劉 菲

（1．陜西學前師范學院生物科學與技術系，陜西西安 710061；2．陜西師范大學生命科學學院，陜西西安 710062）

昆蟲酚氧化酶研究進展

劉 菲1，2

（1．陜西學前師范學院生物科學與技術系，陜西西安 710061；2．陜西師范大學生命科學學院，陜西西安 710062）

酚氧化酶（phenoloxidase，PO）屬于3型含銅蛋白（type－3－copper－containing proteins），該蛋白家族在自然界中廣泛存在，并行使著多種多樣的生理學重要功能。酚氧化酶是黑色素合成中最重要的酶之一，外源病原物的殺死、血液凝集、抗菌肽表達、傷口愈合和糞便黑化都與酚氧化酶有著密切的關系。酚氧化酶在昆蟲體內以酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）的形式存在。本文主要從酚氧化酶的來源、檢測、結構、激活及其功能等方面進行綜述，以期為進一步探究酚氧化酶在農業(yè)病蟲害防治方面的可能應用提供新思路。

酚氧化酶；來源；檢測；結構；激活；功能

酚氧化酶（phenoloxidase，PO）屬于3型含銅蛋白（type－3－copper－containing proteins），該蛋白家族在自然界中廣泛存在，如高等動物體內的酪氨酸酶（Tyrosinase）、植物的兒茶酚氧化酶（Poly phenoloxidase，PPO）、節(jié)肢動物血藍蛋白（Hemocyanin）和昆蟲及蝦蟹的酚氧化酶［1］。3型含銅蛋白具有多種不同的生理功能。高等動物的酪氨酸酶存在于皮發(fā)和神經系統(tǒng)之中，該酶的功能異常將導致白化病和帕金森癥等疾?。?3］，植物的PPO在個體受損傷后可以被激活，進而引起褐化并影響食物的品質［4］。而昆蟲酚氧化酶是一個非常重要的免疫蛋白，在血淋巴中以酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）的形式存在。本文從來源、檢測、結構、激活及其功能等方面綜述昆蟲PPO的研究進展，以期為進一步探究酚氧化酶在農業(yè)病蟲害防治方面的可能應用提供新思路。

1 昆蟲酚氧化酶的來源

PPO主要是由血細胞合成的，黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）幼蟲含有三種分化的血細胞類型，分別是漿細胞（plasmatocytes）、含晶細胞（crystal cells）和層狀細胞（lamellocytes），這三種血細胞都是由其前體原血球細胞（prohemocyte）分化而來［5］。果蠅的基因組中含有3個PPO基因（PPO 1／CG5779，PPO2／CG8193，PPO3／CG2952），PPO1和PPO2主要在含晶細胞中表達［6］，PPO3主要在層狀細胞中表達［7］。而在其他許多昆蟲中，PPO都是由血細胞中的擬絳色細胞（oenocytoid）合成的［8］。

果蠅PPO在含晶細胞中的表達依賴于RUNX（Runt－related transcription factor）相關轉錄因子Lz（Lozenge）和GATA轉錄因子Srp（Serpent）［9］，全基因組芯片分析結果顯示，果蠅PPO基因是組成性表達，其RNA水平不受細菌或真菌感染的影響［7－9］。然而，在果蠅受到寄生蜂感染48－72 h后，PPO3的RNA水平顯著上調［5］。并且，PPO3的過表達能夠誘導S2細胞果蠅本身的組成性黑化，PPO1和PPO2并沒有這種現象［6］。PPO3可能在層狀細胞參與的抗寄生蟲的黑化反應中起著重要的作用。

雖然血細胞是PPO的主要來源，但是其他組織也可能合成PPO。家蠶（Bombyx mori）翅原基與造血器官構成復合體，粘著在體壁內表面上［10］。刁玉璞等人發(fā)現家蠶翅原基中含有PPO［11］。在體外培養(yǎng)的條件下，PPO能夠釋放到培養(yǎng)基中。將翅原基手術摘除后，血淋巴中的PPO含量明顯減少，證明翅原基含有PPO并可能作為血淋巴PPO的來源之一。用滅活的細菌刺激家蠶，發(fā)現翅原基PPO的轉錄水平沒有明顯的改變，說明翅原基中的PPO可能與家蠶的免疫應答無關，但卻是血淋巴PPO的穩(wěn)定來源之一［11］。邵奇妙等人發(fā)現家蠶后腸細胞也可產生PPO，并將其分泌到后腸內容物當中，這些PPO使得后腸內容物和糞便黑化，從而減少糞便中的細菌［12］。在果蠅中，PPO1基因的突變Black cells（Bc），在果蠅的幼蟲中產生無功能的含晶細胞。Bc抑制了由Spn27A突變引起的血淋巴組成性黑化，但是它不能阻止由Spn77Ba突變引起的氣管上皮的黑化，這意味著與氣管黑化相關的PPO不是來源于含晶細胞，而是由上皮細胞合成的［13］。

2 昆蟲酚氧化酶的檢測

檢測PPO的傳統(tǒng)方法是運用免疫染色或原位雜交的方法來檢測PPO蛋白或轉錄本［14］。例如，家蠶和煙草天蛾（Manduca sexta）的免疫染色和原位雜交結果表明其擬絳色細胞能產生PPO［8，14］。然而由于昆蟲PPO抗體的缺乏或其他限制，想在大多數昆蟲中檢測PPO并不容易。有一些簡便的方法可以檢測細胞和組織中的PPO。昆蟲PPO能被許多陽離子或陰離子洗滌劑和醇類（如甲醇、乙醇和異丙醇）通過未知的機制激活，研究者可以利用這個特性來檢測細胞和組織中的PPO。凌爾軍等人發(fā)現，用35%乙醇配制的濃度為1mg／ml的L－DOPA溶液孵育血細胞，除了家蠶擬絳色細胞和漿細胞外，還能鑒定出一部分原血球細胞和顆粒細胞含有PPO［15］?；谶@種方法，凌爾軍等人研究了煙草天蛾的包囊和黑化反應［16］，刁玉璞等發(fā)現家蠶翅原基含有PPO［11］。該方法還可以運用于檢測非變性聚丙烯酰胺凝膠中的PPO。例如，果蠅PPO1和PPO2在同一張非變性聚凝膠上呈現兩條不同的條帶［17］。

3 昆蟲酚氧化酶的結構

PPO和血藍蛋白、兒茶酚氧化酶以及酪氨酸酶都屬于3型含銅蛋白，該類蛋白的每個活性中心口袋含有2個銅離子和3個組氨酸［18］。煙草天蛾PPO異二聚體的晶體結構顯示，在Arg51和Phe52之間的剪切導致了構象的改變，兩個亞基都有一個特定的苯丙氨酸（F）從活性位點移出，從而使活性中心底物結合的位點暴露出來，這個F氨基酸被稱為place holder。煙草天蛾PPO1／2晶體結構的解析完成，為其功能研究提供了更多的參考依據［18］。

各種昆蟲中PPO基因的數目差別很大，在鱗翅目昆蟲中PPO基因通常較少，如煙草天蛾和家蠶均分別具有2個PPO基因。在果蠅基因組中，目前發(fā)現3個PPO基因。而在岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）的基因組中，則分別發(fā)現多達9個和10個PPO基因［19］。這些不同的PPO是否具有不同的理化性質和功能？劉菲等人將果蠅的3個PPO（PPO1、PPO2和PPO3）在果蠅血細胞系S2中進行了表達，發(fā)現果蠅的3個PPO蛋白有著非常不同的理化性質，并對銅離子有著不同的反應［6］。其中，r PPO1和r PPO2需要額外的Cu2+才能有活性，但r PPO3表達后就有活性，加入Cu2+后會發(fā)生自激活。傳統(tǒng)的觀點認為PPO的激活是通過絲氨酸蛋白酶（serine proteases）將PPO剪切成為PO來實現的，但r PPO3在自激活后并沒有被酶剪切成為PO3，即rPPO3在酶原形式就有活性。另外，rPPO1和rPPO2對于Cu2+有著不同的反應速度［6］。這些特性與各個PPO蛋白的結構密切相關，參照煙草天蛾PPO的晶體結構，通過同源建模及突變體的表達，結果顯示，有兩個氨基酸位點可能通過改變PPO活性中心口袋的大小影響3個PPO的活性。另外，PPO3 C－端一段序列的缺失也能影響PPO3的活性以及自激活［20］。

4 昆蟲酚氧化酶的激活

酚氧化酶在血淋巴中是以酶原的形式存在的，含有N－端CLIP結構域的血淋巴絲氨酸蛋白酶在PPO氨基端的特定位點，如在Arg－Phe位點將其剪切激活。這些PPO激活蛋白酶本身在識別微生物感染后作為蛋白酶級聯(lián)反應的一部分所激活，在某些情況下，PPO的激活需要缺少酶活性的輔因子SPH（serine protease homolog）的參與。PPO激活級聯(lián)反應也受到絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine protease inhibitor，serpin）的調控，因為黑化反應對于生物體本身也具有損傷作用，因此其在時間和空間上都受到嚴格的控制。體內實驗表明，不受控制的黑化反應會產生過量的毒性中間產物，最終導致宿主的死亡［13］。

PPO激活的空間和時間調控發(fā)生在幾個水平。首先，PPO的激活依賴于對外源微生物細胞壁組分或其他觸發(fā)因子的識別，由此保證了黑化只在這些因子存在的地方發(fā)生。黑化觸發(fā)因子的識別導致了蛋白酶級聯(lián)反應的激活。由于這些蛋白酶本來就以非活性的酶原形式存在，PPO能夠在需要黑化的地方很快地激活。運用蛋白酶級聯(lián)反應激活PPO的另外一個好處是信號的放大，其中serpin也參與多個步驟的調控。在較大昆蟲的生化研究中表明，一旦PPO激活，PO的活性可能受聚類蛋白和一些PO抑制劑的調控，這樣就可以及時地關閉黑化反應［21］。

路岸瑞等總結了昆蟲PPO激活的三種機制［22］。大多數PPO的激活都需要從PPO中保守的Arg－Phe位點進行剪切，去掉N－端大約50個氨基酸。在家蠶中，最下游的酚氧化酶激活酶（PPO－activating enzyme，PPAE）將PPO1和PPO2從51RF52處剪切，成為有活性的PO1和PO2［22］。

在煙草天蛾中，PPO通過更加復雜的機制激活，已知三個直接剪切PPO的酚氧化酶原激活蛋白酶（prophenoloxidase activating proteinase，PAP）已被發(fā)現并鑒定出來。這三個PAP能夠在與家蠶相應的保守位點（PPO1是51RF52，PPO2是49RV50）處直接剪切PPO。然而，剪切后的PO活性非常低，但當輔助因子SPH存在時，PO的活性明顯提高［22］。

在東北大黑鰓金龜（Holotrichia diomphalia）中，三個PPO激活因子（PPO－activating factor，PPAF－I，PPAF－II和PPAF－III）已經被鑒定出來，當PPAF－I將Hd PPO1從保守的51RF52位點剪切后，得到的PO并沒有活性，當混合的三種PPAF將純化的PPO1從162RA163處再次剪切后，才產生了有活性的PO［22］。

果蠅PPO1的預測剪切位點也是在Arg－Phe位點，而PPO2和PPO3是在Arg－Val位點，但體外實驗發(fā)現，商品化的α－胰凝乳蛋白酶（α－chymotrypsin）至少在三個位點剪切PPO1，從而產生有活性的PO［22］。

在果蠅中，對PPO激活的信號通路了解的還很少。家蠶實驗證明，識別病原物并引發(fā)免疫反應的模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）尤其是肽聚糖識別蛋白（peptidoglycan recognition proteins，PGRPs）家族能夠激活PPO［23］。在果蠅中，PGRP－LE參與到微生物誘導的黑化中［24］。Imd信號通路信號上游的PGRP－LC的過表達導致幼蟲和成蟲的大量黑化［25］。在果蠅中，目前已鑒定出兩個絲氨酸蛋白酶，MP1（Melanization Protease 1）和MP2（Melanization Protease 2），在黑化級聯(lián)反應的激活中起作用［26］。MP1或MP2的過表達都能誘導組成性的黑化和半致死，而MP1或MP2的敲除減少了微生物感染后PPO的激活和黑化反應［26］?，F有的研究表明果蠅中有三個serpin參與調控黑化反應。Spn27A是第一個鑒定出來的調控PPO激活和血淋巴黑化的serpin。Spn27A功能喪失的突變導致果蠅的黑化和半致死，Spn27A的過表達抑制了微生物誘導的PPO的激活［21］。Spn28D可能通過清除PPO，抑制微生物感染誘導的黑化和表皮著色，起到阻止PPO過早激活的作用［21］。Spn77Ba是果蠅呼吸系統(tǒng)氣管中的一個黑化調控因子［13］。

5 昆蟲酚氧化酶的功能

酚氧化酶屬于3型含銅蛋白，該蛋白家族在動物、植物和相當數目的微生物中都有發(fā)現并行使著多種多樣的生物學功能［18，22］。酚氧化酶是黑色素合成中最重要的酶之一，外源病原物的殺死、血液凝集、抗菌肽表達、傷口愈合和糞便黑化等多種功能都與酚氧化酶及其參與的黑化反應有著密切的關系［12，21，22］。

在昆蟲的天然免疫系統(tǒng)中，Toll和Imd兩條信號轉導通路控制著抗菌肽及其他免疫相關效應分子的表達［27］。然而，面對病原微生物的入侵，兩條信號轉導通路往往需要數小時到數天的時間來誘導其控制的效應分子的表達。相反地，黑化反應在感染發(fā)生后幾分鐘內就可以起作用，其產生的黑色素及中間產物活性氧對病原物有著直接的毒性，將病原物在黑色素囊中隔離可以阻止它在宿主的擴散［21］。正是由于其在體內的快速激活，昆蟲PPO也是傷口愈合中的重要蛋白。黑化反應中產生的黑色素在傷口的沉積有助于傷口愈合。因此，酚氧化酶在無脊椎動物，特別是節(jié)肢動物中是免疫防御的一個重要組成部分［21］。

在果蠅中，MP2 RNAi以后，PPO1和PPO2均不能被剪切，但通過感染革蘭氏陽性菌、陰性菌以及病原真菌，發(fā)現MP2 RNAi的果蠅中并不比野生型的果蠅敏感。在其他一些節(jié)肢動物中發(fā)現，黑化對于抵抗細菌侵染的重要性在物種間有很大的差異。在岡比亞按蚊中，通過RNAi敲除PPO激活所必須的CLIPA8后，發(fā)現RNAi的蚊子在大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）感染后的表現與野生型類似。這個發(fā)現說明黑化反應對于蚊子抗擊細菌感染并不重要［28］。然而黑化反應對于煙草天蛾的免疫系統(tǒng)可能比較重要，比如，煙草天蛾的病原菌發(fā)光桿菌（Photorhabdus luminescens）的毒性依賴于一個可以抑制PO活性的化合物羥基芪（hydroxystilbene），缺乏這個化合物的細菌沒有毒性［29］。而且，通過RNAi抑制宿主PPO的表達后顯著地提高了煙草天蛾對于發(fā)光桿菌的敏感度［29］。酚氧化酶參與的黑化對于宿主抵御天敵黃蜂可能也有著非常重要的意義。在果蠅中，破壞黑化反應的突變對于體內寄生蟲黃蜂（Leptopilina boulardi）有著顯著降低的免疫能力［30］。

除了抵御微生物和寄生蟲侵染等功能外，昆蟲PPO還參與昆蟲糞便的黑化。邵奇妙等人的研究表明，家蠶后腸表皮細胞能夠產生PPO并釋放到后腸內容物中，后腸PPO是植食性昆蟲食綠葉但分泌黑色糞便的原因。當PO活性被PTU（phenylthiourea）所抑制，昆蟲會分泌綠色的糞便，且這些綠色糞便所含細菌的量，要遠遠多于黑色糞便。因此，昆蟲利用后腸PPO所參與的黑化反應，清除糞便中所攜帶的潛在病原物，從而保證食物免受病原物的污染［12］。

6 展望

作為昆蟲一種重要的先天性免疫防御機制，黑化反應的研究引起了廣泛的關注，而酚氧化酶作為黑化反應中的關鍵酶，一直是研究昆蟲先天性免疫的熱點。借助于遺傳學手段和煙草天蛾等的體外生化實驗，對于昆蟲酚氧化酶的研究也越來越深入，但是對于其具體的激活和調控機制，還有待于進一步的研究。近期煙草天蛾PPO異二聚體晶體結構的解析完成，也為其功能研究提供了更多的參考依據。

類型3含銅蛋白在結構和功能上有很多相似性，且在自然界廣泛分布并行使著重要功能，由于昆蟲生長周期短，昆蟲PPO的研究將是研究這一類蛋白家族很好的模型。

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［責任編輯 朱毅然］

Advances on the Research of Insect Phenoloxidase

LIU Fei
（1．College of Life Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2．Department of Biological Science and Technology，Shaanxi Xueqian Normal University，Xi’an 710061，China）

Phenoloxidase（PO），belongs to a group of type－3－copper－containing proteins，which distributes in the nature widely and possesses a variety of important functions．PO is one of the most important enzyme in the synthesis of melanin．Pathogen killing，blood coagulation，antimicrobial peptide expression，wound healing and feces melanization in insects are all closely related with the PO．PO exists in insects as an inactive form called prophenoloxidase（PPO）．In this paper，we mainly reviewed the recent advances on the research of the source，detection，structure，activation，and function of insect PO，in order to provide some new ideas for further exploring of the possible application of phenoloxidase in agricultural pest control．

phenoloxidase；source；detection；structure；activation；function

Q55

A

2095－770X（2015）06－0120－05

2015－04－15；

2015－06－12

中國博士后第56批面上資助項目（2014M562369），陜西學前師范學院引進人才科研啟動基金項目（2014DS008），陜西學前師范學院校級科研基金項目（2015YBKJ024）

劉菲，女，陜西西安人，陜西學前師范學院講師，理學博士，主要研究方向：昆蟲免疫學。