李雙石等

摘要：酵母泥是葡萄酒釀造的主要副產(chǎn)物之一，廢酵母泥中富含谷胱甘肽等生物活性物質(zhì)。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)葡萄酒廢酵母中的谷胱甘肽進(jìn)行乙醇提取法工藝優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件為料液比1∶10.0（m∶V）、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、浸提時(shí)間45 min和浸提溫度50 ℃，在此條件下谷胱甘肽的得率可高達(dá)22.1%。

關(guān)鍵詞：葡萄酒廢酵母；谷胱甘肽；乙醇提取法；工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）03-0658-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.038

Optimization of Extracting Glutathione from Waste Wine Yeast with Ethanol

LI Shuang-shi， ZHANG Hu-cheng， WANG Bo-wei， LAN Rong， LI Bo

（College of Bioengineering， Beijing Electronic Science and Technology Vocational College， Beijing 100029， China）

Abstract： Waste wine yeast enriched in glutathione is one of the main byproducts of industrial wine production. Single factor and orthogonal array design methods were used to optimize the extraction of glutathione from waste wine yeast with ethanol. The results showed that the optimal extraction conditions for obtaining the highest amounts of glutathione were the ratio of raw materials to solution of 1∶10.0（m∶V）， the ethanol volume fraction of 35%， the extraction time of 45 min and the extraction temperature at 50 ℃. Under these conditions， the yield of total glutathione from waste wine yeast was 22.1%.

Key words： waste wine yeast； glutathione； ethanol extraction； process optimization

葡萄酒廢酵母是葡萄酒釀造的主要副產(chǎn)物之一，其排放量占葡萄酒產(chǎn)量的4%～5%[1]。葡萄酒酵母泥富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將其直接排放，不僅會(huì)造成排水的生物耗氧量負(fù)荷，而且也會(huì)造成很大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，葡萄酒廢酵母的高效再利用引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成，是一種同時(shí)具有γ-谷氨?；蛶€基的生物活性三肽化合物。GSH具有多種生理功能，如作為抗氧化劑，可保護(hù)酶和其他蛋白質(zhì)的巰基免受氧化，對(duì)部分外源毒性物質(zhì)具有解毒作用，可治療肝損傷、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等。因此，GSH在臨床醫(yī)學(xué)、食品添加劑和化妝品等行業(yè)的需求不斷增加，具有廣闊的市場(chǎng)前景[2]。谷胱甘肽在自然界中廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞內(nèi)，其中以酵母、小麥胚芽和動(dòng)物肝臟中含量較為豐富[2]。

目前，關(guān)于啤酒廢酵母[3-5]、面包酵母[6，7]和玉米胚[8，9]的谷胱甘肽提取工藝研究較多，但利用葡萄酒廢酵母提取谷胱甘肽的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。劉超等[7]分別采用熱水、乙醇、鹽酸提取面包酵母中的GSH，不同提取方法結(jié)果表明，乙醇提取法得到的GSH提取率最高。舒嬡等[4]采用熱水和乙醇提取啤酒酵母中的GSH，試驗(yàn)結(jié)果表明乙醇提取法雖提取時(shí)間較長(zhǎng)，但可大大縮短離心和濃縮時(shí)間，并且GSH 損失少， 雜質(zhì)含量較低。因此，本研究以葡萄酒廢酵母為原料，采用乙醇提取法制備GSH，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為葡萄酒廢酵母資源的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葡萄酒廢酵母泥：北京電子科技職業(yè)學(xué)院葡萄酒中試生產(chǎn)得到，采自2013年11月。

還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）：美國(guó)Sigma公司。

TDZ4A-WS型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AR5120型天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；UV-1800PC型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄酒廢棄酵母GSH醇法提取 將葡萄酒泥與去離子水以1∶1混合（體積比），用60目篩篩分，4 000 r/min離心20 min。重復(fù)上述步驟，直至所得沉淀為白色，上清液無(wú)色透明為止，收集沉淀，60 ℃鼓風(fēng)干燥處理，磨粉。精確稱取1.000 0 g葡萄酒廢酵母放入三角瓶中，加入一定量一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在一定溫度下水浴處理一定時(shí)間，冷卻至室溫，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，得到GSH浸提液。

1.2.2 GSH含量的測(cè)定 GSH含量測(cè)定采用DTNB法[10]。GSH和DTNB反應(yīng)生成黃色的5-硫代-2硝基苯甲酸，該物質(zhì)在pH 8.0、412 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支比色管，分別加入GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 mg/L） 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，補(bǔ)去離子水至0.5 mL，再加入pH 8.0的Tris-HCl緩沖液1.5 mL和3%甲醛溶液0.5 mL，混勻反應(yīng)2 min，然后加入DTNB分析液2.5 mL，置于25 ℃水浴反應(yīng)5 min后，412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，GSH濃度C為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

浸提液中GSH含量測(cè)定：用0.5 mL GSH浸提液代替GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液和水的混合物，用同樣的顯色方法測(cè)定浸提液中GSH含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別對(duì)影響GSH乙醇提取工藝的主要因素料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間和浸提溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)葡萄酒廢酵母GSH提取率的影響。

1）料液比對(duì)GSH提取率的影響。稱取1.000 0 g葡萄酒廢酵母5份，分別加入40%乙醇溶液8、9、10、11、12 mL（m∶V，下同），于50 ℃水浴攪拌90 min，冷卻至室溫，離心，取上清，檢測(cè)GSH濃度，計(jì)算GSH提取率。

酵母谷胱甘肽提取率=CVn/m×100%

式中，C為粗提液中谷胱甘肽濃度，V為粗提液體積，n為粗提液稀釋倍數(shù)，m為葡萄酒廢酵母干粉質(zhì)量。

2）乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)GSH提取率的影響。稱取1.000 0 g酵母5份，分別加入10 mL 20%、30%、40%、50%、60%乙醇溶液，于50 ℃水浴攪拌90 min，冷卻至室溫，離心，取上清液，檢測(cè)GSH含量，并計(jì)算GSH提取率。

3）浸提時(shí)間對(duì)GSH提取率的影響。稱取1.000 0 g酵母5份，分別添加40%乙醇溶液10 mL，于50 ℃水浴攪拌30、50、70、90和110 min，冷卻至室溫，離心后檢測(cè)上清液中GSH含量，計(jì)算GSH提取率。

4）浸提溫度對(duì)GSH提取率的影響。稱取1.000 0 g酵母5份，分別添加40%乙醇溶液10 mL，于30、40、50、60、70 ℃下水浴攪拌5 h，冷卻至室溫，離心，檢測(cè)上清液中GSH含量，計(jì)算GSH提取率。

1.2.4 正交試驗(yàn)條件優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定葡萄酒廢酵母多糖提取正交試驗(yàn)的因素和水平，如表1所示。采用4因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用DTNB法測(cè)定浸提液中GSH含量，得到GSH濃度C與吸光度A的回歸方程為A=0.003 5C-0.004 1（R2=0.996 5），標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)葡萄酒廢酵母GSH提取率的影響 由圖2可知，隨著料液比的增加，葡萄酒廢酵母GSH浸提液中谷胱甘肽含量先緩慢增加，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)谷胱甘肽提取率達(dá)到最大值，隨后又略有降低。這主要是由于當(dāng)乙醇溶液用量不足時(shí)，酵母細(xì)胞壁沒(méi)有充分破碎，導(dǎo)致GSH抽提不完全；但過(guò)量的乙醇溶液又容易造成GSH氧化，導(dǎo)致GSH提取率下降。因而，料液比初步確定采用1∶10。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄酒廢酵母GSH提取率的影響 乙醇能增強(qiáng)酵母細(xì)胞膜類脂的流動(dòng)性，可提高細(xì)胞的通透性，促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)釋放。由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于30%時(shí)，葡萄酒廢酵母GSH提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加明顯升高。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于30%時(shí)，GSH提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加略有下降，這是由于GSH是一種易溶于水和稀醇，微溶于醇的活性肽[7]，乙醇的體積分?jǐn)?shù)較大時(shí)反而不利于GSH的提取。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)初步確定為30%。

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)葡萄酒廢酵母GSH提取率的影響 由圖4可知，浸提時(shí)間在50 min時(shí)，葡萄酒廢酵母GSH提取率最大；超過(guò)50 min后，葡萄酒廢酵母GSH提取率呈緩慢的下降趨勢(shì)，這可能是由于GSH在空氣中受到氧化不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致含量下降。因此，可初步確定谷胱甘肽浸提時(shí)間為50 min。

2.2.4 浸提溫度對(duì)葡萄酒廢酵母GSH提取率的影響 由圖5可知，隨著浸提溫度的升高，葡萄酒廢酵母GSH提取率呈先升后降的趨勢(shì)，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值。這是由于浸提溫度對(duì)GSH穩(wěn)定性有較大影響，GSH的氧化速度與溫度呈負(fù)相關(guān)[7]，高溫可破壞GSH的活性；但浸提溫度如果過(guò)低，也將阻礙乙醇與酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的相互作用，不利于GSH溶出。因此，初步確定50 ℃為葡萄酒廢酵母GSH的浸提溫度。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知，用乙醇提取法制備葡萄酒廢酵母中谷胱甘肽的最佳工藝條件為料液比1∶10.0、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、浸提時(shí)間45 min、浸提溫度50 ℃，此條件下谷胱甘肽的提取率為22.1%。

從表2的極差分析可知，各因素對(duì)谷胱甘肽提取的影響程度依次為C、A、D、B，即浸提時(shí)間對(duì)谷胱甘肽提取率的影響最大，其次為浸提溫度和料液比，而乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最小。

3 結(jié)論

葡萄酒廢酵母中含有豐富的活性物質(zhì)，谷胱甘肽為其中的一種活性多肽。本試驗(yàn)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)葡萄酒廢酵母谷胱甘肽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件為料液比1∶10.0、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、浸提時(shí)間45 min、浸提溫度50 ℃，在此條件下谷胱甘肽的提取率可達(dá)22.1%。邵偉等[3]、凌秀梅等[5]從啤酒廢酵母中提取GSH，GSH提取率較高，分別為23.37%和29%以上，這與原料、GSH檢測(cè)方法不同有關(guān)。乙醇提取法是一種較溫和的提取方法，且具有工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、乙醇可回收再利用等特點(diǎn)，因此具有一定的應(yīng)用前景。

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