黃林芳，梁　迪，莫文秀，周　晨，李　菁，張　烜，廖湘平，鄭文潔

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，風(fēng)濕免疫病學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種原因不明的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為慢性、對(duì)稱(chēng)性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎，影響關(guān)節(jié)滑膜功能，導(dǎo)致關(guān)節(jié)進(jìn)展性的破壞、疼痛及功能障礙。其致病機(jī)制涉及多種免疫細(xì)胞，越來(lái)越多的研究證明，B細(xì)胞在RA發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[1]。研究顯示，RA外周循環(huán)及滑膜等組織中定位的B細(xì)胞可通過(guò)參與RA自身抗體的產(chǎn)生[2]、作為抗原呈遞細(xì)胞活化T細(xì)胞[3-4]、分泌炎性細(xì)胞因子[5]等參與RA的炎性反應(yīng)和骨破壞。抑制性受體FcγR IIb(Fc gamma receptor IIb)是在B細(xì)胞表面表達(dá)的抑制性受體，能反饋性抑制B細(xì)胞受體(B cell receptor，BCR)識(shí)別抗原產(chǎn)生的活化信號(hào)，在防止B細(xì)胞過(guò)度激活、維持體液免疫耐受中起重要作用[6-7]。其在單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的活化方面也起著重要作用[8]。國(guó)外研究表明，F(xiàn)cγR IIb表達(dá)異常和基因多肽性與自身免疫性疾病發(fā)病、易感性和炎性反應(yīng)的強(qiáng)度密切相關(guān)[7]。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)FcγR IIb的研究較少，相關(guān)研究主要針對(duì)原發(fā)性干燥綜合征[9]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[10-11]等。本研究探討RA患者外周血B細(xì)胞表面FcγR IIb的表達(dá)及臨床意義。

對(duì)象和方法

病例選擇

2014年10月至2015年8月北京協(xié)和醫(yī)院就診的RA患者，診斷均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)診斷或歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟與美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)聯(lián)合制定的2010年成人RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。入組前6個(gè)月未用激素及免疫抑制劑治療。排除感染、腫瘤及其他自身免疫性疾病。健康對(duì)照來(lái)自年齡、性別匹配的健康志愿者，無(wú)風(fēng)濕病史和風(fēng)濕病家族史，并排除惡性腫瘤或其他慢性、活動(dòng)性病毒感染等。本研究得到北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者及健康對(duì)照者均簽署了知情同意書(shū)。

資料收集和指標(biāo)判斷

收集患者的病程、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、類(lèi)風(fēng)濕因子、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(抗cyclic citrullinated peptide抗體，抗CCP抗體)、血清IgG、IgM、IgA水平等臨床信息。疾病活動(dòng)度采用病情活動(dòng)度評(píng)分(disease activity score 28，DAS28)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，DAS28≤2.6定義為低度活動(dòng)期，3.25.1為高度活動(dòng)期[12]。

主要試劑與儀器

流式細(xì)胞儀檢測(cè)所用單克隆抗體；異藻藍(lán)蛋白(APC)-CD19、葉綠素蛋白偶聯(lián)物(PerCP-Cy5.5)-CD27、藻紅蛋白(PE)-CD32，皆購(gòu)于美國(guó)BD公司；人全血細(xì)胞裂紅液購(gòu)自美國(guó)BD公司；FACSAriaⅡ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本處理：采集肝素鈉抗凝外周血1 ml，加入裂紅液室溫裂解10 min，1 200 r/min，離心6 min，棄上清，加入磷酸鹽緩沖液，再離心1次終止裂紅反應(yīng)，磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

B細(xì)胞亞群表面FcγR IIb檢測(cè)：磷酸鹽緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/100 μl，加入CD19-APC、CD27-PerCP-Cy5.5、CD32-PE，對(duì)照管加入相應(yīng)的同型對(duì)照。4℃冰箱避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌，加1%甲醛固定液固定細(xì)胞，流式上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)前向角FSC(forward scatter)和側(cè)向角SSC(side scatter)參數(shù)在全血細(xì)胞中圈定淋巴細(xì)胞門(mén)，后根據(jù)CD19+圈選B細(xì)胞，再用CD19、CD27將B細(xì)胞分成以下3個(gè)亞群，初始B細(xì)胞(naive B cell，CD19+CD27-)，記憶B細(xì)胞(memory B cell，CD19+CD27+)，漿母細(xì)胞(plasmablasts，CD19+CD27high)。檢測(cè)B細(xì)胞各亞群表面FcγR IIb的陽(yáng)性細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。流式細(xì)胞儀分析應(yīng)用flowjo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。經(jīng)過(guò)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)為正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)表示。所有正態(tài)分布、方差齊數(shù)據(jù)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

人口統(tǒng)計(jì)學(xué)及臨床特點(diǎn)

本研究共納入初治RA患者20例，其中男3例，女17例，平均(45.75±11.34)歲；病程為2個(gè)月～20年，中位數(shù)為5年；入組時(shí)DAS28為1.46～7.47分，平均為(5.25±1.95)分，其中低度活動(dòng)者4例，中度活動(dòng)者4例，高度活動(dòng)者12例。健康志愿者共15名，其中男3名，女12名；平均年齡(40.47±11.87)歲。各組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

外周血B細(xì)胞亞群

20例RA患者CD19+CD27-初始B細(xì)胞占CD19+B細(xì)胞的百分率為(78.11±9.00)%，顯著高于健康對(duì)照組(64.24±13.24)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.691，P<0.05)。RA患者CD19+CD27+記憶性B細(xì)胞占CD19+B細(xì)胞的(18.30±8.94)%，顯著低于健康對(duì)照組的(32.31±13.67)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.665，P=0.001)。RA患者與健康對(duì)照組漿母細(xì)胞占B細(xì)胞的百分率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

B細(xì)胞亞群FcγR IIb表達(dá)差異

20例RA患者外周血CD19+CD27+記憶性B細(xì)胞表面FcγR IIb的MFI[(7 571.95±4 494.53)%]顯著低于健康對(duì)照組[(13 304.87±6 568.19)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.068，P=0.004)；初始B細(xì)胞CD19+CD27-、漿母細(xì)胞CD19+CD27high表面FcγR IIb的MFI與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖1類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組與健康對(duì)照組外周血B細(xì)胞亞群比較

Fig1Comparison of peripheral B cell subgroup between the rheumatoid arthritis and healthy controls

A：根據(jù)CD19、CD27將B細(xì)胞分成3個(gè)亞群，即初始B細(xì)胞(CD19+CD27-)、記憶性B細(xì)胞(CD19+CD27+)、漿母細(xì)胞(CD19+CD27high)；B：初始B細(xì)胞比較；C：記憶性B細(xì)胞比較；D：漿母細(xì)胞的比較；APC：異藻藍(lán)蛋白；PreCP-Cy 5.5：葉綠素蛋白偶聯(lián)物；HC：健康對(duì)照組；RA：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組；**P<0.01

圖2類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康對(duì)照者記憶性B細(xì)胞表面FcγR IIb表達(dá)比較

Fig2Comparison of expression of FcγR IIb on surface of memory B cell between the rheumatoid arthritis and healthy controls

FcγR IIb比較采用平均熒光強(qiáng)度；A：初始B細(xì)胞；B：記憶B細(xì)胞；C：漿母細(xì)胞；MFI：平均熒光強(qiáng)度；HC：健康對(duì)照組；RA：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組；**P<0.01

外周血記憶性B細(xì)胞FcγRIIb表達(dá)與疾病活動(dòng)相關(guān)性分析

RA患者IgG分泌水平與CD19+CD27+記憶性B細(xì)胞表面FcγR IIb的MFI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.732，P=0.007)，而與IgM、IgA的分泌無(wú)明顯相關(guān)性。RA患者ESR、CRP、DAS28、類(lèi)風(fēng)濕因子、抗CCP的水平與CD19+CD27+記憶B細(xì)胞表面FcγR IIb的MFI無(wú)明顯相關(guān)性(圖3)。

討　　論

FcγR IIb是一類(lèi)位于染色體1q23上、相對(duì)分子質(zhì)量約為40 000的跨膜糖蛋白[13]，是唯一的抑制性受體，主要表達(dá)于B細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中也有表達(dá)，而在T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表達(dá)[6]。FcγR IIb可介導(dǎo)對(duì)多種免疫細(xì)胞的負(fù)反饋調(diào)節(jié)反應(yīng)，其可通過(guò)依賴(lài)或不依賴(lài)胞漿區(qū)免疫受體酪氨酸抑制基序的方式起到抑制細(xì)胞激活的作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、抗體的分泌、淋巴因子的釋放等多種生物學(xué)效應(yīng)[5]。FcγR IIb表達(dá)異常與多種自身免疫病發(fā)病、易感性和炎性反應(yīng)的強(qiáng)度密切相關(guān)，如FcγR IIb敲除的C57BL/6小鼠會(huì)產(chǎn)生自身抗體及出現(xiàn)免疫復(fù)合物介導(dǎo)的狼瘡樣自身免疫病的表型[14]；系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE和PSS患者記憶性B細(xì)胞和漿細(xì)胞表面FcγR IIb的表達(dá)下降，并與病情活動(dòng)相關(guān)[8-13]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者純合子FcγR IIb-I232T突變體的原代B細(xì)胞，不能阻止BCR與CD19的突觸共定位，導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)分子對(duì)PI3K的異常調(diào)節(jié)，促使了B淋巴細(xì)胞的異常活化[15]。

對(duì)RA的研究顯示，F(xiàn)cγR IIb表達(dá)缺失的小鼠更容易誘導(dǎo)出膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型[16]。且日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)在一種129種系來(lái)源的位于sle16位點(diǎn)遠(yuǎn)端攜帶FcγR IIb基因無(wú)效突變的C57BL/6小鼠將自發(fā)產(chǎn)生RA的一些臨床關(guān)節(jié)炎癥狀，如滑膜的增生及嚴(yán)重的多發(fā)關(guān)節(jié)的骨及軟骨的破壞[17]。臨床研究報(bào)道FcγR IIb啟動(dòng)子及跨膜區(qū)的等位基因變異與RA存在一定關(guān)系，并且與RA患者抗CCP抗體水平及血清IL-6等細(xì)胞因子水平相關(guān)[18]。RA患者B細(xì)胞表面該受體表達(dá)較健康對(duì)照顯著下降[19]。另有研究顯示，F(xiàn)cγR IIb在RA記憶性B細(xì)胞及漿細(xì)胞均顯著下降，且與高滴度抗MCV抗體具有相關(guān)性[20]。本研究首次在國(guó)內(nèi)研究了初治RA患者外周血B細(xì)胞分布及其FcγR IIb的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者外周血記憶性B細(xì)胞占總B細(xì)胞的百分率低于健康對(duì)照，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RA患者外周血記憶性B細(xì)胞FcγR IIb的表達(dá)亦顯著下降，與國(guó)外報(bào)道一致。

圖3類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者記憶性B細(xì)胞表面FcγR IIb表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

Fig3Relationship of expression of FcγR IIb on surface of memory B cell in the patients with rheumatoid arthritis and clinical index

當(dāng)免疫復(fù)合物與BCR共交聯(lián)，通過(guò)BCR下游Lyn激酶對(duì)免疫受體酪氨酸抑制基序的磷酸化，促使FcγR IIb受體活化并募集磷酸酶SHIP1及SHIP2，進(jìn)而對(duì)BCR的下游信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用，阻斷鈣信號(hào)通路，防止B細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的自身抗體[21-22]。FcγR IIb還可通過(guò)抑制B細(xì)胞類(lèi)別轉(zhuǎn)換及分化為漿細(xì)胞而抑制抗體分泌[23]。本結(jié)果顯示，RA患者外周血中記憶性B細(xì)胞表面的FcγR IIb表達(dá)水平顯著下降，并與血清IgG水平呈負(fù)相關(guān)，提示FcγR IIb可能在RA的體液免疫中發(fā)揮了一定的作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，XmAb5871是針對(duì)FcγR IIb的靶向治療藥物，通過(guò)交聯(lián)B細(xì)胞表面BCR及FcγR IIb，以達(dá)到抑制B細(xì)胞異?；罨肮δ艿淖饔?，通過(guò)利用RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行XmAb5871刺激體內(nèi)及體外試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可以抑制B細(xì)胞產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)，提示其可能成為抑制RA自身反應(yīng)性B細(xì)胞活性的新治療策略[24]。

綜上所述，RA患者外周血記憶性B細(xì)胞占總B細(xì)胞的百分率顯著下降且其FcγR IIb表達(dá)水平顯著下降，并與血清IgG水平呈負(fù)相關(guān)，提示FcγR IIb可能在RA的體液免疫中發(fā)揮了一定的作用。進(jìn)一步對(duì)其功能的研究有助于更好地揭示RA發(fā)病機(jī)制，同時(shí)為尋找治療新靶點(diǎn)提供新線(xiàn)索。

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