩次，每次30 min，中間振蕩3-5次，離心去上清［11］。若為銀染膠則需在加脫色液前先用30 mmol/L的鐵氰化鉀或者過氧化氫來氧化銀顆粒，再用100 mmol/L的硫代硫酸鈉與銀離子形成復(fù)合物達到脫銀目的［12］。

有關(guān)脫色方法的改進主要是針對馬斯亮藍染色法和銀染法。水與酸、醇等有機溶劑混合液常用于脫色處理，如Cong等［13］在常規(guī)脫色前采用1 mL 30% 乙醇（V/V）和10%乙酸（V/V），可明顯提高膠塊的脫色效率。恒溫條件下的脫色處理會導(dǎo)致一部分蛋白的流失，Utrera 等［14］將脫色過程中的溫度保持在50℃左右，降低了蛋白質(zhì)損失。除此之外，Sriswasdi等［15］用50 mmol/L的碳酸氫銨和50%的甲醇來進行處理。Mora等［16］50 mmol/L 的DTT（25 μL），加入到50 mmol/L碳酸氫銨pH8.0的溶液中，56℃放置1 h。上述改進均可明顯提高膠塊的脫色效率。另外，某些改進的膠內(nèi)酶切技術(shù)還省略了固定、染色和脫色等步驟，即電泳后直接切膠后進行除雜處理，從而簡化操作步驟，提高了膠內(nèi)酶切的效率［17］。

2 雜質(zhì)去除

鹽離子、去垢劑等樣品本身攜帶或電泳時引入的雜質(zhì)是影響酶切效率和質(zhì)譜鑒定結(jié)果的重要因素，雜質(zhì)的存在會抑制蛋白酶活性并嚴重干擾質(zhì)譜中樣品的離子化，因此去除雜質(zhì)處理是膠內(nèi)酶切技術(shù)中必不可少的部分。

通常情況下，電泳分離可去除多數(shù)蛋白樣品中的雜質(zhì)［18］，脫色處理也具有一定的去雜作用。常用的除雜方法是將膠塊用超純水洗滌和超聲波處理，最后使用100%乙睛脫水［11］。近年來，一些研究者在脫色處理后使用其他試劑進一步去除SDS和鹽離子等雜質(zhì)，如胡偉等［19］用體積比1∶4的乙醇-氯仿、Takakura等［20］用0.2-0.8 mmol/L鹽酸胍、Choksawangkarn等［21］用6-8 mmol/L尿 素、Gorka等［22］用5%甲酸有效置換出膠塊中SDS和鹽離子等雜質(zhì)，獲得了較好的除雜效果。此外，Niemela等［23］報道去除雜質(zhì)步驟中使用微波處理也能獲得較好的效果?；钚蕴客ǔＲ部梢猿}離子等雜質(zhì)，但在膠內(nèi)酶切過程中更多用于酶切后肽段提取液的處理［24］。去除雜質(zhì)處理應(yīng)盡可能達到簡化實驗程序、降低待分析物損失和不引入新雜質(zhì)等目的。就上述方法而言微波處理是一個比較快速純凈的處理方法，不過微波處理所需的儀器成本較貴?；钚蕴砍s效果顯著但試驗程序較繁瑣。其他溶液的雜質(zhì)去除方案一定程度上都可以去除膠內(nèi)的雜質(zhì)離子，然而溶劑的加入可能會引入別的新雜質(zhì)。

3 蛋白酶切

顧名思義凝膠里面的蛋白質(zhì)酶切就是膠內(nèi)酶切，所以蛋白質(zhì)酶切是膠內(nèi)酶切處理過程中的一個非常重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。經(jīng)過染色脫色和除雜處理后，為了保證酶切效果，1DE電泳分離的蛋白質(zhì)在酶切前還常用DTT和碘乙酰胺對膠塊進行還原和烷基化處理，而2DE電泳分離的蛋白質(zhì)在第二維分離前已經(jīng)過還原和烷基化處理，經(jīng)脫色和除雜可直接用蛋白酶切成肽段［25］。胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶是酶切處理中常用的蛋白質(zhì)酶，但經(jīng)典的膠內(nèi)酶切方法是用乙腈干燥凝膠后，每1 mm2膠粒加入10 μL胰蛋白酶終濃度約為10 ng/μL的50 mmol/L碳酸氫銨溶液，冰浴1 h使膠粒再水化后，除去過量的胰蛋白酶溶液，加入10 μL 50 mmol/L碳酸氫銨覆蓋膠粒，37℃酶切16 h［11］。

如何提高酶切效率是蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切技術(shù)研究的重點之一，許多科學(xué)家都致力發(fā)展一些新的技術(shù)方法來實現(xiàn)這一目標(biāo)。近年來不同種類的表面活性劑和去垢劑的使用，顯著提高了蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切反應(yīng)的效率。王鴻麗等［12］在酶切過程中加入非離子去污劑正十二烷麥β-D-芽糖苷，利用該去污劑對蛋白質(zhì)的去折疊和增溶作用，縮短了蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切時間，提高了肽的質(zhì)量和覆蓋率。Leon等［26］使用了小分子表面活性劑 RapiGest SF濃度為0.5%-1%用于改進電泳分離的蛋白質(zhì)的鑒定效率，成功縮短了酶切時間，提高了肽段的提取率。另外，Saveliev等［27］利用一種可以促進凝膠中蛋白質(zhì)快速溶解和變性的表面活性劑，增強了親脂性膜蛋白的酶切效率，同時這種表面活性劑隨后可被降解掉，因而具有較好的質(zhì)譜兼容性。

近年許多科學(xué)家也在尋找一些新的技術(shù)來縮短蛋白質(zhì)的酶切時間。有報道表明微波輔助酶切也是一種快速方便的方法。Damm等［28］將微波技術(shù)用于標(biāo)準蛋白的膠內(nèi)酶切過程，利用微波對酶切過程中溫度的控制作用，通過調(diào)節(jié)微波儀器的參數(shù)，設(shè)置溫度梯度，改善了酶切效率。Ruan等［29］用微波技術(shù)在短時間內(nèi)完成折疊緊密的難變性的蛋白質(zhì)的酶切。Lin等［30］還測試了各種溶液中的微波輔助酶切效率，結(jié)果表明當(dāng)酶切反應(yīng)發(fā)生在含有乙腈、甲醇和氯仿的溶液中時，微波酶切的效率會有所提高。Lopez-Ferrer等［31］綜合使用微波、超聲波及高壓循環(huán)技術(shù)，提高了酶切樣品的純度。這些方案都滿足了實際研究中對快速或高通量膠內(nèi)酶切的需求。近年來超聲波技術(shù)在蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切中也得到一些應(yīng)用。成結(jié)等［32］用2 mm超聲破碎儀探頭伸入含蛋白質(zhì)酶溶液中，超聲功率20 W，工作時間 60 s，兩個循環(huán)后，再加入微量的胰蛋白酶，再次超聲兩個循環(huán)，可快速完成酶切。Araujo等［33］利用超聲波來提供高溫度和高壓的輔助酶切條件，實現(xiàn)了快速有效的膠內(nèi)酶切。利用超聲波技術(shù)可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)蛋白質(zhì)的酶切，縮短了酶切的時間，增加了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的通量，是目前新開發(fā)的蛋白質(zhì)快速酶切方法。使用在線酶反應(yīng)器或固定化酶反應(yīng)柱［34，35］也是一種快速進行蛋白質(zhì)酶切的方法。酶的固定化是指通過吸附、包埋、交聯(lián)、共價接合等方法使目標(biāo)酶分子固定于特定的載體上而發(fā)揮酶的生物催化作用。與普通的蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)相比，固定化的酶具有更高的（酶/底物）比例、更高的酶解效率、可重復(fù)使用，并能減少酶的自身降解等優(yōu)點。因此蛋白質(zhì)的在線酶解使得蛋白的鑒定可以更快速、更自動化地完成［36］。

不同的酶緩沖液，以及酶緩沖液中不同的酶終濃度對酶切過程中也起到了至關(guān)重要的作用。Xu 等［37］報道使用10 μL 含20 mmol/L碳酸氫銨和0.5 mol/L氯化鈣酶緩沖液，胰蛋白酶終濃度為10 ng/μL，可獲得較好酶切效率。Antrobus 等［38］認為加入20 μL 含10 mmol/L碳酸氫銨和10%乙腈的酶緩沖液，胰蛋白酶終濃度為12.5 ng/μL時，酶切效果更好。這些實驗提示改變酶濃度和酶緩沖液的配比，能夠進一步增強酶的作用效果，提高酶切效率。酶切緩沖液的pH值對酶切效果也有顯著的影響。最近Pernemalm［39］、Paasch［40］、Bae［41］等研究者較深入研究了不同pH的緩沖液對酶切效率的影響，希望找出不同酶切反應(yīng)中最適pH值。

總而言之，蛋白質(zhì)酶切反應(yīng)過程中目標(biāo)蛋白酶解是否完全、酶切位點是否特異、酶切片段數(shù)量的多少以及酶自切程度的高低，都會直接影響蛋白定性和定量結(jié)果，需要優(yōu)化和改進膠內(nèi)酶切技術(shù)條件，才能得到高純度，高穩(wěn)定性的質(zhì)譜分析樣品。

4 肽段提取

膠內(nèi)酶切技術(shù)中，酶切后肽段提取的重要性常被忽視。進行膠內(nèi)酶切時各種參數(shù)的調(diào)整優(yōu)化，如樣品的處理、酶與蛋白質(zhì)的比例、酶切緩沖液的構(gòu)成和酶切的條件等，均可提高多肽得率，但如何有效地將酶切后生成的肽段從膠塊基質(zhì)中分離提取出來，是整個蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切過程中最后需要考慮的問題。目前通常使用含乙睛和三氟乙酸的溶液分離提取膠粒中的肽段，即酶切結(jié)束過后，加入5%的TFA，40℃保溫1 h后，將上清液移入新管，再加入含2.5%TFA和50% CAN的新提取液，30℃保溫1 h，合并兩次獲得的肽段提取液，真空干燥后-80℃保存。

肽段提取過程中需反復(fù)淋洗管壁，盡可能減少管壁對肽段的吸附［42］。對蛋白質(zhì)含量非常低的膠點，可能需要合并多塊凝膠以提高樣品肽段的含量［43］。肽段提取物還可以通過C18柱進一步除雜，以降低對質(zhì)譜的污染，提高鑒定率［24］。ZipTipC18槍頭既可以脫鹽除雜又能快速簡便地富集多肽片段，是處理微量肽段提取液的有效工具，Mou等［44］運用基于ZipTipC18的肽段提取方法，成功制備了高濃度的肽段。近年還有很多文獻報道使用甲酸和乙腈的混合液來提取肽段，如Zhang等［45］用5%的甲酸和50%的乙腈混合溶液來完成肽段提取。由于不同肽段在不同提取液中溶解性有差異，Takakura等［20］設(shè)計了10%-50%乙腈濃度梯度的分段提取方式，獲得了較好的提取效率。

5 其他問題

進行蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切的目的是為進一步的質(zhì)譜分析提供適宜的樣品，因此整個酶切過程中還要嚴格控制各種干擾質(zhì)譜分析的污染。最常見的污染是源自人體的角蛋白，其次是橡膠手套表面可能存留的滑石粉［46］。實驗室中的各種塑料耗材中的聚乙二醇（PEG）等塑化劑也是嚴重干擾質(zhì)譜分析的污染物，應(yīng)盡量使用優(yōu)質(zhì)吸頭與離心管。其他化學(xué)試劑也應(yīng)該盡量用高純度、高品質(zhì)產(chǎn)品。最后，如果遇到酶切位點少或分布極不規(guī)則的蛋白質(zhì)，常規(guī)酶切很難得到好的肽譜，可以考慮換一種蛋白酶進行酶切。

6 展望

利用生物質(zhì)譜定性和定量分析凝膠電泳分離后的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有重大意義，其中蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切對質(zhì)譜分析結(jié)果有極為顯著的影響。蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析特別是復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合樣品的質(zhì)譜分析，是檢測種類繁多的低含量肽段的儀器分析過程，之前進行膠內(nèi)酶切時產(chǎn)生的任何微小的肽段損失或污染均可能造成嚴重后果。在質(zhì)譜分析中若想得到可信度高和重復(fù)性好的定性定量結(jié)果，就必須優(yōu)化凝膠脫色、雜質(zhì)去除、蛋白酶切、肽段提取4個主要的膠內(nèi)酶切步驟，以減少肽段損失并提高酶切產(chǎn)物純度。迄今為止，針對膠內(nèi)酶切技術(shù)的4個主要步驟已有較多的調(diào)整和改進，根據(jù)具體的樣品特性及實際情況，借鑒和參考已有的研究，進一步提高質(zhì)譜鑒定的成功率和質(zhì)譜定量準確性。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Technology of In-gel Protein Digestion

Jiang Chao1，2Zhang Xuewen1Pan Yinghong2
（1. College of Bbioscience and Biotechnology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128；2. Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Beijing 100081）

In-gel digestion is the important step that connects electrophoresis separation and mass spectrometry identification in proteome research， and can significantly affect the results of qualitative and quantitative analysis of proteins. The technology was firstly proposed in 1992，and from then on， many progresses have been made and various improvement plans have been developed. In order to more effectively use the technology of in-gel digestion， the progress on the aspects of gel decoloration， impurity removal， protein digestion and peptides extraction were reviewed from the literature.

in-gel protein digestion；sample preparation；mass spectrometry；electrophoretic separation；technical progress

2014-06-18

國家“863”計劃項目（2008AA10Z115），國家自然科學(xué)基金項目（30971874），轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2009ZX-08012-011B），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（作物分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用科研創(chuàng)新團隊）

姜超，男，碩士研究生，研究方向：細胞生物學(xué)；E-mail：1025160733@qq.com

潘映紅，男，研究員，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：panyinghong@caas.cn