吳雨虹，王慧君，王欣

（1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，廣東廣州510515；2.廣州市公安局刑警支隊(duì)技術(shù)所法醫(yī)檢驗(yàn)科，廣東廣州510030）

腦損傷后神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞常出現(xiàn)反應(yīng)性膠質(zhì)增生，這是中樞神經(jīng)損傷及退行性病變引起的神經(jīng)組織發(fā)生改變的常見現(xiàn)象。S100B蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillory acidic protein，GFAP）均為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，故研究二者在損傷后不同時(shí)段的表達(dá)變化，有助于了解損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)情況及推斷損傷時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械性打擊致腦干損傷動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)，檢測大鼠腦干損傷后不同時(shí)段腦干組織中S100B、GFAP的表達(dá)情況，探討其在原發(fā)性腦干損傷中可能的作用機(jī)理及損傷時(shí)間的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

自制打擊裝置，Nikon-ECL IPSE 801光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），即用型通用SP免疫組織化學(xué)試劑盒、兔抗GFAP多克隆抗體、DAB試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），大鼠抗S100B多克隆抗體（美國SANTA公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組

SD雄性大鼠48只（購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量180~220g。采用隨機(jī)分組法，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取6只作為對照組，余42只進(jìn)行建模。自制撞擊裝置，將內(nèi)徑為1.2 cm的光滑導(dǎo)引管固定在鐵支架上，將一木板固定在鐵支架的底座上，前端設(shè)置一垂直的小擋板，導(dǎo)引管與底座的夾角呈45°。采用100g/L水合氯醛按300mg/kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠后，切開頭皮，暴露顱骨，使大鼠俯臥于底座上，調(diào)整引導(dǎo)管對準(zhǔn)枕骨粗隆，打擊物從導(dǎo)引管的一端自由下滑打擊大鼠枕部，每只大鼠只打擊1次，造成腦干損傷。

腦干損傷模型大鼠在建模后30min內(nèi)死亡6只，記為傷后30min組，傷后存活者隨機(jī)分為6組，每組6只，分別于傷后2、6、12、24、48、72h斷頭處死；對照組大鼠直接斷頭處死。

1.3 取材及染色

大鼠斷頭處死后，立即取腦干組織，放置于4%多聚甲醛固定24h。將腦干沿正中線切開，以切面為包埋面常規(guī)脫水，石蠟包埋制成蠟塊，組織經(jīng)連續(xù)切片，厚度為3μm，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色及Gless嗜銀染色，并行SP法免疫組織化學(xué)染色。

1.4 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用HMIAS-2000W高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析管理系統(tǒng)（武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司），在400倍顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，對免疫組化陽性細(xì)胞進(jìn)行檢測，測定陽性細(xì)胞的平均灰度值。數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較用LSD法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床觀察

實(shí)驗(yàn)大鼠受打擊后，均立即出現(xiàn)昏迷、角膜反射消失、抽搐、呼吸急促、心搏加快等體征。傷后30min組的大鼠約在損傷后30s出現(xiàn)不規(guī)則的呼吸和心搏，數(shù)分鐘后出現(xiàn)心律不齊且搏動(dòng)減弱，呼吸變慢變深，20~30 min心搏停止。傷后存活的大鼠10~15 min后呼吸和心搏基本恢復(fù)正常，約1 h后逐步蘇醒，生命體征平穩(wěn)，未出現(xiàn)再次昏迷。

2.2 肉眼及HE染色觀察

所有腦干損傷大鼠均可見蛛網(wǎng)膜下腔明顯出血，腦干組織水腫，腦干內(nèi)見散在的點(diǎn)片狀或橢圓形小片狀出血，傷后30min組出血部位較為廣泛，傷后存活者，出血部位相對較少。

2.3 Gless嗜銀染色觀察

對照組大鼠腦干組織軸索排列規(guī)整，走行一致，軸索間隙均一。傷后30min組大鼠彌漫性軸索腫脹、斷裂、扭曲呈蚯蚓狀，軸索末端膨大、間隙增寬。傷后2、6 h在腦干見到上述軸索損傷變化更加明顯，以軸索斷裂、腫脹及扭曲為主。傷后12 h可觀察到軸索斷裂后軸漿流出到腦組織局部所形成的軸索收縮球（圖1），傷后24h軸索收縮球數(shù)量增多，體積增大，傷后48、72h軸索腫脹情況有所好轉(zhuǎn)。

圖1 腦干損傷后12h軸索收縮球形成Gless×400

2.4 SP免疫組織化學(xué)染色觀察

2.4.1 S100B的表達(dá)

對照組可見S100B陽性細(xì)胞染色均勻分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體及突起中（圖2A）。傷后30min，星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，突起消失，S100B從星形膠質(zhì)細(xì)胞中釋放，表達(dá)增加（圖2B，表1，P＜0.01）。之后隨著時(shí)間的延長腦干組織中S100B陽性表達(dá)逐步升高，并于24h達(dá)到高峰（圖2C，表1，P＜0.01）。傷后48h，S100B陽性表達(dá)有所下降，但仍高于對照組（P＜0.01），此時(shí)可見少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)單一細(xì)長突起。72h基本降至正常水平，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大并可見胞核（圖2D，表1，P＜0.01）。

2.4.2 GFAP的表達(dá)

對照組GFAP分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)及突起中，胞體較小，突起纖細(xì)。傷后30min，GFAP表達(dá)增加（P＜0.01，表1），有的細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則（圖3A）；傷后2h，GFAP表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)（P＜0.01，表1），突起染色加深（圖3B），之后隨時(shí)間的延長逐步上升，48h達(dá)到高峰（P＜0.01，表1），胞質(zhì)染色加深，突起增多，形態(tài)不規(guī)則（圖3C）；72 h表達(dá)下降但仍高于對照組（圖3D，表1，P＜0.01）。

圖2 腦干組織中S100B陽性表達(dá)SP×400

圖3 腦干組織中GFAP陽性表達(dá)SP×400

表1 大鼠腦干損傷后S100B、GFAP陽性細(xì)胞平均灰度值（n=6，±s）

表1 大鼠腦干損傷后S100B、GFAP陽性細(xì)胞平均灰度值（n=6，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.01；2）與相鄰上組比較，P＜0.01

組別對照傷后30min傷后2h傷后6h傷后12h傷后24h傷后48h傷后72h S100B 80.774±0.893 86.158±0.7931）2）89.858±0.9371）2）92.198±0.2691）2）94.006±0.6631）2）98.518±0.7761）2）87.954±1.1871）2）81.114±1.0092）GFAP 31.508±0.465 35.938±0.4011）2）37.838±0.5441）2）39.926±0.6841）2）42.530±0.6531）2）44.826±0.4641）2）47.888±0.5471）2）45.922±0.2681）2）

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、最重要的支持細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種正常生理活動(dòng)以及神經(jīng)組織的修復(fù)與再生、神經(jīng)免疫、多種神經(jīng)疾病的病理機(jī)制中都起著十分重要的作用。S100B是一類分子量較小的EF手型鈣離子結(jié)合蛋白，具有廣泛的生物學(xué)活性，主要由中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的雪旺細(xì)胞分泌，是星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志之一，可使神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加[1]，而Kligman等[2]報(bào)道了在腦皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)中，腦S100B蛋白的二硫化物能刺激神經(jīng)生長，推測S100B蛋白可能通過神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌后通過類似旁分泌的作用[3]，刺激神經(jīng)生長。在損傷反應(yīng)中S100B表達(dá)明顯增加，且與損傷程度和時(shí)間有一定關(guān)系[4-6]。GFAP是一種中間絲細(xì)胞骨架蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性地由星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，被認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞及由其發(fā)生的腫瘤的特異性標(biāo)志物[7]。星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的標(biāo)志是細(xì)胞數(shù)增加、細(xì)胞體肥大、分支增多，GFAP表達(dá)增強(qiáng)。因此星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖程度和腦干損傷后腦組織的病變程度可用GFAP的表達(dá)值來評價(jià)。

本研究采用機(jī)械性撞擊法[8]，在保證同等打擊力度和作用時(shí)間的前提下，使外來機(jī)械力直接作用于顱骨，并能準(zhǔn)確打擊大鼠的枕骨粗隆，使腦干受到損傷。HE染色可見腦干組織內(nèi)有點(diǎn)片狀或橢圓形小片狀出血，并有蛛網(wǎng)膜下腔出血；Gless嗜銀染色發(fā)現(xiàn)大鼠彌漫性分布的軸索腫脹、斷裂、扭曲、末端膨大，軸索間隙增寬并收縮球的形成，表明所建立的原發(fā)性腦干損傷動(dòng)物模型科學(xué)、可信。

本研究發(fā)現(xiàn)，在腦干損傷后30 min內(nèi)，S100B與GFAP表達(dá)即開始增加，此時(shí)的增加可推斷為星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性肥大而非增生，同時(shí)由于星形膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的受損，S100B與GFAP從細(xì)胞中漏出導(dǎo)致二者水平的上升。而反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和活化產(chǎn)生大量的S100B本身也促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的肥大和增殖，又提高了GFAP的水平，從而形成正反饋放大效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)證明隨著傷后時(shí)間的延續(xù)，S100B與GFAP水平不斷升高，24 h和48 h分別為S100B與GFAP水平的最高峰，之后的表達(dá)有所下降，到72 h二者水平下降，且S100B與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赏茰y隨著時(shí)間的進(jìn)展，損傷反應(yīng)不斷增強(qiáng)，24~48h是膠質(zhì)細(xì)胞損傷反應(yīng)的頂峰，之后損傷反應(yīng)減弱、膠質(zhì)細(xì)胞自我修復(fù)、再生不斷增強(qiáng)，S100B與GFAP表達(dá)量減少，直至修復(fù)完成。

有研究[9]證實(shí)，腦外傷后大量星形膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕的形成是新生的星形膠質(zhì)細(xì)胞而非已經(jīng)存在活化的細(xì)胞或遷移細(xì)胞所形成。本研究發(fā)現(xiàn)腦損傷后S100B、GFAP陽性表達(dá)的變化特征，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞在不斷被激活新生，這不僅有利于膠質(zhì)瘢痕的形成，也有利于神經(jīng)元的修復(fù)和功能的恢復(fù)。同時(shí)，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在腦干損傷后S100B與GFAP的表達(dá)隨時(shí)間呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律，如果將兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合，綜合分析，可以為損傷時(shí)間的推斷提供一定的幫助。

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