韓霄

（中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081）

從作物的源流庫理論展望新型育種技術

韓霄

（中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081）

綜述了源流庫理論的進展，著重描述了維管束作為流的通道不僅能夠運輸營養(yǎng)物質(zhì)而且轉運不同種類的生物信號。結合最新的研究進展，針對反向育種中染色體非重組和染色體消除兩個重要步驟，展望了利用維管束轉運基因沉默信號實現(xiàn)花器官染色體操作的技術，為反向育種技術提供新的思路。

源流庫；維管束；篩管；反向育種；長距離運輸

作物生產(chǎn)的基礎是利用光合作用合成養(yǎng)分并運輸?shù)教囟ǖ慕M織器官進行消耗或者儲藏。圍繞這三個階段，源流庫理論將供給源、運輸流和儲存庫的生理特性進行了歸納總結，以此來分析作物產(chǎn)量的限制因素。對源流庫理論的深入研究為作物育種和栽培技術的發(fā)展產(chǎn)生了深遠的影響。隨著植物科學基礎研究的不斷深入，源流庫理論中光合同化物的運輸被認為不僅是供給養(yǎng)分，還是生物信號長距離運輸?shù)闹匾?qū)動力之一。植物激素、轉錄因子、siRNA和miRNA在篩管中隨著蔗糖運輸，從源到庫調(diào)控植物的生長發(fā)育和生理反應。源流庫中的“流”不僅是養(yǎng)分的流動，還是生物信號高速通道中的信息交流。從篩管中搭載的生物信號的多樣性和重要性，可以窺見源流庫理論在植物科學中的關鍵地位。然而長期以來，源流庫理論并未對育種技術本身產(chǎn)生任何影響。近年來，反向育種技術被提出并投入到實踐中，成為與無融合生殖技術一樣固定雜交優(yōu)勢的新型育種技術。該技術需要改造多個基因，在作物花器官中阻止染色體的重組和實現(xiàn)染色體的選擇性消除。結合源流庫技術，將關注點從光合同化物轉移到生物信號的長距離運輸上，最新的研究發(fā)現(xiàn)針對染色體重組酶DMC1等基因設計的siRNA信號可以利用篩管“流”輸送到“庫”，也就是花器官，進而通過沉默DMC1等基因來實現(xiàn)染色體操作，為反向育種技術提供了新的思路。

1 源流庫理論

源流庫理論描述了作物生產(chǎn)的過程，提出光合同化物從營養(yǎng)器官合成后，經(jīng)過運輸，分配到種子、塊莖和果實等消耗或貯藏同化產(chǎn)物的組織器官。依據(jù)光合同化物的不同狀態(tài)場所，整個作物生產(chǎn)過程在源流庫理論中被明確劃分為供給源、運輸流和儲存庫三個階段。不同階段的特征及其協(xié)調(diào)性是提高作物產(chǎn)量最直接的限制因素。20世紀20年代末，Mason和Maskell根據(jù)棉花體內(nèi)光合同化物的分配方式最早提出了該理論。長期以來，研究者對源流庫不同階段對作物產(chǎn)量的影響進行了深入的探索。

早期在玉米產(chǎn)量和種植密度的研究中，人們發(fā)現(xiàn)葉片作為光合源直接影響了玉米的產(chǎn)量。進一步對玉米葉片形態(tài)的研究，揭示了減少葉片夾角在密植情況下可以提高產(chǎn)量［1］。隨著植物學研究的發(fā)展和植物生長調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)，研究者們能夠利用植物生長調(diào)節(jié)劑減緩葉片的衰老和提高葉片葉綠體的含量［2，3］。這個手段在增產(chǎn)上取得了一定的效果，更加證實了葉片作為光合源在作物生產(chǎn)中的重要角色。在研究光合供給源的同時，對谷物種子儲存庫的認識也不斷深入。例如，在玉米禿尖和敗育的研究中，發(fā)現(xiàn)不同穗部位間的籽粒在營養(yǎng)物質(zhì)分配上存在著競爭關系［4-6］。頂部籽粒的敗育就是因為在競爭中處于劣勢而缺乏養(yǎng)分。由此可見儲存庫在作物生產(chǎn)中的重要性。研究者們針對籽粒庫展開了更廣泛的工作，發(fā)現(xiàn)籽粒的大小、多少和代謝活性是決定庫容強度的關鍵因素，也是提高作物產(chǎn)量的關鍵點。在源流庫理論中，運輸流連接供給源和儲存庫，其重要的功能主要通過植物維管束的篩管來實現(xiàn)。大量的解剖結構觀察揭示了維管束的數(shù)目、大小和連接方式是植物調(diào)節(jié)運輸流和產(chǎn)量的重要手段［7］。源流庫理論不僅對作物生產(chǎn)過程進行分段式研究，同樣重視三者之間的制約和協(xié)調(diào)，為作物生產(chǎn)提供了堅實的理論基礎。

在作物栽培實踐中，源流庫理論的指導也取得了許多積極的成果。依據(jù)源流庫理論，對作物的生長階段也劃分了營養(yǎng)生長、生殖生長和灌漿成熟3個時期，通過合理的施肥灌溉等栽培技術，可以合理的調(diào)節(jié)光合同化物的分配和協(xié)調(diào)源流庫的關系，從而提高產(chǎn)量。例如20世紀后半葉，荷蘭的冬小麥增產(chǎn)主要就是因為成功地提高了粒稈比例。水稻的高產(chǎn)栽培技術體系，也逐漸形成了精播培育壯苗、提高分孽成穗率以及注重穗大、粒多和粒重的觀點。玉米的合理密植已經(jīng)在各個地方大面積推廣，并且育種中也充分考慮高光效的株型選擇和利用?；谠戳鲙炖碚?，粒葉比、比葉重、最適葉面積指數(shù)等衡量標準也被應用到水稻超高產(chǎn)的品種選育中。

2 維管束在“流”的作用

在植物中，維管束組織在“源、庫、流”中作為“流”的高速通道，承擔了光合同化物的長距離運輸。維管束組織的有無往往是高等植物與低等植物劃分的界限，在所有的農(nóng)業(yè)作物中都具有該組織。在高等植物的莖、葉（維管束在葉片中通常稱為葉脈）和根等器官中均具有維管束組織，它們相互連接，使得植物各器官組織在各自具有功能分工的同時卻形成有機連通的整體。根部吸收水分和無機鹽后，通過維管束轉運到葉片；葉片光合作用產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)，同樣通過維管束轉運到根部和生殖器官，供給生理活動的能量。

維管束的韌皮部和木質(zhì)部分別行使光合同化物運輸和水分運輸?shù)墓δ?。葉片和莖稈維管束的這兩種組織都來源于植物頂端分生組織的分化，首先產(chǎn)生原形成層細胞，然后細胞向內(nèi)分化為木質(zhì)部，向外分化為韌皮部。木質(zhì)部細胞由管狀細胞、薄壁組織和纖維組織構成；韌皮部則含有篩管細胞、伴胞、薄壁組織和厚壁組織。導管細胞木質(zhì)化后形成死細胞，兩端的細胞壁降解，細胞膜具有穿孔，從而形成了連續(xù)的通道，是水分和無機鹽的長距離運輸通道。篩管細胞沒有木質(zhì)化過程，同樣由兩端大量的篩孔連通，使得光合產(chǎn)物能夠進行長距離運輸。

維管束承擔著“源、庫、流”中作為“流”的環(huán)節(jié)，對作物產(chǎn)量的影響很大。大量研究已證明，水稻穗頸節(jié)間大維管束的數(shù)目、大小是影響產(chǎn)量的重要因素之一。C4植物維管束作為花環(huán)狀結構的組織中心，縮短了葉肉細胞和維管束鞘細胞的平均距離，有利于代謝物的運輸，是C4植物高光效的主要結構特征之一。

3 維管束篩管長距離運輸?shù)慕M分

整個源流庫理論所關注的主要是作物產(chǎn)量，因此“流”的概念聚焦了光合同化物或有機養(yǎng)分的運輸。對維管束中篩管的認識在源流庫理論的框架下也就被局限在了光合同化物或者說糖分的長距離運輸。隨著研究技術的發(fā)展，特別是各種組學手段在植物研究領域的不斷深入應用，人們對維管束中篩管的功能闡述有了質(zhì)的飛躍。近20年來，大量的研究工作揭示了篩管的重要功能除了轉運光合同化物，還有就是長距離傳遞生物信號。在篩管中傳遞的生物信號相當廣泛，從各種植物激素、多肽信號到轉錄因子蛋白，甚至miRNA和siRNA都是篩管中重要的生物信號載體。不同的生物信號參與控制了植物復雜的生物學過程，包括細胞的分化、器官發(fā)生和植物發(fā)育，還涉及了多種環(huán)境刺激響應。因此，源流庫理論中的篩管通道不僅僅是植物供給能量養(yǎng)分的主動脈，還是植物生命程序的中樞神經(jīng)。

在諸多植物激素中，生長素在篩管中的運輸已經(jīng)有了較為清晰的理論模型來解釋。在模式植物擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn)，剪葉處理的植株根部缺乏足夠的生長素來促發(fā)側根的形成。用同位素標記的生長素示蹤，證實了生長素的確從葉片“源”長距離運輸?shù)搅烁康摹皫臁?。在植物中，生長素的轉運主要通過兩種不同的途徑。一方面，大量的生長素能夠搭載篩管中糖分的流動，迅速實現(xiàn)從源到庫的長距離運輸。另一方面，通過轉運蛋白，生長素在細胞之間跨膜轉運，相較前者而言是一個緩慢的過程。兩個途徑是整合在一起的，生長素導入篩管和從篩管中導出就需要轉運蛋白這個途徑。生長素被認為是器官發(fā)生的扳機，承載了側根、次生葉脈等器官分化發(fā)育的觸發(fā)生物信號。篩管中篩孔的大小，是調(diào)節(jié)生長素長距離運輸?shù)年P鍵點之一。不僅是生長素，細胞分裂素通過維管束的韌皮部運輸?shù)街参锔鞴伲瑳Q定了主根的生長。另外，被病菌浸染后葉片產(chǎn)生的水楊酸通過篩管從受激葉片運輸?shù)狡渌课唬梢栽斐芍参锏南到y(tǒng)性免疫。在水稻的篩管運輸液中還分離到了赤霉素、脫落酸等植物激素?；诟鞣N激素的重要作用，篩管是植物生長發(fā)育中信號傳遞的決定性場所。

蛋白質(zhì)相對于植物激素的分子量具有生物大分子的特征。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)也能夠通過篩管進行運輸，特別是轉錄因子承載了植物生長發(fā)育的信號。例如開花因子FT就是通過篩管運輸?shù)介_花分生組織，從而決定了花期這個重要的農(nóng)藝性狀［8］。轉錄因子SHR從根的中柱細胞移動到外層與轉錄因子SCR結合決定了內(nèi)皮層細胞的分化，影響了整個根系的發(fā)育［9］。在葉片花環(huán)狀結構形成的研究中，也推測了SHR-SCR從維管束中傳遞到周圍細胞，誘導了鞘細胞和葉肉細胞的特異性分化［10，11］。這一發(fā)現(xiàn)有助于解析C4高光效的花環(huán)狀發(fā)育機理，對改良水稻等作物光合作用效率有重大意義。高通量的蛋白質(zhì)組學研究揭示了篩管運輸液中包含的大量蛋白質(zhì)。白屈菜的篩管乳汁經(jīng)過二維凝膠電泳，檢測到21種蛋白質(zhì)。對羽扇豆的篩管分泌液進行二維蛋白凝膠電泳，最終鑒定出86種蛋白質(zhì)。從毛果楊（Populus trichocarpa）和美洲黑楊（Populus deltoides）的雜交種中提取篩管分泌液，通過蛋白質(zhì)譜的檢測發(fā)現(xiàn)其中含有100種蛋白質(zhì)［12，13］。這些蛋白質(zhì)按功能分類涉及了植物的代謝、環(huán)境抗逆響應和信號傳遞。直接對楊樹的維管束組織進行蛋白質(zhì)譜分析，則檢測出了超過2 000種蛋白質(zhì)［13］。在花曲柳的篩管液也發(fā)現(xiàn)了2 400多種蛋白質(zhì)，進一步的研究發(fā)現(xiàn)在環(huán)境條件的刺激下，其中大約400種蛋白質(zhì)的含量會發(fā)生改變［14］。在萵苣的篩管乳汁中，有大約300種蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)功能同樣涉及了廣泛的植物生物學過程，包括代謝、響應、發(fā)育、物質(zhì)轉運和信號轉導［15］。在水稻的篩管液中發(fā)現(xiàn)了100種蛋白質(zhì)，特別值得關注的是發(fā)現(xiàn)其中包括了FT-like蛋白質(zhì)，其在調(diào)控水稻花期中的作用有待更進一步深入研究［16］。在葫蘆科植物的篩管液篩管中也同樣發(fā)現(xiàn)了FT蛋白的存在，證實了FT調(diào)控花期和從源到庫的轉運需要篩管的運輸［17］。對南瓜的篩管液蛋白質(zhì)組分檢測研究較為深入，檢測出1 209種蛋白質(zhì)。特別是其中含有RNA結合蛋白、mRNA翻譯亞基和蛋白質(zhì)泛素降解復合體亞基，革新了對篩管中進行蛋白質(zhì)合成的認識［18，19］。

在植物的篩管液中，不僅發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)生物大分子，還檢測到了許多mRNA或者小RNA［20］。水稻的篩管液就含有thioredoxin h、oryzacystatin-I和actin的mRNA［21］。黃瓜CmNACP蛋白的mRNA也在篩管液中存在。通過miRNA芯片的檢測，發(fā)現(xiàn)了植物中miRNA通過篩管長距離運輸來調(diào)節(jié)營養(yǎng)環(huán)境的反應。無疑，篩管中的運輸不僅包括了植物激素這樣的小分子化合物，還囊括了大量蛋白質(zhì)和RNA這樣的生物大分子。這個運輸過程不是簡單的位置轉換，其中還牽涉到了許多復雜的生物學變化過程。

4 反向育種技術

在雜交育種中優(yōu)勢基因在減數(shù)分裂時發(fā)生遺傳重組，因此傳統(tǒng)的雜交育種技術需要通過幾代自交系的雜交獲得具有特定農(nóng)藝性狀優(yōu)勢的純合種子。幾代自交系的雜交耗時很長，使得育種成為一個長期的工作。為此，研究者們開發(fā)出了無融合生殖、雙單倍體育種和反向育種的技術。

無融合生殖是希望直接從二倍體體細胞（例如大孢子母細胞）獲得種子。在被子植物中沒有受精的卵或者在胚珠內(nèi)一些細胞能夠直接發(fā)育成胚。這種無性種子保持了體細胞的遺傳物質(zhì)，能夠固定雜種優(yōu)勢。在雜交水稻中能夠省去年年雜交制種的工作，并可多代使用種子，對作物生產(chǎn)具有重大的意義。但是該技術尚處于設計研發(fā)階段，距離生產(chǎn)應用還有相當長的時間［22］。雙單倍體育種往往是利用作物花藥減數(shù)分裂產(chǎn)生的單倍體配子培育為植株，再通過化學處理造成染色體加倍。形成的雙單倍體植株具有基因純合特性，整個周期相較雜交時程較短，因此在育種上具有非常重要的應用價值［23］。雖然花藥、小孢子或者胚珠離體培養(yǎng)再生單倍體的方法被廣泛采用，但離體培養(yǎng)的規(guī)?；?、種質(zhì)依賴性、白化苗和體細胞變異等問題制約了推廣，該技術仍然具有很大的局限性。反向育種是和雙單倍體整合形成的新型育種技術，是一個雜種重建過程［24-27］。首先選育染色體不交叉重組的半不育親本，然后通過染色體消除技術誘導形成單倍體，選擇基因型互補的單倍體直接雜交，即可重建原始的優(yōu)勢雜交種。該技術雖然避開了減數(shù)分裂的遺傳重組，但是整個染色體數(shù)目仍然能夠造成大量的基因型存在。因此對不同作物，構建親本單倍體系的工作量隨著作物染色體數(shù)目而增加。然而，相較于繁重的傳統(tǒng)雜交育種中幾代雜交工作，反向育種技術仍然節(jié)省了好幾代作物雜交的時間。

反向育種技術的關鍵就是利用內(nèi)在和外在的因素避免染色體的交換和重組，然后通過染色體選擇性消除技術獲得單倍體或者雙單倍體。在植物細胞減數(shù)分裂中控制染色體交換重組的關鍵性基因DMC1已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，實驗證明缺失或者沉默DMC1能夠阻止染色體重組［28］。接下來，通過屬間雜交或者特殊基因型直接雜交的方式選擇性消除染色體獲得單倍體或者雙單倍體是當前研究的熱點。20世紀70年代，Kao和Kasha創(chuàng)建了球莖大麥技術。該技術利用球莖大麥花粉對栽培大麥進行授粉，球莖大麥的染色體在F1代中選擇性消除，從而獲得了栽培大麥的雙單倍體或者單倍體。對單倍體可以再利用秋水仙堿處理進行染色體加倍。該技術啟發(fā)了作物屬間雜交甚至種間雜交誘導染色體消除和制備單倍體的技術，例如，普通小麥與球莖大麥、燕麥與玉米、小麥與玉米等。深入對球莖大麥與栽培大麥雜交過程進行研究，發(fā)現(xiàn)球莖大麥染色體消除是由于缺乏著絲粒組蛋白H3（CENH3）［29］。當球莖大麥給栽培大麥授粉后，HvCENH3（來自栽培大麥）和HbCENH3（來自球莖大麥）均被轉錄；HvCENH3可以順利地結合到栽培大麥的著絲粒，但不能結合球莖大麥著絲粒；HbCENH3也無法結合球莖大麥的著絲粒，其是否翻譯形成蛋白質(zhì)還有待研究；球莖大麥染色體由于著絲粒沒有組蛋白而鈍化，形成微核而最終降解。2010年，Ravi和Chan發(fā)現(xiàn)在擬南芥cenh3缺失突變體中轉入人工改造的CENH3-tailswap基因，可以在擬南芥中構建和球莖大麥一樣的染色體消除技術［24］。用野生型花粉對改造CENH3-tailswap的轉基因植株授粉，后代中產(chǎn)生大量的父本單倍體。而且單倍體植株不需要通過化學處理，自交結實后就能進行染色體加倍。由于每種作物都有同源的CENH3基因，通過人工改造CENH3構建單倍體極具應用價值。Ravi和Chan已經(jīng)計劃通過轉基因改造多種作物的CENH3基因，并獲得了積極的進展。由于成功開發(fā)了人工改造著絲粒組蛋白構建單倍體的技術，使得反向育種技術成為現(xiàn)階段最熱門的育種研究，高效的雜種優(yōu)勢固定或者雜種優(yōu)勢重建在不久的將來就能實現(xiàn)。

5 在反向育種中利用作物維管束長距離運輸

源流庫理論長期以來在作物育種中指導了優(yōu)勢株型的選育，但是并未在育種技術的發(fā)展中產(chǎn)生影響。近年來，一些前瞻性的研究改變了對源流庫理論的認知，期冀利用源流庫理論開發(fā)反向育種技術并獲得了一些初步結果。在前述的反向育種技術中，需要對作物進行復雜的基因改造以達到阻止染色體重組和單倍體生成兩個目的。制備具有這些特性的轉基因材料需要花費一定的時間，同時在不同作物甚至品種中進行多個轉基因改造，在反向育種中需要復雜嚴格的設計步驟。值得關注的是，這些改造的基因，都是在花器官中發(fā)揮功能從而應用于育種技術的?；ㄆ鞴僭谠戳鲙炖碚撝惺堑湫偷膸斓牟糠郑迷春土?，將基因改造的組分（特別是基因沉默信號）充分的輸送到花器官，在理論上是一種可靠的捷徑。在植物基因沉默研究中已經(jīng)有類似的技術被廣泛應用，例如，植物病毒介導的基因沉默技術就可以通過病毒的擴散將基因沉默在植物體內(nèi)進行擴散。其實，植物病毒介導的基因沉默在某種程度上也可以通過源流庫中的流進行擴散的。在病毒擴散的過程中，其攜帶的基因沉默信息通過篩管在植物體內(nèi)進行長距離運輸。研究發(fā)現(xiàn)，將siRNA限制在擬南芥葉片篩管的伴胞細胞表達，卻能在臨近的葉肉細胞或者表皮細胞中達到沉默的效果，這個結果證實了siRNA在植物體細胞間運輸。由于植物病毒介導的基因沉默對病毒的感染力存在依賴，再加上對siRNA能否在花器官進行擴散存在疑慮，所以將其在花器官發(fā)揮基因改造的功能并沒有得到推廣，更沒有成功結合到反向育種技術的開發(fā)中。最新的研究利用嫁接或者在葉片中瞬時表達的技術，證明了在葉片或者砧木中表達的21-24堿基的siRNA能夠長距離的運輸［30］。針對DMC1和GFP設計的siRNA可以被成功轉運到減數(shù)分裂活躍的組織。將野生煙草作為接木與具有DMC1 siRNA的轉基因煙草進行嫁接，砧木中表達的DMC1 siRNA能夠大量轉運到“庫”器官，其中特別是花器官，并有效地降低花器官中DMC1的基因表達，干擾減數(shù)分裂過程，進而阻止染色體重組的發(fā)生。另外，在煙草葉片中通過農(nóng)桿菌注射瞬時表達siRNA，也能成功地轉運到花器官發(fā)揮基因沉默的功能。在擬南芥胚軸嫁接實驗中，接木的花器官中DMC1基因也能被砧木中表達的siRNA沉默表達，但是其效率有待提高。除了對控制染色體重組的基因DMC1進行干擾，控制染色體分離的OSD1基因也可能通過同樣的方式實現(xiàn)沉默。這些實驗都充分說明了利用源流庫中的流能夠高效的將siRNA信號從源轉運到庫中發(fā)揮基因沉默的功能。特別是對DMC1這樣和染色體重組相關的重要基因設計siRNA，能夠用“流”對siRNA轉運到花器官對染色體進行操作，該技術在反向育種后續(xù)的染色體消除的步驟中能否發(fā)揮作用還有待驗證，但是能夠阻止染色體重組已經(jīng)使得該技術在不久的將來極有可能成為反向育種中重要的技術手段［31］。

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New Crop Breeding Technique from Source-path-sink Theory

Han Xiao
（Biotechnology Research Institute，CAAS，Beijing 100081）

Crop production is a process of photosynthates transportation from source to sink. The movement of photosynthates in plant vascular bundle could drive the movement of plant signaling molecules, such as hormone, transcription factor, peptides and RNAi. In reverse-breeding programs, two key steps including inhibition of chromosome recombination and selective elimination of chromosome could be manipulates by these signal. Recent advances in identifying these long-distance signals targeting flower tissues can be applied to reversebreeding technique.

source-path-sink； vascular bundle； phloem； reverse breeding； long distance movement

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.019

2015-04-10

韓霄，男，博士，研究員，研究方向：植物分子細胞生物學；E-mail：hanxiao@caas.cn