劉 姣， 張祥雪， 張 立

(北京林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，北京 100083)

植物葉片陣列LED紅外光譜檢測(cè)儀設(shè)計(jì)*

劉 姣， 張祥雪， 張 立

(北京林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，北京 100083)

針對(duì)植物葉片葉綠體中四種葉綠體色素的快速測(cè)量，設(shè)計(jì)了基于光電無(wú)損技術(shù)和近紅外光譜的快速測(cè)量?jī)x器。該儀器以ATmega 128A微處理器為核心，采用8只LED組成陣列LED和旋轉(zhuǎn)式測(cè)量方式，利用OPT101光電傳感器進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換并將檢測(cè)結(jié)果發(fā)送給微處理器處理與保存，可以完成對(duì)四種葉綠體色素即葉綠素a、葉綠素b、葉黃素和胡蘿卜素的測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該儀器與UniSpec-SC Spectral Analysis System光譜儀有一致的測(cè)量結(jié)果，測(cè)量值能夠準(zhǔn)確表征四種色素的含量，具有攜帶方便、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、測(cè)量結(jié)果可靠性高等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)林科研上具有一定的實(shí)用價(jià)值。

紅外線； 光譜技術(shù)； 葉綠體色素； 光電傳感器； 陣列LED

0 引 言

植物光合作用過(guò)程中吸收光能的葉綠體色素有葉綠素(包括葉綠素a 和葉綠素b)和類(lèi)胡蘿卜素(包括胡蘿卜素和葉黃素)[1]。 準(zhǔn)確測(cè)量植物色素尤其是葉綠體色素的含量，對(duì)判斷植株?duì)I養(yǎng)狀況、生長(zhǎng)發(fā)育狀況、光合生理與逆境生理狀況等具有重要的意義[2]。

傳統(tǒng)化學(xué)測(cè)量方法不僅操作繁瑣，且耗時(shí)耗力，難以進(jìn)行大批量樣品的快速測(cè)量和在線分析[3]。為了克服現(xiàn)有的化學(xué)測(cè)量方法的缺點(diǎn)與不足，許多學(xué)者提出了各種色素含量的無(wú)損檢測(cè)的方法[4,5]，其中基于近紅外光譜技術(shù)的光電無(wú)損測(cè)量方法是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，多位專(zhuān)家學(xué)者已研制出利用近紅外光譜檢測(cè)設(shè)備[6,7]。近些年來(lái)，依據(jù)光譜特性測(cè)量物質(zhì)的各種特性已成為各行業(yè)的研究熱點(diǎn)，應(yīng)用十分廣泛[8]，非接觸式便攜式近紅外光譜儀器是未來(lái)研究的方向[2,9]。光譜特性是指物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的響應(yīng)特性，每種物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光的吸收率和反射率是不同的，由此為基本原理設(shè)計(jì)了基于紅外光譜的LED陣列便攜設(shè)備，可用于測(cè)量高等植物的四種葉綠體色素。

1 設(shè)計(jì)原理

本儀器的設(shè)計(jì)原理是根據(jù)葉片內(nèi)的葉綠體色素對(duì)有色光的吸收特性，通過(guò)測(cè)量一定波長(zhǎng)的發(fā)射光強(qiáng)和透過(guò)葉片后的光強(qiáng)進(jìn)而計(jì)算、分析出各個(gè)色素的含量[10]。

研究表明,綠色植物葉片在400～700 nm的可見(jiàn)光區(qū)域有2個(gè)強(qiáng)吸收谷，反射率均小于20 %，但在700～1 300 nm的近紅外波段，具有較高的反射率[11]。葉綠體色素對(duì)光的主要吸收區(qū)域是藍(lán)光區(qū)和紅光區(qū)，在綠光區(qū)域吸收最小，但在近紅外區(qū)域基本不吸收。因此,選擇紅光區(qū)域、藍(lán)光區(qū)域和近紅外區(qū)域來(lái)測(cè)量葉綠體色素，即選擇特征波長(zhǎng)分別為葉綠素a的吸收峰663 nm、葉綠素b的吸收峰645 nm、葉黃素的吸收峰445 nm和胡蘿卜素的吸收峰450 nm分別作為四種色素的特征波長(zhǎng)，選擇940 nm的近紅外光作為參比波長(zhǎng)，運(yùn)用SPAD測(cè)量原理進(jìn)行測(cè)量[12]。

計(jì)算和測(cè)量四種葉綠體色素相對(duì)含量值的方法如下：測(cè)量前先進(jìn)行校準(zhǔn)，在沒(méi)有被測(cè)樣本的條件下讓波長(zhǎng)為特征波長(zhǎng)的LED和波長(zhǎng)為940 nm的參比波長(zhǎng)的LED依次發(fā)光，儀器測(cè)量部分的光電傳感器將采集的光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)由微處理器的A/D轉(zhuǎn)換模塊處理后，計(jì)算兩種發(fā)射光光強(qiáng)比。校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行多次直至校準(zhǔn)到符合測(cè)量的滿(mǎn)意度。校準(zhǔn)后放入被測(cè)樣本，同上面的校準(zhǔn)過(guò)程讓2只LED依次發(fā)光，經(jīng)微處理器處理后獲取透射光光強(qiáng)比，使用公式(1)計(jì)算出各色素的SPAD值[12]

SPAD=K×ln((IRt/IR0)/(Rt/R0)).

(1)

其中，K為常數(shù)，K的取值因物種的不同而有所不同，可以查表得到該值。IRt為透過(guò)葉片的940 nm近紅外光光照強(qiáng)度，IR0為無(wú)葉片時(shí)940 nm近紅外光直射光照強(qiáng)度，Rt為接收到的透過(guò)葉片的特征波長(zhǎng)(663,645,445,450 nm)的光照強(qiáng)度，R0為相應(yīng)的無(wú)葉片時(shí)直射光照強(qiáng)度。

由此可以分別計(jì)算出四種葉綠體色素的SPAD值。研究表明，SPAD值與葉綠素含量有顯著的相關(guān)性[13～15]，在野外測(cè)量中可以對(duì)葉綠體色素的含量提供的可靠的估計(jì)，有利于農(nóng)林業(yè)相關(guān)科研工作[16～18]。

2 硬件設(shè)計(jì)

植物葉片陣列LED紅外光譜檢測(cè)系統(tǒng)硬件電路設(shè)計(jì)框圖如圖1所示。系統(tǒng)主要有由陣列式LED光源構(gòu)成的夾具、光電轉(zhuǎn)換與信號(hào)采集模塊、單片機(jī)微處理器、電源模塊組成。儀器以AVR Atmega 128A單片機(jī)為核心，結(jié)合光電傳感器轉(zhuǎn)換電路、按鍵及顯示模塊，實(shí)現(xiàn)傳感器對(duì)葉片葉綠體色素的采集、計(jì)算、顯示及存儲(chǔ)過(guò)程。

圖1 硬件電路設(shè)計(jì)框圖

2.1 光電轉(zhuǎn)換與光路設(shè)計(jì)

光電轉(zhuǎn)換與信號(hào)采集模塊使用美國(guó)Burr-Brown公司生產(chǎn)的芯片OPT101和簡(jiǎn)單的外圍電路構(gòu)成。本儀器的光電轉(zhuǎn)換與信號(hào)采集模塊使用了2片OPT101，一片用于采集和處理色素特征波長(zhǎng)光的光強(qiáng)，另一片用于參比波長(zhǎng)光強(qiáng)的采集。

為了保證發(fā)射光源的穩(wěn)定與測(cè)量時(shí)光源的單一性，本系統(tǒng)利用電流可調(diào)的恒流源芯片來(lái)供電，并利用單片機(jī)的I/O端口來(lái)控制LED陣列的工作狀態(tài)。

測(cè)量葉片夾由8只不同波長(zhǎng)的LED構(gòu)成，其中有4只940 nm的參比波長(zhǎng)的近紅外光LED和4種不同色素的特征吸收波長(zhǎng)的LED，其排列分布如圖2所示。

圖2 陣列LED分布圖

葉片夾是由上下2個(gè)圓形面板構(gòu)成，上半部分為L(zhǎng)ED光源，下半部分為光電傳感器，其排列分布如圖3所示。測(cè)量時(shí)只需轉(zhuǎn)動(dòng)葉片夾的上半部分，對(duì)準(zhǔn)測(cè)量位置后即可進(jìn)行測(cè)量。采用圓形面板和轉(zhuǎn)動(dòng)的方式，大大減少了傳感器的數(shù)量和葉片夾的面積。

圖3 傳感器分布圖

如圖4所示，上夾片的LED分為4組并均勻地分布在上夾片上，LED1與LED2為一組用于測(cè)量葉綠素a的含量，LED3與LED4用于測(cè)量葉綠素b的含量，LED5與LED6用于測(cè)量葉黃素的含量，LED7與LED8用于測(cè)量胡蘿卜素的含量。當(dāng)需要更換測(cè)量色素種類(lèi)時(shí)，只需將上夾片旋轉(zhuǎn)一定的角度即可進(jìn)行測(cè)量。

圖4 光路傳輸圖

2.2 通信模塊

本儀器的通信模塊使用的是RS—232通信接口。程序采用中斷方式與計(jì)算機(jī)通信，當(dāng)本系統(tǒng)接收到到來(lái)自計(jì)算機(jī)的相關(guān)命令時(shí)，系統(tǒng)將命令進(jìn)行處理后，會(huì)把命令中需要的指定數(shù)據(jù)發(fā)送給計(jì)算機(jī)。計(jì)算機(jī)可以使用超級(jí)終端或其他串口助手或本文設(shè)計(jì)的LabVIEW程序讀取數(shù)據(jù)。

3 軟件設(shè)計(jì)

本儀器軟件源程序采用符合ANSI標(biāo)準(zhǔn)的C語(yǔ)言在ICCAVR軟件環(huán)境編寫(xiě)編譯。系統(tǒng)主程序和中斷程序流程圖如圖5，系統(tǒng)主程序初始化完成以后，分別調(diào)用各個(gè)子程序，程序引導(dǎo)儀器設(shè)置完成后，系統(tǒng)進(jìn)入測(cè)量就緒狀態(tài)，由用戶(hù)按鍵決定測(cè)量種類(lèi)與測(cè)量開(kāi)始時(shí)間。按鍵時(shí)系統(tǒng)會(huì)先進(jìn)行校準(zhǔn)，如測(cè)量葉綠素a時(shí)，要在不放入葉片到葉片夾中時(shí)進(jìn)行一次校準(zhǔn)，如果校準(zhǔn)效果不理想，可進(jìn)行多次校準(zhǔn)，直至達(dá)到預(yù)期的校準(zhǔn)效果，完成校準(zhǔn)后可放入葉片進(jìn)行葉綠素a的測(cè)量，若接下來(lái)的測(cè)量都是葉綠素a的測(cè)量，直接測(cè)量即可，無(wú)需多次校準(zhǔn)。在進(jìn)行另一種色素測(cè)量時(shí)，仍需對(duì)另一種色素測(cè)量進(jìn)行校準(zhǔn)，即更換測(cè)量色素種類(lèi)時(shí)，需要對(duì)當(dāng)前測(cè)量物種進(jìn)行校準(zhǔn)。需要注意的是，由于葉脈是由不含葉綠素的薄壁組織、厚角細(xì)胞等組成的，比較粗大的主脈對(duì)測(cè)量結(jié)果有較大影響，測(cè)量時(shí)需要將2個(gè)光源都避開(kāi)主脈和可見(jiàn)的相對(duì)較粗的側(cè)脈，盡量在同一個(gè)側(cè)脈區(qū)域完成一次測(cè)量操作，以保證參比光路和測(cè)量光路透過(guò)的區(qū)域有相近的色素分布，使參比光路起到參比作用。

圖5 主程序和中斷程序流程圖

測(cè)量完成后，微處理器經(jīng)過(guò)計(jì)算處理將測(cè)量結(jié)果會(huì)顯示在LCD顯示屏上，并將結(jié)果保存到存儲(chǔ)器。存儲(chǔ)結(jié)果可以通過(guò)與電腦串口通信獲取，為了方便結(jié)果分析，設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)單的LabVIEW程序讀取串口數(shù)據(jù)并將數(shù)據(jù)輸入到Excel表格中。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

儀器設(shè)計(jì)制作完成后，用美國(guó)PP System公司生產(chǎn)的UniSpec—SC Spectral Analysis System光譜儀(簡(jiǎn)稱(chēng)光譜儀)進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。光譜儀通過(guò)測(cè)量植物葉片發(fā)射光譜分析、計(jì)算可以得到葉片的相關(guān)信息，如色素含量、水分含量等，且該儀器出廠前與傳統(tǒng)的分光光度法測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)對(duì)比校正，本儀器通過(guò)與光譜儀測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，可以估算出葉片的各種相關(guān)色素含量，有一定的參考價(jià)值。光譜儀測(cè)量時(shí)的具體操作是每次測(cè)量前先測(cè)量光源照射到白板后的反射光強(qiáng)作為光源原始強(qiáng)度，再測(cè)量同一光源照射到葉片的反射光強(qiáng)，測(cè)量結(jié)果導(dǎo)入到PC端經(jīng)處理可以得到波長(zhǎng)310～1 130 nm間每個(gè)波長(zhǎng)的光強(qiáng)的變化率，即葉片反射光強(qiáng)與白板反射光強(qiáng)的比值。這個(gè)比值可以代入公式(1)進(jìn)行計(jì)算。所以，用光譜儀同本儀器同時(shí)測(cè)量，并取光譜儀得到的數(shù)據(jù)中663，645，445，450，940 nm波長(zhǎng)的光強(qiáng)變化率計(jì)算SPAD值與本儀器測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。因光譜儀在測(cè)量時(shí)采用測(cè)量3次取平均值的方式，所以，本儀器測(cè)量時(shí)每個(gè)測(cè)量點(diǎn)也是測(cè)量3次取平均值。需要注意的是：用光譜儀測(cè)量時(shí)需要將出現(xiàn)過(guò)大于1的該組數(shù)據(jù)去掉，使用本儀器測(cè)量是需要將與平均值相差較大的測(cè)量數(shù)據(jù)去掉再去平均值。

實(shí)驗(yàn)樣本是采集北京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的鵝掌楸樹(shù)葉，每片樹(shù)葉在同一個(gè)測(cè)量點(diǎn)用光譜儀和本儀器測(cè)量3次，取平均值后進(jìn)行對(duì)比分析。

葉綠素a、葉綠素b、葉黃素和胡蘿卜素的對(duì)比圖如圖6～圖9所示，其中實(shí)線為光譜儀數(shù)據(jù)測(cè)量值，虛線為本儀器測(cè)量值。

各測(cè)量值是采集校園里的多種物種測(cè)量所得，包含有不同物種的葉片和相同物種的不同葉齡的葉片，光譜儀計(jì)算數(shù)值與儀器測(cè)量值的相關(guān)性分別為：葉綠素a為0.930 6，葉綠素b為0.917 0 ，葉黃素為0.948 8，胡蘿卜素為0.922 1，相關(guān)度良好。

圖6 葉綠素a數(shù)據(jù)對(duì)比圖

圖7 葉綠素b數(shù)據(jù)對(duì)比圖

圖8 葉黃素?cái)?shù)據(jù)對(duì)比圖

圖9 胡蘿卜素?cái)?shù)據(jù)對(duì)比圖

觀察曲線可知，本儀器的曲線走向與光譜儀計(jì)算數(shù)值的曲線走向基本一致，對(duì)比說(shuō)明本儀器測(cè)量值有可靠的準(zhǔn)確性。

5 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)了一種基于光電無(wú)損技術(shù)和近紅外光譜的植物葉片快速測(cè)量?jī)x，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明了儀器實(shí)現(xiàn)光電無(wú)損測(cè)量葉綠體色素相對(duì)含量的方法的可實(shí)現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。在采用常規(guī)微處理器和常見(jiàn)低成本芯片的條件下，實(shí)現(xiàn)了光電無(wú)損測(cè)量多種色素的功能。儀器在保證便攜、使用方便的前提下，實(shí)現(xiàn)了多功能測(cè)量，與日本發(fā)明的SPAD—502相比具有更廣泛的應(yīng)用，且成本低廉，在農(nóng)林業(yè)科研上具有一定的實(shí)用價(jià)值。

[1] 王英姿，洪 偉，吳承禎，等.靈石山米櫧林優(yōu)勢(shì)種不同葉齡葉綠體色素沿海拔梯度的變化[J].林業(yè)科學(xué),2010(11):43-51.

[2] 張 伏，張亞坤，毛鵬軍，等.植物葉綠素測(cè)量方法研究現(xiàn)狀及發(fā)展[J].農(nóng)機(jī)化研究,2014(4):238-241.

[3] 宋 怡，劉 巍，段焰青，等.近紅外光譜法快速測(cè)定煙草中的植物色素[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào),2009(2):15-18.

[4] 湯旭光，宋開(kāi)山，劉殿偉，等.基于可見(jiàn)/近紅外反射光譜的大豆葉綠素含量估算方法比較[J].光譜學(xué)與光譜分析,2011(2):371-374.

[5] 王 偉，彭彥昆，馬 偉，等.冬小麥葉綠素含量高光譜檢測(cè)技術(shù)[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào),2010(5):172-177.

[6] 余 謙，張 軍，陳 哲，等.陣列LED油品檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2010(3):1213-1217.

[7] 邱白晶，殷 磊.基于近紅外光譜技術(shù)的葉面藥液濃度檢測(cè)[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào),2012(9):197-201.

[8] 熊 英.近紅外光譜的原理及應(yīng)用[J].中山大學(xué)研究生學(xué)刊:自然科學(xué)·醫(yī)學(xué)版,2013(2):16-30.

[9] 于新洋，盧啟鵬，高洪智，等.便攜式近紅外光譜儀器現(xiàn)狀及展望[J].光譜學(xué)與光譜分析,2013(11):2983-2988.

[10] 蘇云松，郭華春，楊雪蘭.甘薯、薯蕷和魔芋葉片SPAD值與葉綠素含量的相關(guān)性研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009(1):64-66.

[11] 李明贊，王 秀，韓東海.光譜分析技術(shù)及其應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2006.

[12] 吳長(zhǎng)山，童慶禧，鄭蘭芬，等.水稻、玉米的光譜數(shù)據(jù)與葉綠素的相關(guān)分析[J].應(yīng)用基礎(chǔ)與工程科學(xué)學(xué)報(bào),2000(1):31-37.

[13] 何麗斯，蘇家樂(lè)，劉曉青，等.高山杜鵑葉片葉綠素含量測(cè)定及其與SPAD值的關(guān)系[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(11):190-191.

[14] 薛 香，吳玉娥.小麥葉片葉綠素含量測(cè)定及其與SPAD值的關(guān)系[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(11):2701-2702.

[15] 宋英博.光譜儀與SPAD測(cè)定馬鈴薯葉綠素含量的比較[J].中國(guó)馬鈴薯,2010(2):77-79.

[16] 李敏夏，張林森，李丙智，等.蘋(píng)果葉片高光譜特性與葉綠素含量和SPAD值的關(guān)系[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2010(2):35-39.

[17] 李慶波，徐玉坡，張超航，等.基于光譜技術(shù)的植物葉綠素濃度無(wú)損檢測(cè)儀器的研制[J].光譜學(xué)與光譜分析,2009(10):2875-2878.

[18] 劉 飛，王 莉，何 勇，等.基于可見(jiàn)/近紅外光譜技術(shù)的黃瓜葉片SPAD值檢測(cè)[J].紅外與毫米波學(xué)報(bào),2009(4):272-276.

Design of plant leaves detector with IR spectral technology and LED array*

LIU Jiao, ZHANG Xiang-xue, ZHANG Li

(Collage of Science,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Aiming at rapid measurement of four chloroplast pigment of plant leaf,a rapid measuring instrument is designed based on photoelectric nondestructive technique and near infrared(IR) spectroscopy.The instrument uses ATmega 128A microprocessor as core,use 8 LED array and rotary measuring mode and use OPT101 photoelectric sensor for photoelectric conversion and send detecting result to microprocessor for processing and preservation,this instrument can measure four kinds of chloroplast pigment that is chlorophyll a,chlorophyll b,lutein and carotenoids.Experimental results illustrate that measurement results of the instrument and UniSpec-SC Spectral Analysis System spectrometer are consistent,measurement value can accurately characterize contents of the four kinds of pigments with advantages of convenient to carry,simple structure and high reliability of measurement results,and it has certain practical value for agriculture and forestry research.

infrared(IR); spectral technology; chloroplast pigment；photoelectric sensor；LED array

10.13873/J.1000—9787(2015)01—0084—04

2014—05—09

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(YX2011—15)

TH 79

A

1000—9787(2015)01—0084—04

劉 姣(1986-)，女，湖北黃岡人，碩士，研究方向?yàn)樯镫妼W(xué)與傳感器。