潘孝武 李小湘 黎用朝 姚奕 劉文強 盛新年

（湖南省水稻研究所，長沙 410125）

水稻生殖發(fā)育期耐熱性的分子遺傳機制研究進展

潘孝武 李小湘 黎用朝 姚奕 劉文強 盛新年

（湖南省水稻研究所，長沙 410125）

水稻在生殖發(fā)育期對高溫脅迫非常敏感，高溫熱害已經(jīng)成為水稻生產(chǎn)最重要的限制因子之一。闡明水稻在生殖發(fā)育期耐熱性的分子遺傳機制，挖掘耐熱關(guān)鍵基因，利用基因工程以及分子標記輔助選擇的方法改良水稻品種的耐熱性具有重要意義。從水稻生殖發(fā)育期耐熱性的數(shù)量性狀基因定位（QTL）、轉(zhuǎn)錄以及蛋白水平的高溫應(yīng)答、耐熱轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域的進展進行了概述。

水稻；生殖發(fā)育期；耐熱性；分子遺傳機制

隨著全球氣候變暖以及極端天氣的不斷發(fā)生，高溫脅迫已經(jīng)成為水稻生產(chǎn)最重要的限制因子之一［1］。預(yù)計到21世紀末，受高溫熱害威脅的水稻種植區(qū)將由2000年以前的57 Mha達到121 Mha［2］。水稻對高溫非常敏感，Peng等［3］通過對1979-2003年氣象資料以及水稻產(chǎn)量的分析后發(fā)現(xiàn)，水稻生長季的平均最低溫度每上升1℃，水稻的產(chǎn)量下降10%。2013年，我國長江流域水稻種植區(qū)38℃以上的高溫持續(xù)了20多天，部分水稻品種結(jié)實率的下降幅度超過50%［4］。

水稻各個生育期，包括營養(yǎng)生長期、生殖發(fā)育期及灌漿期都受到高溫脅迫的影響，其中生殖發(fā)育期對高溫最為敏感，在開花當天33.7℃以上的高溫處理1 h就能引起水稻敗育［5，6］。在生殖發(fā)育期，高溫脅迫阻礙花粉成熟與花藥開裂，減少柱頭上的花粉數(shù)目、并抑制花粉的萌發(fā)以及花粉管的伸長，從而導致結(jié)實率下降［7］。同時，高溫脅迫引起光合作用系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)損傷，降低光能轉(zhuǎn)化效率，減少光合產(chǎn)物向花器官的轉(zhuǎn)移［8，9］。不同水稻品種的耐熱性存在差異，目前生產(chǎn)上大面積推廣的水稻品種由于遺傳基礎(chǔ)狹窄，耐熱性尤其在生殖發(fā)育期的耐熱性普遍較差。為培育耐熱穩(wěn)產(chǎn)水稻品種，闡明水稻的耐熱性機制至關(guān)重要。本文重點回顧了水稻在生殖發(fā)育階段的遺傳定位以及轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的分子應(yīng)答機制研究進展。

1 水稻生殖發(fā)育期耐熱性的遺傳定位

1.1 水稻生殖發(fā)育期耐熱性的遺傳方式

水稻對高溫脅迫的耐受性受到遺傳基因的控制，耐熱性的遺傳方式在不同的生育期并不一致。Wei等［10］利用耐熱性不同的兩個水稻材料構(gòu)建F2群體，在9號染色體上檢測到一個主效顯性QTL控制苗期的耐熱性，并推測QTL區(qū)間內(nèi)候選基因OsZFP的差異表達是引起品種間耐熱性差異的主要原因。與苗期耐熱性不同，水稻在生殖發(fā)育期的耐熱性與花粉活力、花藥形態(tài)結(jié)構(gòu)、柱頭特性等多種因素相關(guān)。Jagadish等［11］通過對N22、IR64以及敏感品種Matsui的比較后發(fā)現(xiàn)，品種之間在花藥長寬、花藥開裂孔徑、柱頭長度等性狀上存在明顯差異，N22在高溫脅迫下的花粉萌發(fā)率高于其他品種。Tsutomu等［12］發(fā)現(xiàn)，高溫引起的水稻穎花敗育率與藥室-裂口間隔區(qū)的細胞層數(shù)目呈負相關(guān)，這些細胞層有助于保持相鄰藥室的關(guān)閉，從而阻止散粉，導致穎花敗育。與熱敏感品種Hinohikari相比，耐熱品種日本晴的藥室壁厚但裂口區(qū)細胞數(shù)目較少，穎花在花粉吸水膨脹后能快速開裂［13］。因此，水稻在生殖發(fā)育期的耐熱性屬于典型的數(shù)量性狀，受多基因控制。

1.2 水稻生殖發(fā)育期耐熱性的QTL定位

野生稻是栽培稻的近緣祖先，主要分布在熱帶亞熱帶地區(qū)，其中蘊藏著豐富的耐逆基因。奎麗梅等［14］利用以秈稻品種特青為遺傳背景的云南沅江普通野生稻滲入系為材料，在溫室條件下共檢測到4個抽穗開花期耐熱性相關(guān)的QTL，分別位于1，3，8，10號染色體上，對表型的貢獻率為6%-12%。利用相同的滲入系群體，Lei等［15］共檢測到5個控制苗期耐熱性的QTL，分別位于1，2，3，8號染色體上。其中qHTS3與奎麗梅等研究中的qHT3位置相近，說明抽穗開花期耐熱性與苗期耐熱性有一定的相關(guān)性。野生稻的開花習性與栽培稻差異較大，Ishimaru等［16］發(fā)現(xiàn)一種耐熱的藥用野生稻資源，這種野生稻的穎花開放時間較早（7∶00-11∶00），開花時間避開了日中午的高溫天氣，從而表現(xiàn)出較強的耐熱性。Thanh等［17］利用日本晴與耐熱野生稻構(gòu)建回交重組自交系群體，對首朵穎花開放的時間（SOTb）和50%穎花開放的時間（SOTm）進行了定位，在第5和10號染色體上檢測到兩個控制SOTb的QTL，在第4和5號染色體上檢測到兩個控制SOTm的QTL［17］。

在長期的進化過程，由于生長環(huán)境的差異，秈稻的耐熱性一般比粳稻強［18，19］。因此，相關(guān)的研究常利用秈粳交群體對開花期耐熱性進行基因定位。曹立勇等［20］利用秈粳交獲得的DH群體，在第1，3，4，8和11號條染色體上，共檢測到6個控制高溫下水稻結(jié)實率的QTL，對表型的貢獻度為1.28%-22.81%。趙志剛等［21］利用秈粳交回交群體為供試材料，以小穗育性熱敏感指數(shù)為指標，在第4、8染色體上分別檢測到兩個孕穗期耐熱性相關(guān)的QTL，對表型變異的解釋率分別為16.8%和9.9%。Cheng等［22］利用粳稻品種秀水9號和秈稻品種IR2061構(gòu)建高代回交導入系，對開花期高溫脅迫下的結(jié)實率進行定位，在4，5，6，11號染色體上共獲得4個QTL。Jagadish等［23］將秈稻品種Bala（有N22的遺傳背景）與旱地粳稻品種Azucena雜交構(gòu)建重組自交系，以38℃高溫處理下的結(jié)實率為考察指標，檢測到8個QTL，分別分布在1、2、3、8、10和11號染色體上，其中1號染色體上的QTL對表型的貢獻度達到18%。這些研究都以結(jié)實率或者穎花育性作為鑒定指標，而Tazib等［24］利用Nipponbare/Kasalath回交重組自交系群體，對與耐熱性密切相關(guān)的花藥長度、花藥頂端開裂長度、基本開裂長度以及縱裂度進行了定位，分別檢測到4、3、4、1個QTL。秈稻與粳稻的耐熱性差別較大，但耐熱性鑒定結(jié)果常受到秈粳雜種不育的干擾，部分后代群體材料在正常條件下的結(jié)實率較低，影響定位結(jié)果。

耐熱性在秈稻之間也存在明顯分化，陳慶全等［25］利用秈稻恢復系T219和T226構(gòu)建重組自交系，在人工氣候室進行了2年的耐熱性鑒定，共檢測到6個控制高溫下結(jié)實率的主效應(yīng)QTL，分別分布在2、3、8、9（qHT9a和qHT9b）和12號染色體上。Xiao等［4］利用雜交稻親本996和4628構(gòu)建重組自交系，在田間自然條件和人工氣候室條件下對群體各株系進行開花期耐熱性鑒定，在4號和10號染色體上檢測到兩個QTL控制水稻在高溫條件下的結(jié)實率，對表型的貢獻度分別為21.3%和25.8%。使用同樣的群體，盤毅等在4號和6號染色體上共檢測到兩個QTL，控制開花期高溫脅迫下的花粉育性［26］。其中4號染色體上的QTL與Xiao等以結(jié)實率為鑒定指標定位到的SSPc4位于同一位點，說明高溫脅迫下的花粉育性與結(jié)實率有一致性，同時存在差異。Ye等［27］用IR64×N22雜交構(gòu)建了F2和BC1F1群體，通過SNP標記檢測控制高溫脅迫下結(jié)實率的QTL，共獲得4個QTL，分別位于1、4、9和11號染色體上，其中1號和4號染色體上的QTL對表型的貢獻度分別為12.6%和17.6%。這些研究利用生產(chǎn)上主栽的水稻品種或者雜交稻親本構(gòu)建群體，在開展耐熱性定位的基礎(chǔ)上，利用分子標記輔助選擇能快速改良主栽水稻品種耐熱性。

通過對這些耐熱性定位結(jié)果的比較分析發(fā)現(xiàn)，生殖發(fā)育期耐熱性QTL在每一條染色體上都有分布，且大部分QTL的貢獻度都較小，表明開花期耐熱性的遺傳機制非常復雜。其中一部分QTL在不同的研究中都被定位到，Ye等研究中的qHTSF9.1與陳慶全等利用T219×T226群體定位到的qHT9a，b，qHTSF1.1、qHTSF11.1與Jagadish等利用Bala×Azucena群體定位到的qtl_1.1、qtl_11.1，qHTSF4.1與Xiao等利用996×4628群體定位到的SSPc4基本一致或者位于相似的區(qū)域。還有一部分QTL只在特定的研究中被檢測到，造成這種差異的可能原因包括資源與群體類型、耐熱性鑒定體系以及定位方式的差別，其中耐熱性鑒定體系是影響耐熱性定位的主要影響因素，制約了進一步的耐熱性精細定位和基因克隆。

1.3 水稻生殖發(fā)育期耐熱性的鑒定方法

水稻耐熱性鑒定是篩選耐熱種質(zhì)資源的基礎(chǔ)，耐熱性鑒定方法的科學性是保證定位結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。按照鑒定環(huán)境的不同，耐熱性鑒定可分為大田自然高溫［26］和人工氣候室高溫鑒定［18］兩種方式。根據(jù)當?shù)貧夂蛱攸c以及材料的生育期，大田鑒定一般采用分期播種方式，使每一份水稻材料都能在生殖發(fā)育期遇上高溫。大田鑒定與育種實踐相統(tǒng)一，能真實反映水稻材料在田間的耐熱性，但受到氣候條件的制約，年度間重復性欠佳。人工氣候室鑒定方式的環(huán)境條件可控，最高溫度一般設(shè)置為37℃-38℃，但溫度變化在不同的研究中差異明顯。例如，Ye等［27］在開花時間段（8∶30-15∶30）38℃連續(xù)處理水稻14 d，以保證每朵穎花的開放都處于高溫脅迫下。而Xiao等［4］則模擬自然溫度，在開花時間段的溫度不斷升高，最高溫度設(shè)為37℃。部分開花時間較早的株系可能避開了高溫脅迫，從而影響定位結(jié)果。另外，耐熱性的鑒定也受到空氣濕度和風速的影響，澳大利亞部分地區(qū)田間溫度超過40℃，但水稻產(chǎn)量損失較少，主要原因是風速大且空氣相對濕度較低，蒸騰冷卻效應(yīng)引起穗溫顯著下降［28］。Van Oort等［29］提出，水稻開花時間從12∶00提前到9∶00會減少7%-35%的不育率，忽視蒸騰冷卻效應(yīng)會導致不育率被高估14%-73%。因此在人工氣候室條件下控制溫度、濕度及風速，保證均一的環(huán)境條件非常關(guān)鍵。耐熱性的鑒定指標主要包括結(jié)實率、花粉育性、花藥開裂度以及柱頭上的花粉數(shù)目等，其中結(jié)實率是最普遍的考察指標。例如，陳慶全、Zhang等［25，30］在高溫處理7 d后考察整株水稻的結(jié)實率，Xiao等［4］在高溫處理4 d后調(diào)查稻穗上半部分的結(jié)實率，而Jagadish等［23］只保留3個同時抽穗的分蘗，高溫處理14 d后考察標記穗的結(jié)實率。因此，應(yīng)根據(jù)處理強度選擇合理的考種對象，從而更真實的反映種質(zhì)之間的耐熱性差異。

2 水稻生殖發(fā)育期耐熱性的分子應(yīng)答機制

在耐熱性的分子應(yīng)答機制方面，目前的研究利用基因芯片、轉(zhuǎn)基因、雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜等手段開展了探索，在生殖發(fā)育期分析功能葉以及花器官的基因以及蛋白表達變化，篩選與耐熱性密切相關(guān)的差異表達基因或者蛋白。

2.1 轉(zhuǎn)錄水平的應(yīng)答機制

水稻的生殖發(fā)育期包括從始穗至開花授粉的整個過程，不同階段的基因表達特性存在差別［31，32］。使用耐熱秈稻品種996，Zhang等［33，34］在花藥發(fā)育的第8期進行40℃高溫處理，并檢測了處理后5個時間點劍葉以及幼穗中的基因表達譜。以表達水平在兩個時間點以上變動3倍作為標準，在劍葉和幼穗中分別篩選到4153和2449個高溫應(yīng)答基因（HR），這些基因主要編碼轉(zhuǎn)錄因子、熱激蛋白（HSP）、代謝酶類以及運輸?shù)鞍椎?。其中大量的轉(zhuǎn)錄因子基因，包括HSF、bHLH、MYB、WRKY及NAC等家族基因被誘導表達。在高溫早期應(yīng)答基因的啟動子序列中，這些轉(zhuǎn)錄因子特異識別的順式作用元件包括HSE、GCC box、ABRE等富集，進一步說明了轉(zhuǎn)錄調(diào)控在水稻耐熱性的重要作用。使用粳稻品種日本晴，Endo等［35］在小孢子發(fā)育階段進行高溫處理，利用基因芯片共篩選到1 439個表達變化2倍以上的HR基因。其中磷脂酶、細胞色素P450等編碼基因被抑制表達，推測這些基因的抑制表達引起絨氈層的部分功能缺失，導致花粉不能正常的附著在柱頭上。使用兩系雜交稻母本培矮64S，王曼玲等［36］在孕穗和抽穗期分別45℃處理2 h，在葉片中共篩選到2 600個表達變化8倍以上的基因。其中上調(diào)表達的基因1 163個，包括熱激蛋白，蛋白酶抑制劑、細胞分裂相關(guān)蛋白等編碼基因；下調(diào)表達的基因1 437個，包括光系統(tǒng)Ⅱ受體相關(guān)蛋白，糖基轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶等編碼基因。這些研究結(jié)果表明，高溫引起大量基因的表達變化，HSF等轉(zhuǎn)錄因子以及Hsp等編碼基因被誘導表達，而代謝酶類編碼基因等受抑制表達，這些基因的差異表達可能引起下游蛋白水平的表達差異。

2.2 蛋白水平的應(yīng)答機制

蛋白質(zhì)組學近年來成為水稻耐逆性的重要研究手段，在水稻耐熱性方面的研究已有綜述報道［37］，但在生殖發(fā)育期的研究報道不多。利用熱敏感品種明恢63和耐熱品種密陽46，周偉輝等［38］研究了穗期高溫脅迫下劍葉中的蛋白響應(yīng)，其中光合作用關(guān)鍵酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）的表達量大幅度下降，而過氧化氫酶的表達量上升。蛋白研究的結(jié)果與張桂蓮［39］、曹云英等［40］的生理結(jié)果一致，高溫脅迫下劍葉中的光合效率下降、抗氧化酶活性上升。使用耐熱性不同的3個水稻品種Moroberekan、IR64以及N22，Jagadish等［11］利用雙向電泳技術(shù)共分離到46個高溫響應(yīng)蛋白。其中一個熱激蛋白（Hsp）和一個冷激蛋白（Csp）在耐熱品種N22中強烈誘導表達，但在敏感品種Moroberekan中則顯著抑制表達。研究結(jié)果表明，Hsp以及Csp等蛋白的差異表達可能是引起品種間耐熱性差異的重要原因。

2.3 Hsp在水稻耐熱性過程中的作用機制

熱激蛋白（Hsp）是組織細胞受到高溫等不良環(huán)境條件誘導表達的一類蛋白。根據(jù)分子量大小，Hsp可以分為小分子熱激蛋白（sHsp）、Hsp40/ DnaJ、Hsp60/GroEL、Hsp70/DnaK，Hsp90/HtpG以及Hsp100/ClpB家族。Hsp受到上游轉(zhuǎn)錄因子HSF（heat shock transcription factor）的調(diào)控，在高溫脅迫下HSF快速誘導并特異識別Hsp基因啟動子序列中的HSE（heat shock elements）元件，調(diào)節(jié)Hsp基因的表達水平［41，42］。在脅迫條件下，Hsp及其他的輔因子與變性靶蛋白形成復合體，阻止變性蛋白的聚集，在恢復生長階段則參與靶蛋白的重折疊及運輸，從而保證細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［43］。根據(jù)水稻基因表達數(shù)據(jù)，Wang等［44］共篩選到430個Hsp70s的候選互作蛋白。Hsp通過與這些蛋白互作，在脅迫條件下共同影響生物大分子定位、糖代謝、植物免疫、光系統(tǒng)修復以及信號轉(zhuǎn)導等多個生物學過程。這種互作效應(yīng)在很多研究中獲得了證實，Hsp70能夠降低檸檬酸合酶在高溫脅迫下的聚集［45］，與D1蛋白結(jié)合參與光系統(tǒng)II的損傷修復過程［46］。另外，Lin等［47］發(fā)現(xiàn)Hsp100/ClpB家族蛋白Hsp101與高溫誘導蛋白HSA32（Heat stress associated 32-KD protein）互作，參與水稻的獲得性耐熱過程。

2.4 水稻耐熱性的轉(zhuǎn)基因研究

根據(jù)轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的分析結(jié)果，與耐熱性密切相關(guān)的基因主要編碼轉(zhuǎn)錄因子、糖代謝相關(guān)酶、Hsp以及抗氧化酶等。利用轉(zhuǎn)錄因子基因，在水稻中過量表達OsWRKY11以及OsMYB55能夠提高下游靶基因的表達水平，增強水稻在苗期的耐熱性［48，49］。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酯酶（SBPase）是植物光合作用過程中的關(guān)鍵酶，過量表達OsSBPase能提高水稻的耐熱性，轉(zhuǎn)基因植株在高溫脅迫下的光合作用效率較高［50］。利用Hsp基因提高水稻耐熱性已有大量報道［51-53］，轉(zhuǎn)Hsp基因水稻在高溫脅迫下的活性氧積累較少，恢復生長較快。這些轉(zhuǎn)基因研究主要提高了水稻在苗期的耐熱性，但在生殖發(fā)育階段耐熱性的轉(zhuǎn)基因報道較少。Qin等［64］在水稻中過量表達小麥高溫誘導基因TaMBF1c，轉(zhuǎn)基因水稻中Hsp基因的表達水平提高，在苗期和生殖發(fā)育期的耐熱性都得到增強。

3 展望

隨著水稻耐熱性研究的不斷深入，如何利用耐熱水稻資源，結(jié)合分子標記輔助選擇快速改良主栽品種的耐熱性成為研究的熱點。大量的研究對水稻生殖發(fā)育期的耐熱性開展了QTL定位，但定位的精度不夠，缺乏與耐熱性緊密連鎖的分子標記。目前對開花期耐熱性基因的精細定位和克隆還未見報道，其中最主要的制約因素是耐熱性表型鑒定的精準度不夠。水稻耐熱性鑒定受到溫度、空氣濕度、風速、開花時間、光照強度等多方面因素的影響，如何建立標準化的耐熱性鑒定體系成為未來耐熱基因定位的關(guān)鍵。

水稻在生殖發(fā)育期特別是開花期對高溫脅迫最為敏感，增強水稻在這一時期的耐熱性有助于提高水稻產(chǎn)量，在生產(chǎn)上具有重要意義。目前的轉(zhuǎn)基因研究利用耐熱相關(guān)基因增強了水稻在苗期的耐熱性，但在生殖發(fā)育階段耐熱性的轉(zhuǎn)基因報道較少。如何挖掘耐熱關(guān)鍵基因，在高溫脅迫下增強轉(zhuǎn)基因水稻的花藥開裂度、花粉活力以及花粉萌發(fā)數(shù)成為下一步研究的重點方向。

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Advances on Molecular and Genetic Mechanisms of Rice Heat Tolerance at the Reproductive Stage

Pan Xiaowu Li Xiaoxiang Li Yongchao Yao Yi Liu Wenqiang Sheng Xinnian
（Hunan Rice Research Institute，Changsha 410125）

Heat stress has become one of the most devastating factors limiting the rice production, especially at the reproductive stage. Elucidating the molecular and genetic mechanism is therefore significant for improving the heat tolerance of rice varieties by genetic engineering or maker assisted selection. In this paper, we review the research advances on heat-tolerance QTL, transcript and protein response to heat stress, and genetic engineering for heat tolerance in rice.

rice；reproductive stage；heat tolerance；molecular and genetic mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.001

2014-12-31

湖南省農(nóng)業(yè)科學院-省自然科學基金委聯(lián)合資助項目（14JJ6052），國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（nycytx-001）

潘孝武，男，博士研究生，研究方向：水稻種質(zhì)資源與分子育種；E-mail：pxw137@163.com

黎用朝，男，研究員，研究方向：水稻遺傳育種；E-mail：yongchao_l@hotmail.com