陳松筆 安飛飛 朱文麗 李開綿 Luiz JCB Carvalho 李慶孝

蛋白質(zhì)組學(xué)是由基因組學(xué)一詞衍生而來，即由一個(gè)基因組、一個(gè)細(xì)胞或一種組織通過轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)的所有蛋白質(zhì)［1］。蛋白質(zhì)組學(xué)以基因組編碼的所有蛋白質(zhì)為研究對象，從細(xì)胞水平及生物體水平研究蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、修飾及其功能［2］，從而在蛋白質(zhì)水平探索其作用模式、功能機(jī)理、調(diào)節(jié)調(diào)控及相互作用［3］。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)取得了長足的發(fā)展，隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大［4］。本文對蛋白質(zhì)組學(xué)在木薯育種中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)工作平臺

1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)及其主要研究內(nèi)容

1994年，澳大利亞麥考瑞大學(xué)（MacquarieUniversity）的Wilkins和Williams首次提出了蛋白質(zhì)組學(xué)概念，他們把蛋白質(zhì)組定義為基因組表達(dá)產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)，即某一個(gè)物種、個(gè)體、器官、組織或細(xì)胞基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)［5］?；蜻x擇性表達(dá)及轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中的修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)隨組織、發(fā)育時(shí)期和生長環(huán)境的不同而發(fā)生變化。這些變化不僅反映在蛋白質(zhì)的豐度上，也反映在蛋白質(zhì)翻譯后的修飾和相互作用上［6］。蛋白質(zhì)組學(xué)最有價(jià)值的優(yōu)勢是可以觀察特定時(shí)間內(nèi)一個(gè)完整蛋白質(zhì)組在某種生理或病理狀態(tài)中發(fā)生的相應(yīng)變化［7，8］。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究范疇主要包括四個(gè)方面：結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)（Structural proteomics）、表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)（也稱比較蛋白質(zhì)組學(xué)，Expression proteomics）、相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)（Interaction proteomics）和功能蛋白質(zhì)組學(xué)（Functional proteomics），其中表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用比較廣泛［9，10］。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

1.2.1 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳 雙向電泳技術(shù)（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）是 O’Farrell在1975年建立［11］。到目前為止，仍然是全蛋白質(zhì)分離的核心技術(shù)。其原理是根據(jù)不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量進(jìn)行分離。優(yōu)點(diǎn)在于：分辨率較高，最好的凝膠能夠分離到10 000個(gè)點(diǎn)以上［12］，還可以對翻譯后修飾（如糖基化、磷酸化等）進(jìn)行分析。缺點(diǎn)是高豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)往往遮蔽掉稀有蛋白質(zhì)和低豐度蛋白質(zhì)，導(dǎo)致2-DE方法分離蛋白質(zhì)靈敏度降低，尤其對疏水性蛋白質(zhì)、極酸和極堿蛋白質(zhì)分離效果不是很好。為提高2-DE方法靈敏度，可通過增加雙向膠分辨率，分辨出具有相似等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。對極高豐度蛋白質(zhì)遮蔽問題可通過采用窄pH梯度膠條與預(yù)分級相結(jié)合的方法或者用親和色譜去除極高豐度蛋白質(zhì)方法來解決［10］。極酸和極堿蛋白分離可通過采用偏酸和偏堿性pH梯度膠條結(jié)合預(yù)分級方法來提高其分辨率［13］。

1.2.2 雙向熒光差異凝膠電泳 針對2-DE重復(fù)性較差的問題，Unlu等［14］開發(fā)出雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)（Two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis，2D-DIGE）。其原理是將3種來源不同的蛋白質(zhì)分別用不同CyDyeTM熒光染料標(biāo)記，混合后進(jìn)行2-DE，并用相應(yīng)激發(fā)波長來檢測被不同熒光基團(tuán)所標(biāo)記的蛋白，配合全自動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)分析軟件精確分析測定不同蛋白質(zhì)組之間的差異蛋白表達(dá)。這種方法克服了普通雙向電泳技術(shù)的一些瓶頸，能夠提高2-DE重復(fù)性和定量的精確度，還有助于2-DE整合到蛋白質(zhì)組的自動(dòng)化流程中去。目前，DIGE技術(shù)主要用于功能蛋白質(zhì)組學(xué)，如對各種癌癥的研究，尋找致病分子標(biāo)記物，探究癌變引起的蛋白質(zhì)變化等［15］。缺點(diǎn)是DIGE技術(shù)非常靈敏，目前許多質(zhì)譜儀還沒有足夠的靈敏度來鑒定其分離出的蛋白質(zhì)，且所用試劑非常昂貴，使之難于得到廣泛應(yīng)用。

1.2.3 同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù) 如何系統(tǒng)地識別和定量一個(gè)蛋白質(zhì)組是當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)主要目的，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)濃度對于其功能實(shí)現(xiàn)有著非常重要的作用［16］。美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司在2004年推出一項(xiàng)新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)——相對和絕對定量同位素標(biāo)記（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)［17］。iTRAQ 技術(shù)使用8 種（或4 種）不同的同位素試劑來同時(shí)標(biāo)記和比較8 種（或4 種）不同蛋白質(zhì)樣品［18］。iTRAQ技術(shù)已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法中一項(xiàng)重要技術(shù)，其作用已經(jīng)在許多生物體和組織研究中得到證明［19，20］。但iTRAQ 試劑容易受樣本中雜質(zhì)蛋白及處理過程中緩沖液的污染。此外，目前iTRAQ試劑仍非常昂貴，這在一定程度制約了它的廣泛應(yīng)用。

1.2.4 質(zhì)譜技術(shù) 與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定方法相比，質(zhì)譜分析技術(shù)具有靈敏、準(zhǔn)確、高通量、自動(dòng)化等特點(diǎn)成為當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的支柱［21］。質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的基本原理是使樣品分子離子化，然后根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比（m/z）差異來分離并確定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量［22］。質(zhì)量分析方式和電離方式的不同組合形成了不同類型質(zhì)譜。常見的離子化方式有電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光吸附電離（MALDI）。質(zhì)量分析方式有離子阱、傅立葉交換離子回旋共振、飛行時(shí)間和四極桿分析。四種質(zhì)量分析方式可獨(dú)立使用，也可串聯(lián)使用。例如，MALDI常常和TOF組合，來測定肽段質(zhì)量。近年來，MALDI也和兩個(gè)TOF聯(lián)用［23］。質(zhì)譜技術(shù)可用于磷酸化、糖苷化及其它蛋白質(zhì)的修飾化研究［24］。

2 木薯育種中存在的問題

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot Miller）植物，為世界3大薯類作物之一，塊根淀粉含量20％-40％［25］，有“地下糧倉和淀粉王”美稱［26］。木薯原產(chǎn)熱帶南美地區(qū)，有4 000多年的栽培歷史；木薯是19世紀(jì)20年代由東南亞愛國華僑開始引入我國，首先在廣東省高州市栽培，隨后傳入海南島并遍及華南地區(qū)，至今有200多年的栽培歷史。在我國木薯廣泛分布于廣西、廣東、云南、海南、福建和江西等華南省區(qū)，長江流域一些地區(qū)也有種植［27］。木薯既是我國南部地區(qū)重要的淀粉工業(yè)和生物質(zhì)能源原料，也是熱帶地區(qū)潛在的糧食安全有效補(bǔ)充。2015年9月17-18日國家木薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系組織召開“中國木薯栽培技術(shù)發(fā)展戰(zhàn)略研討會(huì)”，與會(huì)木薯育種學(xué)家根據(jù)目前市場和木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求提出我國“十三五”木薯育種任務(wù)，即選育的品種除了含有高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)特性外［26］，還要具備以下某方面的特征：（1）薯型粗短、結(jié)薯集中、易機(jī)械化收獲品種；（2）矮化密植綜合抗逆性強(qiáng)品種；（3）富含蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素及食用風(fēng)味好的品種；（4）早熟抗寒北移品種。然而木薯遺傳背景復(fù)雜，全基因組高度雜合，后代性狀分離嚴(yán)重，還具有自交不親和、種子數(shù)量少等特性，導(dǎo)致雜交選育種效率低下［25，26］等問題。因此，僅依靠傳統(tǒng)的雜交育種手段很難實(shí)現(xiàn)上述的“十三五”育種目標(biāo)［28-31］。近年來，利用高通量測序技術(shù)（Roche/454 或 Solexa）開展野生木薯近緣種M. esculenta ssp. flabellifolia（W14）與栽培品種M.esculenta ssp. esculenta（KU50）比較基因組學(xué)研究，完成了W14和KU50的全基因組草圖，證實(shí)了木薯基因組的高雜合度，分別發(fā)現(xiàn)野生祖先種和栽培種的34 483和38 845個(gè)基因。注釋了碳流、淀粉積累和氫氰酸合成代謝通路關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能，并開發(fā)出數(shù)百萬個(gè)全基因組分子標(biāo)記［32］。但通過這些全基因組數(shù)據(jù)只能間接告訴我們蛋白質(zhì)的功能，因?yàn)閺幕虮磉_(dá)的mRNA水平到最終合成蛋白質(zhì)水平，這其中包含著蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控、糖基化、磷酸化等諸多因素，這些因素都有可能改變作為直接作用因子的蛋白質(zhì)功能，因而直接研究蛋白質(zhì)變化具有不可替代的意義，它們幾乎負(fù)責(zé)細(xì)胞所有的生物化學(xué)活性。而采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析木薯不同種質(zhì)及其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或不同生長時(shí)期的蛋白質(zhì)組，通過解析它們的生物學(xué)功能、廣泛而完整的認(rèn)識蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)掘重要蛋白質(zhì)群在代謝通路的協(xié)同調(diào)控機(jī)制，為蛋白質(zhì)組學(xué)在木薯育種的應(yīng)用提供了重要平臺。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在木薯育種中的應(yīng)用

由于蛋白質(zhì)組學(xué)能從全蛋白質(zhì)角度提供植物細(xì)胞、組織或整株植物對環(huán)境脅迫的各種響應(yīng)信息［33］，因此蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。例如，分析水稻不育花粉［34］、小麥T 型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系［35］和矮桿大豆［36］的蛋白質(zhì)組，揭示出與雄性不育或矮桿突變體相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)群體，有助于從蛋白質(zhì)角度了解雄性不育和矮桿相關(guān)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。通過研究植物對生物和非生物脅迫，如病蟲害脅迫［37，38］、鹽脅迫［33］、缺氧脅迫［39］和熱脅迫［40］等的蛋白質(zhì)組學(xué)，對農(nóng)作物品質(zhì)和產(chǎn)量改良有一定積極作用。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)深入到亞細(xì)胞水平，亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組就是利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來分析一種組織或細(xì)胞的某一亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組成，它一方面降低樣品復(fù)雜度，使分析簡單化；另一方面可以相對富集相應(yīng)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低豐度蛋白質(zhì)。Chen等［13，41］運(yùn)用2-DE結(jié)合LCESI-MS/MS對細(xì)胞核、染色質(zhì)和細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)組進(jìn)行全面分析，確定了30多種關(guān)鍵蛋白質(zhì)在這3種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的定位和功能，對揭示蛋白質(zhì)的定位和功能信息具有重要價(jià)值。農(nóng)作物亞細(xì)胞研究比較多的是葉綠體［42，43］和線粒體［44，45］蛋白質(zhì)組，提供了功能基因組學(xué)的有用信息以及與這些組分生物發(fā)生相關(guān)的新組分鑒定等。本研究綜述當(dāng)前木薯蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成果，探討蛋白質(zhì)組學(xué)在木薯育種中的應(yīng)用。

3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)在選育高光效和高淀粉積累種質(zhì)中的應(yīng)用

木薯鮮薯產(chǎn)量依靠塊根淀粉的高效積累，而塊根淀粉主要來源于光合作用同化物的高效轉(zhuǎn)化。源（葉）是光合產(chǎn)物的生產(chǎn)和供應(yīng)者，源是庫（塊根）的基礎(chǔ)，庫是光合產(chǎn)物積累、需求、消耗的器官，因此解析源、流、庫的調(diào)控機(jī)制對挖掘木薯的產(chǎn)量潛力具有重要作用。陳霆［46］以不結(jié)薯的野生木薯（M. glaziovii）、結(jié)薯但產(chǎn)量很低的野生木薯近緣種W14和高產(chǎn)高淀粉木薯栽培種華南205（M. esculenta cv. SC 205）為研究材料，利用表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對3種木薯功能葉片蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較研究，同時(shí)結(jié)合葉片的組織結(jié)構(gòu)、葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)日變化數(shù)據(jù)，探討木薯栽培種葉片高光效的分子機(jī)制。3種木薯葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)ΦPSⅡ日變化均呈先上升后下降的趨勢，在上午11時(shí)均達(dá)到最大值，此時(shí)的凈光合速率也均達(dá)到最大值，且栽培種SC205顯著高于野生木薯和W14；根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)木薯栽培種SC205葉片中磷酸激酶等能量代謝、Rubisco、RCA等光合作用及淀粉合成相關(guān)的蛋白質(zhì)群高水平表達(dá)，作為一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子14-3-3蛋白質(zhì)在栽培種SC205也上調(diào)表達(dá)，推測其可能參與源、流、庫代謝通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而提高栽培種SC205葉片的光合效率；通過Western blot分析參與光合作用通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，如Rubisco、PEPC、D1及OEC等的表達(dá)水平，也驗(yàn)證了這一結(jié)果，這些研究可為高光效、高產(chǎn)、高淀粉木薯新品種的選育提供理論參考。為進(jìn)一步解析木薯塊根淀粉積累的分子機(jī)理，中國熱科院陳松筆研究團(tuán)隊(duì)通過采用雙向電泳結(jié)合MALDI-TOF-MS方法測定野生木薯近緣種W14和高產(chǎn)高淀粉栽培種SC205及華南8號（SC8）塊根蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)，塊根共有蛋白質(zhì)103個(gè)，野生種特有蛋白質(zhì)58個(gè)，栽培種特有蛋白質(zhì)87個(gè)；從這些特有蛋白質(zhì)中有可能篩選出高產(chǎn)木薯種質(zhì)的標(biāo)記蛋白質(zhì)。宋紅艷［47］以野生木薯M. glaziovii為對照，開展W14和SC205 塊根淀粉合成和分解代謝通路的轉(zhuǎn)錄組研究。結(jié)果顯示栽培種SC205和W14相比，與淀粉合成通路相關(guān)的蛋白酶活力提高，與淀粉降解相關(guān)的蛋白酶活力降低，研究結(jié)果從轉(zhuǎn)錄組水平支持了木薯栽培種SC205塊根淀粉高積累的分子機(jī)制。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)在選育高蛋白質(zhì)和高類胡蘿卜素食用種質(zhì)中的應(yīng)用

木薯塊根沒有蛋白質(zhì)體，缺少貯存蛋白質(zhì)的功能［48］，這是木薯塊根蛋白質(zhì)含量（0.7％-2.5％，DW）普遍低于谷類作物（7％-14％，DW）的原因；許多長期以木薯塊根為食的非洲國家，由于蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良表現(xiàn)出嬰幼兒、兒童及青少年生長發(fā)育遲緩、消瘦、智力發(fā)育障礙和成人易疲倦、貧血、免疫功能下降、生殖功能障礙等征狀。巴西國家農(nóng)牧研究院Carvalho教授團(tuán)隊(duì)通過光學(xué)顯微技術(shù)觀察木薯不同種質(zhì)的塊根，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量低的白心木薯塊根（蛋白質(zhì)含量為0.955％，DW）有色體數(shù)量少，而深黃木薯塊根（蛋白質(zhì)含量為6.12％，DW）的有色體數(shù)量是白心木薯的5倍以上；推測木薯蛋白質(zhì)含量可能與有色體數(shù)量相關(guān)。木薯有色體是類胡蘿卜素的載體，普通木薯類胡蘿卜素含量低（2.4mg/g FW）［49］。Ceballos 等［49］和 Sánchez 等［50］利 用 雜交育種方法從2148份種質(zhì)中篩選出高類胡蘿卜素達(dá)25.8mg/g FW的種質(zhì)，與含量最低的種質(zhì)類胡蘿卜素含量相差258倍。為解析類胡蘿卜素在木薯有色體的高積累與有色體是否作為蛋白質(zhì)積累的載體，可采用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組對木薯塊根有色體蛋白質(zhì)進(jìn)行全面分析，使蛋白質(zhì)定位和鑒定變得更簡單、快捷、準(zhǔn)確和高效。如Carvalho 等［51］通過空間排阻色譜法（Size exclusion chromatography）從深黃木薯塊根有色體分離出與類胡蘿卜結(jié)合蛋白質(zhì)及類胡蘿卜非結(jié)合蛋白質(zhì)兩部分，然后采用LC-MS/MS質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，與類胡蘿卜結(jié)合蛋白質(zhì)有83個(gè)，與類胡蘿卜非結(jié)合蛋白質(zhì)106個(gè)，其中超過一半以上的蛋白質(zhì)都是HSP。類胡蘿卜素的生物合成多種多樣，是一個(gè)高度調(diào)控的過程。在光合作用組織里，類胡蘿卜素積累在葉綠體膜上，而在非光合作用組織里，類胡蘿卜素在有色體中積累。有色體是由白色體或葉綠體轉(zhuǎn)變而來，有色體也能轉(zhuǎn)變?yōu)槿~綠體［52］，研究表明Or基因能夠調(diào)控有色體分化和有色體-葉綠體之間的轉(zhuǎn)變，Or 基因編碼的蛋白質(zhì)為 DnaJ-like cochaperone。DnaJ蛋白質(zhì)的作用是與HSP70伴侶相互作用，共同進(jìn)行蛋白質(zhì)的折疊、組裝，拆卸和易位［53］。Or基因不直接調(diào)控類胡蘿卜素的合作，通過顯微結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)Or 基因在植物原本不積累色素的部位引起白色體或淀粉體向有色體轉(zhuǎn)變，成為類胡蘿卜素貯存庫，從而在不影響正常類胡蘿卜素代謝通路的前提下促進(jìn)類胡蘿卜素積累［54］。Fibrillin蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能［55］，在許多植物中均有發(fā)現(xiàn)，尤其在類胡蘿卜素儲存纖維型有色體中。通過利用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法，Carvalho等［51］發(fā)現(xiàn) Fibrillin 和 Or 蛋白質(zhì)位置是在類胡蘿卜非結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域，表明這兩個(gè)蛋白質(zhì)間接參與類胡蘿卜素積累的代謝通路，該報(bào)道驗(yàn)證了上述研究結(jié)果。Carvalho等［51］的亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究還第一次揭示在有色體中與木薯塊根蛋白質(zhì)積累通路偶聯(lián)的5個(gè)蛋白質(zhì)，即HSP18.1，HSP21，HSP17.4，HSP17.6和 Or蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可作為衡量木薯塊根蛋白質(zhì)高積累的標(biāo)記。通過亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究還可以解析有色體類胡蘿卜素積累與蛋白質(zhì)含量偶聯(lián)的主要環(huán)節(jié)［56］。因?yàn)槟臼韷K根的白色體主要是淀粉體，當(dāng)?shù)矸垠w向有色體轉(zhuǎn)變后，為類胡蘿卜的合成和積累提供了場所和載體，保證有色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能發(fā)揮以及類胡蘿卜素積累的持續(xù)，導(dǎo)致一系列蛋白質(zhì)參與促成這些代謝過程的穩(wěn)定運(yùn)行，因而從總體上提高了蛋白質(zhì)的含量。所以淀粉體向有色體轉(zhuǎn)變的調(diào)控機(jī)制是提高木薯種質(zhì)蛋白質(zhì)積累的關(guān)鍵，這些研究結(jié)果為選育高蛋白質(zhì)木薯種質(zhì)提供了新思路［57］。

3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在選育抗逆木薯種質(zhì)中的應(yīng)用

木薯為二倍體植株，染色體數(shù)為36［58］，其可利用莖稈作為種莖進(jìn)行無性繁殖；通過人工誘變可獲得多倍體，如利用秋水仙素誘導(dǎo)木薯腋芽，獲得一系列木薯多倍體，增加遺傳進(jìn)化的多樣化。多倍體育種不受開花授粉時(shí)間和氣候環(huán)境的限制，靈活性較大［59］。木薯染色體加倍后，表型常表現(xiàn)出器官增大、性成熟晚及抗性增強(qiáng)等特點(diǎn)［60］。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究多倍體，可從全蛋白質(zhì)角度解析木薯多倍體抗性提高的分子機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)木薯NZ199四倍體參與光合作用、碳代謝與能量代謝及防御體系的蛋白質(zhì)群表達(dá)水平均上調(diào)，說明NZ199四倍體的光合效率與抗逆性均顯著高于其二倍體；通過分析四倍體和二倍體功能葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)ΦPSⅡ的變化及它們對鹽脅迫的反應(yīng)，驗(yàn)證了上述蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果［61，62］。為進(jìn)一步從分子水平揭示多倍體對產(chǎn)量的影響，安飛飛等［63，64］利用蛋白質(zhì)學(xué)方法研究SC8二倍體和四倍體功能葉片及塊根的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)四倍體葉片參與光合作用的相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，而塊根中參與淀粉合成的部分蛋白表達(dá)下調(diào)，說明四倍體光合效率較二倍體顯著提高［63］，但鮮薯產(chǎn)量下降［64］；四倍體和二倍體葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)ΦPSⅡ變化及鮮薯產(chǎn)量分析結(jié)果支持上述蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報(bào)道；這些分析結(jié)果從分子水平為木薯多倍體種質(zhì)的改良提供理論參考。

木薯為熱帶作物，對低溫敏感。為促進(jìn)木薯的北移，擴(kuò)大我國木薯種植面積，滿足淀粉生產(chǎn)企業(yè)對木薯原料的需求，選育耐低溫木薯品種是國家木薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系“十三五”的育種目標(biāo)之一。通過利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究在5℃低溫脅迫15 d木薯的葉片生理生化特性變化及其蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫后，葉片中參與光合作用、碳水化合物與能量代謝、蛋白質(zhì)合成及生物防御等多個(gè)代謝通路的蛋白質(zhì)群表達(dá)水平發(fā)生顯著變化［65］。由于木薯在每年3-4月分經(jīng)常遇到干旱，為從分子水平了解木薯對干旱的蛋白質(zhì)響應(yīng)機(jī)制，徐娟［66］利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究耐旱木薯品種華南124在干旱脅迫下葉片的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)其葉片中參與光合作用、能量代謝及防御系統(tǒng)的蛋白質(zhì)群表達(dá)水平上調(diào)，說明該品種抗旱能力較強(qiáng)，可在較為干旱地區(qū)推廣種植；利用上述研究結(jié)果篩選出一批耐寒及耐旱木薯種質(zhì)。

Li等［67］研究木薯SC8不同組織的蛋白質(zhì)組，表明木薯塊根含有102個(gè)特異蛋白質(zhì)，它們在木薯組織、器官和細(xì)胞的生長發(fā)育過程中行使不同的生物學(xué)功能，塊根不僅作為儲藏營養(yǎng)的器官，還參與了大部分的生理代謝活動(dòng)。但塊根不耐貯藏［68］，在收獲72h內(nèi)快速出現(xiàn)采后變質(zhì)，這種快速變質(zhì)過程與收獲過程中不可避免的機(jī)械損傷有關(guān)［69］，因此耐貯性一直是國際上木薯研究的熱點(diǎn)［70］；木薯若保質(zhì)期延長到幾周，僅尼日利亞在20年間將會(huì)減少經(jīng)濟(jì)損失29億美元［71］。通過研究國內(nèi)兩個(gè)主栽木薯品種在塊根貯藏中的差異蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗氧脅迫相關(guān)的蛋白質(zhì)在貯藏過程中均有不同程度的變化，尤其是鈣調(diào)素蛋白質(zhì)（CaM），其在采收貯藏24h和72h后的表達(dá)量均出現(xiàn)明顯上調(diào)。Ca2+作為信號分子是木薯塊根采后腐爛調(diào)節(jié)的關(guān)鍵，Ca2+-CaM復(fù)合物體系的網(wǎng)絡(luò)樞紐可能在調(diào)控整個(gè)木薯塊根采后生理代謝中起著重要作用［72］。研究還發(fā)現(xiàn)塊根皮層與薯肉的差異表達(dá)蛋白質(zhì)分別參與碳水化合物和能量代謝、解毒、信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成等代謝途徑，而且木薯塊根皮層相關(guān)蛋白質(zhì)還具有構(gòu)建防御系統(tǒng)及對薯肉起保護(hù)作用的功能，在貯存過程中其蛋白質(zhì)降解較快，推測這些蛋白質(zhì)也是塊根延長貯存的關(guān)鍵調(diào)控蛋白質(zhì)［73］。目前，正在進(jìn)一步對CaM在采后腐爛過程中的生物學(xué)功能進(jìn)行驗(yàn)證。

4 展望

蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如應(yīng)用于鑒定參與防御和應(yīng)激反應(yīng)以及在改進(jìn)作物突變體中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)群等。本研究從選育高光效、高淀粉積累、高蛋白質(zhì)和高類胡蘿卜素及高抗逆種質(zhì)方面闡述蛋白質(zhì)組學(xué)在木薯育種中的應(yīng)用。隨著木薯全基因組測序和組裝工作的完成及基因組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建［32］，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)在木薯育種中的應(yīng)用將會(huì)變得越來越重要。利用木薯全基因組草圖和基因組數(shù)據(jù)庫平臺，可推測蛋白質(zhì)的氨基酸組成和結(jié)構(gòu)；利用蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域來推測該蛋白質(zhì)在不同代謝通路的生物學(xué)功能及其相互作用關(guān)系，從而驗(yàn)證和闡明蛋白質(zhì)在其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要生物學(xué)功能，建立木薯選育高光效、高淀粉積累、高蛋白和高類胡蘿卜素及抗花葉和褐條病毒病種質(zhì)的蛋白質(zhì)生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，來創(chuàng)制具有優(yōu)良特色的突變體，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)對輔助木薯選育種中的重要作用。為了更好地解決木薯選育種中面臨的挑戰(zhàn)，進(jìn)一步提高木薯選育種效率，除了依托木薯基因組學(xué)研究平臺外，有必要在以下三個(gè)方面進(jìn)行系統(tǒng)和深入開展蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。（1）強(qiáng)調(diào)多學(xué)科交叉研究，構(gòu)建木薯綜合大數(shù)據(jù)庫：結(jié)合栽培生理、基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組及系統(tǒng)生物學(xué)進(jìn)行深入研究，從生理表象、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯和修飾、主要代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物層面深入分析木薯表現(xiàn)型和基因型的關(guān)系，篩選出調(diào)控木薯產(chǎn)量性狀和抗性等相關(guān)農(nóng)藝性狀的關(guān)鍵基因及重要蛋白質(zhì)，并進(jìn)行功能驗(yàn)證，為加快木薯選育種進(jìn)程提供綜合大數(shù)據(jù)庫。（2）加強(qiáng)蛋白質(zhì)相互作用研究：將鑒定到與木薯不同生理代謝通路相關(guān)的重要蛋白質(zhì)群制作成蛋白質(zhì)芯片，結(jié)合酵母雙雜交和表面等離子共振技術(shù)等，高通量研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-RNA及蛋白質(zhì)-小分子等的相互作用，揭示木薯不同突變體生長發(fā)育、分化凋亡以及其生物調(diào)控機(jī)制等生命活動(dòng)規(guī)律。（3）加深研究與代謝活動(dòng)相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾機(jī)制：蛋白質(zhì)翻譯后修飾與蛋白質(zhì)生物學(xué)功能密切相關(guān)，如磷酸化、甲基化、乙?；⒎核鼗?、糖基化等，分析這些蛋白質(zhì)修飾與信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡以及逆境脅迫生理代謝通路的相關(guān)性，為木薯選育種中開發(fā)與性狀相關(guān)的標(biāo)記蛋白質(zhì)及更好地揭示其在生理代謝中的作用機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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