劉捷孟戚繼

（1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳與發(fā)育協(xié)同創(chuàng)新中心 植物科學(xué)研究所，上海 200433；2. 復(fù)旦大學(xué) 理論生命科學(xué)研究中心物理系，上海200433）

元基因組學(xué)方法在環(huán)境微生物中的研究進(jìn)展

劉捷孟1，2戚繼1

（1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳與發(fā)育協(xié)同創(chuàng)新中心 植物科學(xué)研究所，上海 200433；2. 復(fù)旦大學(xué) 理論生命科學(xué)研究中心物理系，上海200433）

新一代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，使得元基因組學(xué)研究方法成為了理解環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和相互作用的重要手段之一。元基因組學(xué)方法不需要將環(huán)境樣本中的微生物單獨(dú)分離培養(yǎng)，而是作為整體進(jìn)行研究，因而可以回避傳統(tǒng)研究時(shí)分離培養(yǎng)微生物的困難?；谶@一優(yōu)勢(shì)，人體、海洋和土壤等環(huán)境有關(guān)的各項(xiàng)環(huán)境微生物測(cè)序計(jì)劃相繼啟動(dòng)，并取得了一系列重要的研究進(jìn)展。探討了元基因組測(cè)序數(shù)據(jù)分析中所經(jīng)常采用的方法，以及有關(guān)流程的優(yōu)勢(shì)和局限性，并進(jìn)一步討論了這些方法在各種環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用和成果。

元基因組；高通量測(cè)序；生物信息；環(huán)境微生物

微生物包括真細(xì)菌、古細(xì)菌、病毒和肉眼無法觀察到的微小真核生物，這些生物雖然個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡單，但是數(shù)量龐大并且廣泛分布于土壤、水體、空氣等各種環(huán)境中。例如，在土壤環(huán)境中，每克泥土中所包含的微生物細(xì)胞數(shù)量可以高達(dá)數(shù)億乃至數(shù)十億。另一方面，微生物中的原核生物大約誕生于40億年以前，遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于常以多細(xì)胞結(jié)構(gòu)為主的真核生物。漫長的演化歷史使得地球上的原核生物擁有豐富的生物多樣性，這些特點(diǎn)使得它們?cè)趲缀跛械纳鷳B(tài)體系中都扮演著重要的角色。

早期的微生物研究離不開微生物的分離、純化和培養(yǎng)。然而，自然環(huán)境中超過99%的微生物的存活無法脫離其自身所在的特殊環(huán)境，因而無法在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)等前期實(shí)驗(yàn)［1］，很大程度上限制了后續(xù)的生理生化與組學(xué)研究。針對(duì)這一現(xiàn)狀，Handelsman等［2］提出了使用元基因組方法從整體角度來研究那些無法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微生物。

元基因組方法是將某個(gè)特定生態(tài)環(huán)境所包含的所有微生物個(gè)體的基因組作為一個(gè)整體，一起提取出來進(jìn)行研究。其中，元基因組（Metagenome）又可以稱為宏基因組、環(huán)境基因組、群體基因組以及生態(tài)基因組等，指環(huán)境樣本包含的所有微生物的遺傳物質(zhì)；而研究元基因組的學(xué)科稱為元基因組學(xué)（Metagenomics）。隨著二代高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和普及，元基因組方法這種直接提取環(huán)境樣本所有遺傳物質(zhì)并進(jìn)行測(cè)序的技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。

元基因組學(xué)研究在很大程度上拓展了人類對(duì)微生物和它們生活環(huán)境的認(rèn)識(shí)，并且創(chuàng)造出許多重要的應(yīng)用價(jià)值［3-6］。例如在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對(duì)人體微生物基因組的研究和許多疾病機(jī)理聯(lián)系在一起。其中，Marshall BJ和Warren JR發(fā)現(xiàn)幽門螺旋桿菌和胃潰瘍有密切聯(lián)系，因此獲得了2005年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。由美國國立衛(wèi)生研究院啟動(dòng)的人類微生物組計(jì)劃（Human microbiome project，HMP）［7］從300多個(gè)項(xiàng)目中，取自人體15個(gè)不同部位的690個(gè)樣本中測(cè)定了約350億的短序列片段（Reads）。通過詳細(xì)分析這些測(cè)序數(shù)據(jù)，研究者得以認(rèn)識(shí)人體不同部位的微生物在群體結(jié)構(gòu)上存在巨大的差異，并且發(fā)現(xiàn)若干疾病和人體微生物群體組成存在關(guān)聯(lián)性，這些研究將有助于建立新的診斷和治療方法。在深海熱泉環(huán)境的微生物群落中，研究者找到了一類特殊的耐熱聚合酶，可能在有關(guān)的工業(yè)生產(chǎn)中存在重要的應(yīng)用價(jià)值［8］。

在這篇綜述中，我們首先介紹目前對(duì)元基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析的生物信息方法和流程，并回顧在一些重要的元基因組計(jì)劃推動(dòng)下，依據(jù)元基因組學(xué)方法在人體環(huán)境、海洋和土壤等自然環(huán)境有關(guān)的元基因組學(xué)研究中所取得的重要成果。

1 元基因組有關(guān)的生物信息學(xué)分析方法

環(huán)境微生物樣本中所包含的微生物種類繁多且彼此之間的豐度差異很大，為獲得較為完整的物種譜系的覆蓋率，通常需要對(duì)環(huán)境微生物基因組進(jìn)行深度測(cè)序，海量數(shù)據(jù)的分析對(duì)生物信息學(xué)算法的準(zhǔn)確性和計(jì)算效率同時(shí)提出了較高的要求。例如，HMP測(cè)定發(fā)布的腸道基因組原始序列中，一個(gè)樣本的數(shù)據(jù)量通?？梢赃_(dá)到數(shù)十G，超過了人類基因組的大小。所以對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析需要使用合適的生物信息方法在大型計(jì)算機(jī)上完成。通過二代測(cè)序平臺(tái)得到的原始序列中存在測(cè)序錯(cuò)誤，從而影響到后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理以過濾一部分低質(zhì)量（高錯(cuò)誤率）的序列，通常使用的方法包括FastQC［9］、PRINSEQ［10］等。

二代測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的reads長度比較短，所以通常會(huì)使用一些序列拼接軟件將經(jīng)過預(yù)先處理后的reads拼接成更長的contigs。常見的用于基因組高通量測(cè)序拼接的軟件有Velvet［11］、SOAPdenovo［12］等，但是將這些軟件應(yīng)用到元基因組數(shù)據(jù)組裝時(shí)遇到困難。這些方法都是針對(duì)單一物種的基因組序列拼接的，而元基因組數(shù)據(jù)中包含不同種類的微生物，在物種豐度和親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近方面存在較大區(qū)別。近緣微生物的基因組之間存在序列高度相似的區(qū)域，因此有一定概率被拼接成一個(gè)整體，從而會(huì)產(chǎn)生不同微生物基因組的序列嵌合或者拼接結(jié)果的碎片化等問題。為解決這些困難，研究人員在元基因組拼接方法的研究上做出了大量的努力，開發(fā)了如MetaVelvet［13］、MetaIDBA［14］和IDBA-UD［15］等軟件。這些軟件提高了元基因組序列拼接的準(zhǔn)確性，有效延長了contigs的拼接長度，降低了不同微生物基因組序列嵌合的發(fā)生頻率。最后，在獲得了有效的基因組拼接結(jié)果后，可以進(jìn)一步使用FragGene-Scan［16］、GLIMMER［17，18］、GeneMark［19，20］等軟件從contigs中進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，在基因組中識(shí)別可能的編碼區(qū)域，從而進(jìn)行后續(xù)的基因注釋和功能分析等研究。

由于序列拼接需要的計(jì)算量很大，并且通常會(huì)損失一部分豐度較低的微生物基因組信息，因此也有一些能夠繞過拼接直接對(duì)reads進(jìn)行分類的方法被開發(fā)出來，這類方法稱為對(duì)reads的分箱（Binning）方法：將reads分成若干個(gè)類群，每個(gè)類群稱為操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）；按照是否依賴于相對(duì)參考數(shù)據(jù)庫的同源序列比對(duì)，可以進(jìn)一步分為有監(jiān)督分箱方法和無監(jiān)督分箱方法兩類。有監(jiān)督分箱方法使用BLAST、BLAT［21］等序列聯(lián)配算法將reads比對(duì)到參考蛋白質(zhì)或核苷酸序列上，再通過目標(biāo)序列的物種來源確定reads本身的分類學(xué)位置?；诖瞬呗缘乃惴ò∕G-RAST［22］、MEGAN［23］等，它們從比對(duì)結(jié)果中選擇出匹配較好的參考序列，然后將reads定位到這些目標(biāo)序列所在物種的最小共同祖先上。除此以外，Carma［24］和Amphora［25］選擇使用隱馬可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）方法將reads分到相應(yīng)的基因家族中。除了基于序列比對(duì)的方法外，另一類方法使用序列核苷酸/蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分箱：如Phymm［26］使用寡核苷酸偏好性比較reads和參考序列相似性，然后使用貝葉斯方法推斷reads的分類位置；Phylopythia［27］使用支持向量機(jī)（support machine vector）框架對(duì)reads進(jìn)行分箱；MetaCV［28］使用蛋白質(zhì)組分矢量方法進(jìn)行分箱，對(duì)100-200 bp長度的reads的物種定位效果最佳，可以達(dá)到與BLAST等基于序列比對(duì)方法相近的準(zhǔn)確度，因此在元基因組的高通量測(cè)序分析中具備實(shí)用性。無監(jiān)督方法沒有參考數(shù)據(jù)庫，而是使用reads序列自身的特性（如核苷酸偏好、物種豐度等）對(duì)reads進(jìn)行分類，常用方法有TETRA［29］、CompostBin［30］、MetaCluster［31］等。由于已發(fā)表全基因組的原核生物大多與人類健康有關(guān)，在研究海洋、土壤環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，數(shù)據(jù)庫中常常缺乏合適的參照，因此無監(jiān)督方法在這種情況下具有一定的優(yōu)勢(shì)。

元基因組的進(jìn)一步分析和研究可以結(jié)合樣本所在環(huán)境的地理位置、氣候條件、理化性質(zhì)等因素，通過比較相同或不同條件下的元基因組數(shù)據(jù)獲得物種結(jié)構(gòu)、功能基因的共性和差異。例如，Arumugam等［32］分析比較了來自4個(gè)國家的22個(gè)人類腸道微生物基因組，發(fā)現(xiàn)這些樣本按照微生物物種譜系可以分為3個(gè)穩(wěn)定的腸道類型（Enterotype）。在MetaHit［33］計(jì)劃中，Qin等［34］將全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）分析方法進(jìn)一步擴(kuò)展到元基因組數(shù)據(jù)分析中，發(fā)展出元基因組關(guān)聯(lián)研究（Metagenome wide association studies，MGWAS）方法，用于比較健康人群與二型糖尿病人的腸道菌群，對(duì)二型糖尿病與腸道菌群的關(guān)系進(jìn)行深入的分析。

2 元基因組測(cè)序計(jì)劃及主要研究進(jìn)展

2.1 元基因組學(xué)方法在人體微生物群落與健康研究中的應(yīng)用

越來越多的研究表明一些人類疾病不僅與人體自身基因組的調(diào)控轉(zhuǎn)錄有關(guān)，也受到生活在人體的大量菌群的影響。由這些菌群構(gòu)成的元基因組又被稱為“人體第二基因組”，編碼基因數(shù)量可以達(dá)到100萬以上，它們與人體基因組相互協(xié)調(diào)，維持人類的生理代謝平衡。因此在各種環(huán)境微生物的研究中，對(duì)人體相關(guān)的微生物的研究最為細(xì)致深入。

許多研究集中在微生物群體變化與某種特定疾病的聯(lián)系。例如，幽門螺旋桿菌感染會(huì)引起胃炎、胃潰瘍甚至胃癌，對(duì)于其相關(guān)病理學(xué)的研究改變了人們對(duì)胃病起因的認(rèn)識(shí)，從而在根源上能夠?qū)ξ覆∵M(jìn)行有效地治療［35，36］。在腸道菌群的研究中，有專家發(fā)現(xiàn)克羅恩氏疾?。–rohn’s disease，一種腸潰瘍）患者腸道菌群的物種多樣性相比于健康人群有著顯著的下降［37］；肥胖人群的腸道內(nèi)硬壁菌門相對(duì)豐度比較高，擬桿菌門相對(duì)豐度較低［38-41］；還有關(guān)于二型糖尿病的一項(xiàng)研究報(bào)道患者腸道內(nèi)梭形菌綱明顯減少［42］。肝臟是人體負(fù)責(zé)代謝功能的重要器官，由腸道菌群產(chǎn)生的許多代謝產(chǎn)物最早來到肝臟，所以腸道菌群與肝臟疾病也有一定的關(guān)聯(lián)。肝硬化病人的腸道微生物的種類與豐度有明顯的改變，包括變形菌門和梭桿菌門［43］。同樣，人類皮膚組織中的微生物也與一些皮膚疾病有聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)牛皮癬病人被感染出的皮膚組織上的微生物同未感染皮膚相比擁有更多的硬壁菌門，而放線菌門要少很多［44］。

美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）在2007年推動(dòng)的人類微生物組計(jì)劃（Human Microbiome Project，HMP）是人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）的延續(xù)，由美國主導(dǎo)，中國、日本和數(shù)個(gè)歐盟國家共同參加，并且由國際人類微生物組聯(lián)盟（International Human Microbiome Consortium，IHMC）協(xié)調(diào)管理。在該計(jì)劃為期5年的第一個(gè)階段中，耗資1.15億美金，總共測(cè)定了4 788個(gè)樣本的16S rRNA和681個(gè)樣本的全基因組。幾乎在同時(shí)，歐洲委員會(huì)（EC）也啟動(dòng)了人類腸道元基因組計(jì)劃（Metagenomics of the Human Intestinal Tract，MetaHit），該計(jì)劃耗資2 770萬美元，測(cè)定了124個(gè)歐洲人腸道菌群的元基因組序列。這些元基因組數(shù)據(jù)為人類微生物后續(xù)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

2.1.1 人體不同部位的微生物多樣性 對(duì)不同人群不同部位的微生物多樣性的分析研究表明，人類微生物群落的組成在人體不同部位的差異明顯大于不同個(gè)體在同一部位上的差異，因此人體部位被認(rèn)為是造成人類微生物群落結(jié)構(gòu)的首要因素［45，46］。對(duì)于固定的身體部位，微生物群落通常呈現(xiàn)出短時(shí)期內(nèi)的穩(wěn)定性，其物種相對(duì)豐度變化較不同位置的差異小很多［46］，這可能是微生物與其生活的人體環(huán)境通過相互作用達(dá)到了生態(tài)平衡，有學(xué)者認(rèn)為這種平衡有可能與納什均衡相對(duì)應(yīng)［47］。此外，考慮到人類個(gè)體、環(huán)境以及健康狀態(tài)的不同，同一部位的菌群結(jié)構(gòu)在不同個(gè)體之間也可能存在較大的差異，這就為研究菌群結(jié)構(gòu)的差異與健康狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)提供了可能。例如，一些學(xué)者使用人體的腸道基因組［32］或是女性陰道微生物基因組［48］作為研究對(duì)象，綜合生理生化和組學(xué)數(shù)據(jù)將研究個(gè)體劃分為不同類群。

當(dāng)生活在人體某個(gè)部位的微生物形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)以后，面對(duì)外部環(huán)境變化的影響擾動(dòng)時(shí)，具有一定的自我恢復(fù)能力。在一些關(guān)于食用益生素（Probiotic）能否改變?nèi)梭w微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中，人們發(fā)現(xiàn)僅服用較短時(shí)間（如7-12周）的益生素并不能對(duì)使用者口腔［49］、腸道［50］等部位的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的變化。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)棲息于這些部位的菌群在轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜上顯示出明顯的差異，表明菌群可能通過調(diào)控自身基因的表達(dá)來改變整個(gè)微生物代謝網(wǎng)絡(luò)以適應(yīng)環(huán)境的改變，從而維持菌群之間的生態(tài)平衡，保持菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。與此同時(shí)，許多菌群還會(huì)分泌出各種細(xì)菌素，能夠有效地阻止外來菌群的侵入，同時(shí)加強(qiáng)已有菌群的能力［51］。這類物質(zhì)是人體菌群自我恢復(fù)的重要機(jī)制，也幫助人體抵御許多外來有害細(xì)菌的入侵。然而也有一些研究表明微生物群落結(jié)構(gòu)的這種恢復(fù)能力有限，在面對(duì)較大的環(huán)境擾動(dòng)時(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)平衡有可能被打破。例如，一個(gè)人在飲食習(xí)慣上的長期改變會(huì)引起腸道菌群發(fā)生較大的變化［52］。當(dāng)一個(gè)人服用抗生素的情況下，其腸道內(nèi)一些菌種可能被消滅進(jìn)而相應(yīng)的菌群結(jié)構(gòu)平衡在短時(shí)間內(nèi)遭到破壞，最后轉(zhuǎn)變成為另外一種穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)［53］。所以，盡管微生物群落有一定的恢復(fù)力，在持續(xù)的破壞下有可能損失部分對(duì)人體健康有重要價(jià)值的組分［54］。這些研究也同時(shí)表明經(jīng)常服用抗生素有可能破壞體內(nèi)腸道微生物的生態(tài)平衡，對(duì)人體健康造成不良影響。

在更高的分類學(xué)層次上比較人類和其它哺乳動(dòng)物的微生物群落結(jié)構(gòu)，研究人員發(fā)現(xiàn)這些微生物在門等較高的分類層次上的種類與豐度是保守的，而分類層次越低則物種差異越大［55］。例如，在屬的層次上，小鼠腸道菌群中有85%序列的代表物種不存在于人類腸道微生物中［38］。

2.1.2 影響人體微生物群落結(jié)構(gòu)的先天和后天因素 基于系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的研究結(jié)果表明，依據(jù)各類哺乳動(dòng)物腸道微生物結(jié)構(gòu)推斷得到的演化關(guān)系同這些哺乳動(dòng)物自身的親緣關(guān)系呈現(xiàn)出一致的關(guān)系，顯示微生物群落具有一定的物種繼承性［56］。事實(shí)上，作為哺乳動(dòng)物，人類母親對(duì)其嬰兒身上的微生物群落組成有著非常重要的影響，具體體現(xiàn)在嬰兒在母體子宮內(nèi)孕育和從陰道出生時(shí)對(duì)這些部位菌群的殘留，哺育嬰兒時(shí)母乳所含益生素等成分對(duì)嬰兒腸道菌群的促進(jìn)作用以及在成長過程中母親對(duì)孩子飲食習(xí)慣方面的影響等［57，58］。例如，有研究者對(duì)剛出生的嬰兒身上的微生物進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其群落結(jié)構(gòu)與母親陰道內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)非常相似［59］。由于人類缺乏能夠降解寡糖復(fù)合物的糖解酶，母乳中蘊(yùn)含的寡糖促使一些擁有糖解酶的菌群在嬰兒腸道中生長起來，形成相應(yīng)的共生菌群（如雙歧桿菌等）［60］。此外，也有研究報(bào)道乳酸菌（Lactobacilli）出現(xiàn)在人類早期的腸道菌群中［61］，可能是在母乳哺育過程中進(jìn)入到嬰兒腸道內(nèi)，這些初始菌群隨著人類嬰兒的成長一起協(xié)同進(jìn)化，形成穩(wěn)定的腸道菌群，在人類的各種生理代謝［61］、免疫能力［62］等方面扮演者重要的角色。相比之下，通過剖腹產(chǎn)生下的嬰兒有著明顯不同的微生物菌群成分［59］，表明現(xiàn)代人選擇不同的生產(chǎn)方式可能會(huì)影響到嬰兒對(duì)微生物的繼承。

盡管人體的微生物具有繼承性，但是在人類漫長的一生中微生物大約可以繁殖10萬到100萬代，微生物在繁殖過程中不斷演化改變形成群落結(jié)構(gòu)，期間受到各種因素的影響。例如，一個(gè)人的飲食習(xí)慣對(duì)他腸道菌群結(jié)構(gòu)形成有著重要的作用，在2-4歲時(shí)的飲食習(xí)慣是決定一個(gè)人腸道菌群穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的重要因素［63］，而且在以后飲食習(xí)慣上的改變諸如開始長期頻繁食用高熱量食物也會(huì)造成腸道菌群的明顯改變［64］；位于女性陰道的微生物在生產(chǎn)期和絕經(jīng)期有著明顯的不同［65，66］；對(duì)抗生素的使用也會(huì)顯著影響腸道等部位的菌群［54］。

2.1.3 人體微生物功能基因類群變化 盡管在較低的分類學(xué)層次上不同個(gè)體之間微生物群落的結(jié)構(gòu)存在很大的差異，但是這些元基因組在KEGG、COG等功能基因類群的相對(duì)豐度上呈現(xiàn)出很強(qiáng)的保守性［28，45，67］。在一項(xiàng)健康人群微生物樣本分析中，研究者發(fā)現(xiàn)來自不同人體不同部位的微生物樣本具有一些穩(wěn)定的核心代謝途徑（Core pathway），其中豐度最高的一些分別屬于核苷酸、蛋白質(zhì)合成、基礎(chǔ)代謝等有關(guān)的核心功能基因［51］。核心功能基因類群在健康人群所表現(xiàn)出的這種穩(wěn)定性顯示它們?cè)跀?shù)量和結(jié)構(gòu)上的變化很有可能與一些疾病相關(guān)。這種相關(guān)性已經(jīng)被一些人類疾病相關(guān)的研究所報(bào)道［68，69］。

除了這些核心功能基因以外，有更多的基因?qū)儆诠δ苌形纯芍念惾?，這些認(rèn)知的缺乏限制了我們進(jìn)一步了解微生物與宿主之間的相互作用方式。目前有研究通過生物芯片功能基因探測(cè)的方法分析元基因組中所包含的特定功能（如酶活性、抗生素抗性檢驗(yàn)等）［70］，但這些研究目前為止還比較局限。

2.2 海洋微生物的探測(cè)與研究

相比于人體相關(guān)微生物研究的深入性和廣泛性，對(duì)海洋微生物的研究主要集中在不同海洋環(huán)境下的微生物的物種多樣性和功能基因探測(cè)方面。由美國伍茲霍爾海洋生物實(shí)驗(yàn)室（Marine Biological Laboratory，MBL）在2003年12月提出的國際海洋微生物普查計(jì)劃（International Census of Marine Microbes，ICoMM）使用標(biāo)準(zhǔn)化的流程完成對(duì)淺海和深海環(huán)境微生物群落樣本的采集、測(cè)定以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析與整合，目標(biāo)在于建立高精度的海洋微生物多樣性數(shù)據(jù)庫并理解海洋微生物群落如何在全球范圍進(jìn)行演化和分布［71］。全球海洋抽樣考察（Global oceans sampling expedition，GOS）是由生物學(xué)家和企業(yè)家Craig于2003年發(fā)起的一項(xiàng)測(cè)序計(jì)劃。該項(xiàng)目從馬尾藻海（Sargasso Sea）開始，對(duì)北美沿海地區(qū)進(jìn)行考察取樣，研究結(jié)果將有助于了解這些地區(qū)海洋環(huán)境微生物的群落組成。

由于陽光只能透過海洋的表層，位于表面陽光充足的地方微生物可以進(jìn)行高效的光合作用，而在海洋深層則需要依靠其它方式提供生物所需的能量，所以海洋不同深度的微生物群落結(jié)構(gòu)具有很大的差異。Venter等［72］對(duì)馬尾藻海表層海面進(jìn)行物種勘探，從海水中提取微生物樣本并通過16S rRNA分析發(fā)現(xiàn)了1 800多個(gè)物種，它們大部分屬于α和γ變形菌門。對(duì)愛奧尼亞海深水區(qū)域的樣本分析則顯示位于這里的微生物主要來自變形菌門、浮霉菌門、酸桿菌門和綠彎菌門等細(xì)菌以及奇古菌門等古菌［73］。在最近一個(gè)關(guān)于西南大西洋微生物群落研究中，研究者報(bào)告說通過元基因組測(cè)序方法對(duì)不同深度海洋的物種和元基因組功能類群進(jìn)行了細(xì)致研究［74］。他們發(fā)現(xiàn)不同深度位置上細(xì)菌的豐度均超過了古菌；在細(xì)菌中，α變形菌門和藍(lán)藻菌門占據(jù)了海洋表面，而隨著深度的增加，這些門的豐度減少，轉(zhuǎn)而被γ變形菌門占據(jù)；在古菌中，廣古菌門占據(jù)了淺層海水，而奇古菌門占據(jù)了深層海水。相似的物種分布也被關(guān)于中國南海的微生物物種研究報(bào)道，研究者發(fā)現(xiàn)淺層海水的微生物主要屬于α變形菌門，伴隨著不同季節(jié)也會(huì)有β變形菌門，而在深層海水相對(duì)豐度最高的是γ變形菌門［75］。這些不同海洋發(fā)現(xiàn)的相似分布反映了海水深度是影響海洋微生物分布的重要因素，并且海洋微生物隨著海水深度分布變化在不同海域具有一定的普遍性。

由于在海洋中各處環(huán)境的差異極大，如海底黑暗而高壓的環(huán)境、南北兩極冰點(diǎn)以下的低溫水體、深海熱泉超過100℃的高溫環(huán)境還有各種海洋微生物體內(nèi)環(huán)境等，這些環(huán)境中棲息著許多人類過去未嘗了解的未知物種，可以提供關(guān)于物種起源和演化的重要信息。例如，最近在海底熱泉找到的一種“洛基古菌”（Lokiarchaeota）同時(shí)具備一些古菌和真核生物的特征，很可能是古菌演化為早期真核生物的過渡生物的一個(gè)分支，為真核生物的起源提供了極為重要的線索［76］。與此同時(shí)為了適應(yīng)上述各種海洋環(huán)境，微生物還演化出了許多特有的功能基因，有很重要的應(yīng)用價(jià)值。通過元基因組方法對(duì)不同微生物樣本進(jìn)行功能篩選，尋找并研究相應(yīng)的功能基因，可以為研究人員帶來有用的線索。烏賊發(fā)光器官內(nèi)存在一種費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）構(gòu)成了微生物的發(fā)光系統(tǒng)。在這種弧菌細(xì)胞內(nèi)，研究者找到用于發(fā)出熒光的熒光素酶，并將這種熒光素酶作為一種報(bào)道分子系統(tǒng)而廣泛應(yīng)用到生物細(xì)胞內(nèi)的探測(cè)過程中［77］。生活于深海熱泉的古細(xì)菌含有一種耐高溫和強(qiáng)酸的α淀粉酶，這種酶現(xiàn)在被用于從玉米提取乙醇的過程中［78］。

2.3 其它環(huán)境的微生物研究

除了人體微生物和海洋微生物以外，生活在各類土壤環(huán)境中的微生物也是元基因組學(xué)重要的研究對(duì)象。由于土壤環(huán)境特征的復(fù)雜性更高，如pH值、含水量、土壤結(jié)構(gòu)等理化因素的差異，導(dǎo)致從不同土壤中提取和純化微生物DNA的方法差異較大且缺乏普遍性［79］。一些研究表明土壤微生物群落可以作為理解抗性基因的起源、分化、豐度等性質(zhì)的源泉［80-82］。土壤微生物蘊(yùn)含了大量的新基因，其中有許多特定功能，如抗生素、催化劑相關(guān)的基因?qū)θ祟惤】怠⑸鐣?huì)生產(chǎn)有著很大的價(jià)值，如Courtois［83］找到的聚酮合成酶、Uchiyama［84］找到的瓊脂水解酶和一些生物催化劑編碼基因等。

元基因組方法還有助于環(huán)境整治、生物燃料等方面的研究，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，通過研究農(nóng)作物、牲畜與它們共生的微生物可以幫助預(yù)防治療病害、提高產(chǎn)量。

3 結(jié)語

元基因組學(xué)方法的進(jìn)步為人們研究難于培養(yǎng)的微生物打開了方便之門，使得從整體角度理解各類環(huán)境條件下微生物群落的復(fù)雜性成為可能。伴隨著元基因組方法的發(fā)展和普及，HMP、IcoMM等各類元基因組測(cè)序計(jì)劃開始啟動(dòng)，提供了大量關(guān)于環(huán)境微生物的數(shù)據(jù)。通過對(duì)這些數(shù)據(jù)的分析和整合，研究人員揭示了微生物和環(huán)境之間存在復(fù)雜的相互作用，并在人類疾病與健康、海洋與土壤微生物功能基因等方面獲得了重要的成果。同時(shí)，測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和生物信息學(xué)算法的發(fā)展也將在元基因組學(xué)更為細(xì)致和廣泛的研究中發(fā)揮重要的作用。

［1］ Amann RI， Ludwig W， Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］. Microbiological Reviews， 1995， 59（1）：143-169.

［2］ Handelsman J， Rondon MR， Brady SF， et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products［J］. Chem Biol， 1998， 5（10）：R245-R249.

［3］ Nelson KE， White BA. Metagenomics and Its Applications to the Study of the Human Microbiome［M］//Marco D. Metagenomics：Theory， Methods and Applications， Caister Academic Press， 2010.

［4］ Li LL， McCorkle SR， Monchy S， et al. Bioprospecting metagenomes：glycosyl hydrolases for converting biomass［J］. Biotechnology for Biofuels， 2009， 2：10.

［5］ George I. Application of Metagenomics to Bioremediation， in Metagenomics：Theory， Methods and Applications［M］. Caister Academic Press， 2010.

［6］ Raes J， Letunic I， Yamada T， et al. Toward molecular trait-based ecology through integration of biogeochemical， geographical and metagenomic data［J］. Molecular Systems Biology， 2011， 7：473.

［8］ Mathur EJ， Toledo G， Green BD， et al. A biodiversity-based approach to develo-pment of performance enzymes：Applied metagenomics and directed evolution［J］. Genetic Engineering News， 2006， 26（4）：16-19.

［9］ FastQC A quality control tool for high throughput sequence data，（Babraham Bioinformatics Web site）.

［10］ Schmieder R， Edwards R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets［J］. Bioinformatics， 2011， 27（6）：863-864.

［11］ Zerbino DR， Birney E. Velvet：Algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs［J］. Genome Research， 2008，18（5）：821-829.

［12］ Luo RB， Liu BH， Xie YL， et al. SOAPdenovo2：an empirically improved memory-efficient short-read de novo assembler［J］. Giga Science， 2012， 1：18.

［13］ Namiki T， Hachiya T， Tanaka H， et al. MetaVelvet：an extension of Velvet assembler to de novo metagenome assembly from short sequence reads［J］. Nucleic Acids Research， 2012， 40（20）：e155.

［14］ Peng Y， Leung HCM， Yiu SM， et al. Meta-IDBA：a de Novo assembler for metagenomic data［J］. Bioinformatics， 2011， 27（13）：i94-i101.

［15］ Peng Y， Leung HCM， Yiu SM， et al. IDBA-UD：a de novo assembler for single-cell and metagenomic sequencing data with highly uneven depth［J］. Bioinformatics， 2012， 28（11）：1420-1428.

［16］ Rho M， Tang H， Ye Y. FragGeneScan：predicting genes in short and error-prone reads［J］. Nucleic Acids Research， 2010， 38（20）：e191.

［17］ Delcher AL， Bratke KA， Powers EC， et al. Identifying bacterial genes and endosymbiont DNA with Glimmer［J］. Bioinformatics，2007， 23（6）：673-679.

［18］ Salzberg SL， Pertea M， Delcher AL， et al. Interpolated Markov models for eukaryotic gene finding［J］. Genomics， 1999， 59（1）：24-31.

［19］ Besemer J， Borodovsky M. GeneMark：web software for gene finding in prokaryotes， eukaryotes and viruses［J］. Nucleic Acids Research， 2005， 33（Web Server issue）：W451-W454.

［20］ Lukashin AV， Borodovsky M. GeneMark. hmm：New solutions for gene finding［J］. Nucleic Acids Research， 1998， 26（4）：1107-1115.

［21］ Kent WJ. BLAT—The BLAST-Like Alignment Tool［J］. Genome Research， 2002， 12（4）：656-664.

［22］ Meyer F， Paarmann D， D'Souza M， et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes［J］. BMC Bioinformatics，2008， 9（1）：386.

［23］ Huson DH， Auch AF， Qi J， et al. MEGAN analysis of metagenomic data［J］. Genome Research， 2007， 17（3）：377-386.

［24］ Krause L， Diaz NN， Goesmann A， et al. Phylogenetic classification of short environmental DNA fragments［J］. Nucleic Acids Research， 2008， 36（7）：2230-2239.

［25］ Wu M， Eisen J. A simple， fast， and accurate method of phylogenomic inference［J］. Genome Biology， 2008， 9（10）：R151.

［26］ Brady A， Salzberg SL. Phymm and PhymmBL：metagenomic phylogenetic classification with interpolated Markov models［J］. Nat Meth， 2009， 6（9）：673-676.

［27］ McHardy AC， Martin HG， Tsirigos A， et al. Accurate phylogenetic classification of variable-length DNA fragments［J］. Nat Meth，2007， 4（1）：63-72.

［28］ Liu JM， Wang HF， Yang HX， et al. Composition-based classification of short metagenomic sequences elucidates the landscapes of taxonomic and functional enrichment of microorganisms［J］. Nucleic Acids Research， 2013， 41（1）：e3.

［29］ Teeling H， Waldmann J， Lombardot T， et al. TETRA：a webservice and a stand-alone program for the analysis and comparison of tetranucleotide usage patterns in DNA sequences［J］. BMC Bioinformatics， 2004， 5：163.

［30］ Chatterji S， Yamazaki I， Bai ZJ， et al. CompostBin：A DNA Composition-Based Algorithm for Binning Environmental Shotgun Reads［M］//Vingron M， Wong L. Research in Computational Molecular Biology， Springer Berlin Heidelberg， 2008：17-28.

［31］ Wang Y， Leung HCM， Yiu SM， et al. MetaCluster 5. 0：a tworound binning approach for metagenomic data for low-abundance species in a noisy sample［J］. Bioinformatics， 2012， 28（18）：i356-i362.

［32］ Arumugam M， Raes J， Pelletier E， et al. Enterotypes of the human gut microbiome［J］. Nature， 2011， 473（7346）：174-180.

［33］ Qin JJ， Li RQ， Raes J， et al. A human gut microbial gene catalog established by metagenomic sequencing［J］. Nature， 2010， 464（7285）：59-65.

［34］ Qin J. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes［J］. Nature， 2012， 490（7418）：55-60.

［35］ Marshall BJ， Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration［J］. Lancet， 1984，1（8390）：1311-1315.

［36］ Borody TJ， Cole P， Noonan S， et al. Recurrence of duodenal ulcer and Campylobacter pylori infection after eradication［J］. The Medical journal of Australia， 1989， 151（8）：431-435.

［37］ Manichanh C， Rigottier-Gois L， Bonnaud E， et al. Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach［J］. Gut， 2006， 55（2）：205-211.

［38］ Ley RE， B?ckhed F， Turnbaugh P， et al. Obesity alters gut microbial ecology［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2005， 102（31）：11070-11075.

［39］ Turnbaugh PJ， Hamady M， Yatsunenko T， et al. A core gut microbiome in obese and lean twins［J］. Nature， 2009， 457（7228）：480-484.

［40］ B?ckhed F， Ding H， Wang T， et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004， 101（44）：15718-15723.

［41］ Turnbaugh PJ， Ley RE， Mahowald MA， et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest［J］. Nature， 2006， 444（7122）：1027-1131.

［42］ Larsen N， Vogensen FK， van den Berg FWJ， et al. Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from non-diabetic Adults［J］. PLoS One， 2010， 5（2）：e9085.

［43］ Chen YF， Yang FL， Lu HF， et al. Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis［J］. Hepatology，2011， 54（2）：562-572.

［44］ Gao Z， Tseng CH， Strober BE， et al. Substantial alterations of the cutaneous bacterial biota in psoriatic lesions［J］. PLoS One，2008， 3（7）：e2719.

［45］ Cho I， Blaser MJ. The Human Microbiome：at the interface of health and disease［J］. Nature Reviews Genetics， 2012， 13（4）：260-270.

［46］ Costello EK， Lauber CL， Hamady M， et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time［J］. Science， 2009， 326（5960）：1694-1697.

［47］ Blaser MJ， Kirschner D. The equilibria that allow bacterial persistence in human hosts［J］. Nature， 2007， 449（7164）：843-849.

［48］ Ravel J， Gajer P， Abdo Z， et al. Vaginal microbiome of reproductiveage women［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011， 108（Suppl. 1）：4680-4687.

［49］ Vestman NR， Chen T， Lif Holgerson P， et al. Oral microbiota shift after 12-week supplementation with Lactobacillus reuteri DSM 17938 and PTA 5289；A randomized control trial［J］. PLoS One， 2015， 10（5）：e0125812.

［50］ Eloe-Fadrosh EA， Brady A， Crabtree J， et al. Functional dynamics of the gut microbiome in elderly people during probiotic consumption［J］. MBio， 2015， 6（2）：e00231-15.

［51］ Lee YK， Mazmanian SK. Has the microbiota played a critical role in the evolution of the adaptive immune system？［J］. Science，2010， 330（6012）：1768-1773.

［52］ Wu GD， Chen J， Hoffmann C， et al. Linking long-term dietary patterns with gut microbial enterotypes［J］. Science， 2011， 334（6052）：105-108.

［53］ Dethlefsen L， Relman DA. Incomplete recovery and individualized responses of the human distal gut microbiota to repeated antibiotic perturbation［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011， 108（Suppl. 1）：4554-4561.

［54］ Martin Blaser. Antibiotic overuse：Stop the killing of beneficial bacteria［J］. Nature， 2011， 476（7361）：393-394.

［55］ Huse SM， Dethlefsen L， Huber JA， et al. Exploring microbial diversity and taxonomy using SSU rRNA hypervariable tag sequencing［J］. PLoS Genetics， 2008， 4（11）：e1000255.

［56］ Ochman H， Worobey M， Kuo CH， et al. Evolutionary relationships of wild hominids recapitulated by gut microbial communities［J］. PLoS Biology， 2010， 8（11）：e1000546.

［57］ Thum C， Cookson AL， Otter DE， et al. Can nutritional modulation of maternal intestinal microbiota influence the development of the infant gastrointestinal tract？［J］. The Journal of Nutrition， 2012，142（11）：1921-1928.

［58］ Sanz Y. Gut microbiota and probiotics in maternal and infant health［J］. The American journal of clinical Nutrition， 2011， 94（6 Suppl. ）：2000S-2005S.

［59］ Dominguez-Bello MG， Costello EK， Contreras M， et al. Delivery mode shapes the acquisition and structure of the initial microbiota across multiple body habitats in newborns［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010， 107（26）：11971-11975.

［60］ German JB， Freeman SL， Lebrilla CB， et al. Human milk oligosaccharides：evolution， structures and bioselectivity as substrates for intestinal bacteria［J］. Nestle Nutrition Workshop Series Paediatric Programme， 2008， 62：205-218；discussion 218-222.

［61］ Palmer C， Bik EM， DiGiulio DB， et al. Development of the Human Infant Intestinal Microbiota［J］. PLoS Biology， 2007， 5（7）：e177.

［62］ Hill DA， Artis D. Intestinal bacteria and the regulation of immunecell homeostasis［J］. Annual Review of Immunology， 2010， 28：623-667.

［63］ Lozupone CA， Stombaugh JI， Gordon JI， et al. Diversity， stability and resilience of the human gut microbiota［J］. Nature， 2012，489（7415）：220-230.

［64］ Kant AK. Consumption of energy-dense， nutrient-poor foods by adult Americans：nutritional and health implications. The third National Health and Nutrition Examination Survey， 1988-1994［J］. The American Journal of Clinical Nutrition， 2000， 72（4）：929-936.

［65］ Cauci S， Driussi S， De Santo D， et al. Prevalence of bacterial vaginosis and vaginal flora changes in peri- and postmenopausal women［J］. Journal of Clinical Microbiology， 2002， 40（6）：2147-2152.

［66］ Osborne NG， Wright RC， Grubin L. Genital bacteriology：a comparative study of premenopausal women with postmenopausal women［J］. American Journal of Obstetrics & Gynecology， 1979，135（2）：195-198.

［67］ The Human Microbiome Project Consortium. Structure， function and diversity of the healthy human microbiome［J］. Nature，2012， 486（7402）：207-214.

［68］ Kostic AD， Xavier RJ， Gevers D. The microbiome in inflammatory bowel disease：current status and the future ahead［J］. Gastroenterology， 2014， 146（6）：1489-1499.

［69］ Schnabl B， Brenner DA. Interactions between the intestinal microbiome and liver diseases［J］. Gastroenterology， 2014， 146（6）：1513-1524.

［70］ Uchiyama T， Miyazaki K. Functional metagenomics for enzyme discovery：challenges to efficient screening［J］. Current Opinion in Biotechnology， 2009， 20（6）：616-622.

［71］ Sogin ML， Morrison HG， Huber JA， et al. Microbial diversity in the deep sea and the underexplored “rare biosphere”［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006， 103（32）：12115-12120.

［72］ Venter JC， Remington K， Heidelberg JF， et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea［J］. Science，2004， 304（5667）：66-74.

［73］ Martín-Cuadrado AB， López-García P， Alba JC， et al. Metagenomics of the deep mediterranean， a warm bathypelagic habitat［J］. PLoS One， 2007， 2（9）：e914.

［74］ Junior NA， Meirelles PM， de Oliveira Santos E， et al. Microbial community diversity and physical-chemical features of the Southwestern Atlantic Ocean［J］. Archives of Microbiology，2015， 197（2）：165-179.

［75］ Tseng CH， Chiang PW， Lai HC， et al. Prokaryotic assemblages and metagenomes in pelagic zones of the South China Sea［J］. BMC Genomics， 2015， 16：219.

［76］ Spang A， Saw JH， Jorgensen SL， et al. Complex archaea that bridge the gap between prokaryotes and eukaryotes［J］. Nature， 2015，521（7551）：173-179.

［77］ Engebrecht J， Simon M， Silverman M. Measuring gene expression with light［J］. Science， 1985， 227（4692）：1345-1347.

［78］ Kulwiec M， Richardson TH， Chang WH， et al. A biodiversitybased approach to development of performance enzymes：Applied metagenomics and directed evolution［J］. Genetic Engineering News， 2006， 26（4）：16-19.

［79］ Rajendhran J， Gunasekaran P. Strategies for accessing soil metagenome for desired applications［J］. Biotechnology Advances， 2008， 26（6）：576-590.

［80］ Knapp CW， Dolfing J， Ehlert PA， et al. Evidence of increasing antibiotic resistance gene abundances in archived soils since 1940［J］. Environmental Science & Technology， 2010， 44（2）：580-587.

［81］ Ma L， Li B， Zhang T. Abundant rifampin resistance genes and significant correlations of antibiotic resistance genes and plasmids in various environments revealed by metagenomic analysis［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2014， 98（11）：5195-5204.

［82］ Su JQ， Wei B， Xu CY， et al. Functional metagenomic characterization of antibiotic resistance genes in agricultural soils from China［J］. Environment International， 2014， 65：9-15.

［83］ Courtois S， Cappellano CM， Ball M， et al. Recombinant environmental libraries provide access to microbial diversity for drug discovery from natural products［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2003， 69（1）：49-55.

［84］ Uchiyama T， Abe T， Ikemura T， et al. Substrate-induced geneexpression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes［J］. Nature Biotechnology， 2005， 23（1）：88-93.

（責(zé)任編輯 李楠）

Progress in the Study of Environmental Microbes by Metagenomic Methods

Liu Jiemeng1，2Qi Ji1
（1. State Key Laboratory of Genetic Engineering，School of Life Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200433；2. The T-Life Research Center，Department of Physics，F(xiàn)udan University，Shanghai 200433）

With the development of Next Generation Sequencing Technology（NGS）， metagenomics has become a significant strategy to understand the structures of environmental microbial community and their interactions. Metagenomics analyzes the environmental microbes as a whole rather than extracting the individuals for culture and thus it can avoid the troubles of conventional culturing progress and bypass the accompanying difficulties. Due to this advantage， several sequencing projects of environmental microbes on human， ocean， soil etc. have been launched and largely promoted the progress on metagenomic studies. In this review， we will discuss both the merits and restrictions of current methods and pipelines adopted in the analysis on metagenomic data and introduce the progress brought by their applications in the researches of various environmental samples.

metagenomics；high-throughput sequencing；bioinformatics；environmental microbe

an Microbiome Jumpstart

trains Consortium， Nelson KE， Weinstock GM， et al. A catalog of reference genomes from the human microbiome［J］. Science， 2010， 328（5981）：994-999.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.001

2015-07-21

劉捷孟，博士，研究方向：宏基因組學(xué)；E-mail：icaruswing@126.com

戚繼，博士，教授，研究方向：植物基因組學(xué)、計(jì)算生物學(xué)；E-mail：qij@fudan.edu.cn