何　景，程　楠，許文濤，*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

食品微生物新型快速篩查技術(shù)研究進(jìn)展

何景1，2，程楠1，許文濤1，2，*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

隨著食品微生物安全事件的頻發(fā)，食品微生物的檢測(cè) 方法要求具有快速、靈敏且準(zhǔn)確的特點(diǎn)。目前，市場(chǎng)上的食品微生物快速篩查產(chǎn)品多種多樣，但產(chǎn)品 性能參差不齊。本文從食品微生物檢測(cè)的前處理、增菌、富集、分離和檢測(cè)等環(huán)節(jié)對(duì)國(guó)內(nèi)外已被廣泛認(rèn)可且商業(yè)化的微生物快速篩查技術(shù)進(jìn)行綜述，為相關(guān)研究和產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供全面的信息。最后對(duì)國(guó)內(nèi)外新型微生物快速 篩查技術(shù)進(jìn)行展望。

食品安全；食品致病微生物；快速篩查技術(shù)

食品是微生物生長(zhǎng)的良好基質(zhì)，在種植、加工、流通和消費(fèi)等環(huán)節(jié)都可能存在微生物污染問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國(guó)每年有31 種致病菌引起食源性疾病940萬(wàn) 例和1 351 人死亡［1］；在發(fā)展中國(guó)家，腹瀉疾病頻發(fā)，每年在全世界范圍內(nèi)有150萬(wàn) 兒童死亡［2］。除此以外，食源性疾病的致病因子的數(shù)量也在逐年膨脹，如20世紀(jì)90年代出現(xiàn)的彎曲桿菌，現(xiàn)在已經(jīng)是引起腹瀉的重要致病因子。所以食品微生物的監(jiān)控極其重要，應(yīng)貫穿從生產(chǎn)到消費(fèi)的全過(guò)程，檢測(cè)產(chǎn)品應(yīng)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、低廉等特點(diǎn)。只有這樣，相關(guān)監(jiān)管部門(mén)或企業(yè)才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，并采取措施以阻礙微生物快速傳播和病情蔓延，保證民眾的身體健康。

1　國(guó)內(nèi)外食品微生物快速篩查技術(shù)研究背景

食品微生物是指與食品有關(guān)的微生物的總稱(chēng)，包括生產(chǎn)型食品微生物、引起食物變質(zhì)微生物和食源性病原微生物。食品微生物檢測(cè)通常包括兩種類(lèi)型的檢測(cè)項(xiàng)目：指示菌和致病菌。指示菌包括菌落總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌和霉菌酵母等，通常作為判定樣品被污染程度的標(biāo)志和觀(guān)察樣品中細(xì)菌的性質(zhì)和繁殖動(dòng)態(tài)。致病菌包括副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、臘樣芽孢桿菌、耐熱芽孢桿菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌等，此指標(biāo)在食品中不得檢出［3］。國(guó)內(nèi)外食品微生物檢測(cè)體系包括有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB）、商檢行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢（SN）、國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）、美國(guó)食品藥品監(jiān)督局（U.S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）、美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)（Association of Official Agricultural Chemists，AOAC）、加拿大健康保護(hù)部（Canada Health Protection Branch，CHPB）等檢測(cè)體系。

傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)技術(shù)有平板傾注法、平板涂布法、最大或然數(shù)（most probable number，MPN）法和螺旋接種法，這些方法可以定量檢測(cè)食品微生物，但其檢測(cè)前期都需要預(yù)增菌，后期需生化鑒定、血清學(xué)分 析 等鑒定實(shí)驗(yàn)，鑒定時(shí)間需要3～7 d且需要專(zhuān)業(yè)人員操作，容易造成假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果等缺點(diǎn)。所以為了適應(yīng)世界范圍內(nèi)微生物監(jiān)測(cè)的需求，同時(shí)，微生物快速篩查技術(shù)及其產(chǎn)品的研發(fā)在食品微生物監(jiān)控中發(fā)揮著不容忽視的重要作用。美國(guó)、歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)微生物檢測(cè)工作的研究開(kāi)始比較早且現(xiàn)已非常成熟，商品化的產(chǎn)品也多種多樣，檢測(cè)的很多工作也實(shí)現(xiàn)了儀器化，從而大大節(jié)約了人力成本且避免了人為因素導(dǎo)致的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，滿(mǎn)足了當(dāng)今社會(huì)的要求。我國(guó)由于開(kāi)展這一方面的工作較晚，技術(shù)手段不成熟，商品化微生物檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)品及設(shè)備單一且嚴(yán)重依賴(lài)進(jìn)口，為了更好地了解國(guó)內(nèi)外食品微生 物快速篩查技術(shù)的現(xiàn)狀，本文對(duì)國(guó)內(nèi)外已得到廣泛認(rèn)可的新型食品微生物快速篩查技術(shù)進(jìn)行綜述。

2　食品微生物快速篩查技術(shù)

食品微生物檢測(cè)通常包括采樣前處理、前增菌、菌體特異性分離、濃縮和后期鑒定等步驟。

2.1采樣前處理技術(shù)

2.1.1疏水網(wǎng)格濾膜技術(shù)

疏水網(wǎng)格濾膜技術(shù)是在最初的膜過(guò)濾技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種技術(shù)，現(xiàn)已成為一個(gè)全球公認(rèn)的有效方法［4］。該技術(shù)是利用微生物細(xì)胞表面具有不同程度的疏水特性而制成的有1 600 個(gè)疏水網(wǎng)格，孔徑為0.45 μm的疏水性濾膜，并由過(guò)濾漏斗和真空系統(tǒng)組成。當(dāng)液體樣品通過(guò)濾膜時(shí)，微生物就會(huì)被截留在膜的表面，然后將濾膜放在裝有培養(yǎng)基的平皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能穿過(guò)濾膜，幫助微生物在膜表面生長(zhǎng)并形成菌落。疏水網(wǎng)格濾膜技術(shù)最主要優(yōu)勢(shì)是可以對(duì)大量的樣品進(jìn)行濃縮，尤其適用于許多工業(yè)或環(huán)境微生物的分析，在此類(lèi)分析中樣品量常需要100 mL以上。此外，疏水網(wǎng)格濾膜技術(shù)還具有準(zhǔn)備時(shí)間短，能夠?yàn)V除抑制性或殺生物的試劑等優(yōu)點(diǎn)。疏水網(wǎng)格濾膜技術(shù)已經(jīng)被多個(gè)國(guó)家或組織認(rèn)可，如SN、AOAC和CHPB等。此類(lèi)技術(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品有美國(guó)Neogen公司的ISO-GRID/NEO-GRID、美國(guó)Pall公司的MicroFunnel一次性過(guò)濾漏斗等。但在我國(guó)，疏水網(wǎng)格濾膜技術(shù)在檢測(cè)方面的研究幾乎處于空白階段［5］。

2.1.2免疫磁珠分離技術(shù)

免疫磁珠是運(yùn)用核-殼的合成方法合成的含有四氧化三鐵超順磁性的材料-微磁珠，磁珠表面覆蓋有穩(wěn)定性好、能進(jìn)行后期標(biāo)記的物質(zhì)，利用這些物質(zhì)表面的功能基團(tuán)如氨基、羧基、巰基等進(jìn)行抗體的共價(jià)或者非共價(jià)偶聯(lián)，制成帶磁性的免疫抗體磁珠。微生物免疫磁珠可以選擇性的從環(huán)境、臨床和食品中富集濃縮相應(yīng)的微生物病原體。此技術(shù)具有靈敏、快速等特點(diǎn)，已得到廣泛認(rèn)可，獲得SN、ISO、AOAC、FDA、CHPB的認(rèn)可。如美國(guó)Dynal公司的Dynabeads磁珠和英國(guó)Matrix公司的免疫磁株，可以檢測(cè)沙門(mén)氏菌、李斯特氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、葡萄球菌腸毒素、大腸埃希氏菌O157、彎曲菌、副結(jié)核分枝桿菌和軍團(tuán)菌等。

免疫磁珠分離技術(shù)可以從大量樣品中迅速富集微生物，經(jīng)常作為前處理步驟為其他篩選技術(shù)提供高濃度的微生物樣品，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、DNA探針、熒光顯微鏡觀(guān)察法和顯色培養(yǎng)基法等。微生物免疫磁珠分選技術(shù)的操作過(guò)程具有高度重復(fù)且簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，只有加液、吸液和磁分離等步驟，所有其操作過(guò)程儀器化也是發(fā)展趨勢(shì)［6］，現(xiàn)在市場(chǎng)上受到廣泛認(rèn)可的該類(lèi)儀器有美國(guó)Invitrogen公司的BeadRrtriever全自動(dòng)免疫磁珠分選系統(tǒng)，只需按一個(gè)按鈕，40 min內(nèi)即可得到預(yù)期的高濃度樣品。

2.2快速增菌技術(shù)

傳統(tǒng)增菌技術(shù)需要配制培養(yǎng)基、準(zhǔn)備無(wú)菌平皿、倒平板等前期準(zhǔn)備工作，其操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，且結(jié)果通過(guò)目視計(jì)算菌落數(shù)，誤差比較大，人為因素不可忽略。而即用培養(yǎng)基技術(shù)則省掉了前期準(zhǔn)備工作，可以直接檢測(cè)樣品，從而節(jié)約了大量人力成本。目前，商業(yè)化的固定培養(yǎng)基技術(shù)主要有兩種：紙片法和即用平皿法。紙片法是指將顯色培養(yǎng)基固定于紙片上，上方再蓋一層帶有方格的透明薄膜，以方便計(jì)數(shù)。該法的關(guān)鍵技術(shù)及難點(diǎn)為顯色培養(yǎng)基和冷水可溶性凝膠的研究。顯色培養(yǎng)基決定了試紙法檢測(cè)的靈敏度、假陽(yáng)性和假陰性等重要檢測(cè)指標(biāo)；冷水可溶性凝膠決定樣品凝膠速度、菌落大小等指標(biāo)，直接影響菌落數(shù)的讀取和結(jié)果的判讀。即用平皿法是指用已倒有培養(yǎng)基的平皿，接種操作與傳統(tǒng)涂板、劃線(xiàn)法一樣。其優(yōu)點(diǎn)和紙片法一樣，即省掉了前期準(zhǔn)備工作，可以直接接種培養(yǎng)。此類(lèi)最權(quán)威的產(chǎn)品為3M Petrifilm試紙片，2009年正式被列為中國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，近幾年國(guó)內(nèi)也有相關(guān)產(chǎn)品，如綠洲生化微生物試紙片、陸橋Easy test系列產(chǎn)品和北京福德安微生物測(cè)試片，且已被許多研究被證明與傳統(tǒng)的MPN法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差別［7］。

2.3快速鑒定篩查技術(shù)

2.3.1分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

分子檢測(cè)技術(shù)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以高特異的鑒別菌種內(nèi)的差別，甚至菌株間的差別，但容易 導(dǎo)致較高的假陽(yáng)性率。該類(lèi)檢測(cè)技術(shù)都需要樣品先增菌再檢測(cè)，一般第2天出結(jié)果。分子檢測(cè)技術(shù)有普通PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因芯片技術(shù)、多重檢測(cè)技術(shù)和活菌鑒定技術(shù)等。

2.3.1.1分子標(biāo)識(shí)庫(kù)

分子標(biāo)識(shí)庫(kù)作為分子檢測(cè)技術(shù)的核心理論關(guān)鍵技術(shù)，也是知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核心內(nèi)容，決定檢測(cè)結(jié)果正確率、檢測(cè)效率等問(wèn)題，已經(jīng)經(jīng)過(guò)很多學(xué)者的系統(tǒng)研究。篩選的分子標(biāo)識(shí)必須滿(mǎn)足兩個(gè)條件：在種/屬/血清型內(nèi)要保守、在種/屬/血清型間要特異。分子標(biāo)識(shí)庫(kù)的建立需大量實(shí)驗(yàn)與分析工作，包括成百上千種標(biāo)準(zhǔn)菌株和和實(shí)際環(huán)境菌株的搜集、分子測(cè)序、生物信息學(xué)分析、引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證等，且由于微生物種類(lèi)繁多復(fù)雜，新微生物不斷涌現(xiàn)，使得微生物分子標(biāo)識(shí)庫(kù)的建立異常困難。目前微生物分子標(biāo)識(shí)庫(kù)可以分為三大類(lèi)：種屬水平基因、血清型基因和毒力基因。

細(xì)菌rRNA基因是最常用的微生物種屬水平鑒定的一種重要的分子標(biāo)識(shí)［8］，包括細(xì)菌的16S rRNA、23S rRNA和5S rRNA與真菌的18S rRNA、28S rRNA、5S rRNA和5.8S rRNA。因?yàn)閞RNA是所有微生物共有的，且由于功能保守而在進(jìn)化過(guò)程中保持了高度的保守性，所以可以作為通用引物的特異序列。但是對(duì)于親緣關(guān)系較近的種屬，單一利用細(xì)菌的16S rRNA、23S rRNA或者真菌的18S rRNA，并不能完全區(qū)分這些菌種。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列是指16S rRNA～23S rRNA基因間區(qū)，其沒(méi)有特定功能，進(jìn)化速率比16S rDNA快10多倍，其特異性更強(qiáng)，對(duì)于親緣關(guān)系較近的種屬的區(qū)分比16S rRNA和23S rRNA更具優(yōu)勢(shì)［9］。但I(xiàn)TS序列并不是萬(wàn)能的，因它不能對(duì)所有菌株進(jìn)行鑒別。

隨著大量病原細(xì)菌基因組信息及基因功能的不斷公布，一些核糖體外且在細(xì)菌的屬、種、型水平上 獨(dú)有或與其他種屬序列差異很大的基因被發(fā)現(xiàn)。毒力基因就是其中特異性相對(duì)更加保守的一種基因［10］，其編碼細(xì)菌致病性蛋白質(zhì)，位于病原菌染色體上特定區(qū)域——毒力島上。一般一個(gè)細(xì)菌含有多個(gè)毒力基因，如已發(fā)現(xiàn)的沙門(mén)菌毒力島大約有十幾個(gè)，即SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5等［11］。

細(xì)菌表面多糖抗原在宿主免疫系統(tǒng)長(zhǎng)期壓力下形成自然界中已知最突出的多樣性，其對(duì)應(yīng)的基因簇是細(xì)菌染色體上最具多樣性的區(qū)域，所以基于表面多糖抗原基因簇的分子標(biāo)識(shí)也是公認(rèn)的特異性分子標(biāo)識(shí)［12］，如變形桿菌的特異基因wzy［13］，大腸桿菌的高特異性基因O-抗原基因簇中的寡糖單位處理基因和糖基轉(zhuǎn)移酶［14］。

2.3.1.2實(shí)時(shí)定量技術(shù)

實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指向PCR體系中加入熒光基團(tuán)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR檢測(cè)體系中熒光信號(hào)而達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的PCR擴(kuò)增片段數(shù)量的目的，從而推斷出PCR體系中的初始目標(biāo)片段數(shù)量的定量技術(shù)［15］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可采用的熒光信號(hào)有很多種，主要分為兩類(lèi)：非特異性染料和特異探針標(biāo)記，其中非特異性染料常用的有SYBR GREEN I和SYBR GREEN II，特異探針標(biāo)記常用的有TaqMan探針、雜交探針和分子信標(biāo)探針等。由于熒光信號(hào)多種多樣，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)也可以通過(guò)設(shè)計(jì)采集不同的熒光信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)多重定量檢測(cè)。目前，商品化的熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)微生物的試劑盒有杜邦全自動(dòng)病原微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)。該檢測(cè)技術(shù)不僅是定量檢測(cè)微生物含量的常規(guī)且成熟的檢測(cè)法，也是常應(yīng)用于研究的常規(guī)技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上也發(fā)展出其他新型技術(shù)，如納米金Real-time PCR［16］、前置放大技術(shù)［17］等。

2.3.1.3等溫檢測(cè)技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是指可以在恒定的溫度下對(duì)特定核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，包括有鏈置換擴(kuò)增、切口酶恒溫核酸擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、賴(lài)解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增、依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等技術(shù)。目前，研究成熟并產(chǎn)品化的技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，如3M公司的分子檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)時(shí)間從普通PCR技術(shù)的1～3 h減少到15～60 min，靈敏度是普通PCR的100～1 000倍，且不需要昂貴儀器，操作簡(jiǎn)單，可滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。該技術(shù)是1998年，日本榮研化學(xué)株式會(huì)社獨(dú)自開(kāi)發(fā)的，與其相配套的便攜式儀器有濁度儀和熒光檢測(cè)系統(tǒng)等［18］。LAMP技術(shù)的高靈敏度導(dǎo)致了該技術(shù)容易造成假陰性結(jié)果的缺陷，所以后期出現(xiàn)很多去污染劑或其他設(shè)備的開(kāi)發(fā)，如杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司的恒溫?cái)U(kuò)增核酸試紙條檢測(cè)試劑盒，將分子擴(kuò)增、雜交技術(shù)和膠體金技術(shù)結(jié)合，使整個(gè)檢測(cè)過(guò)程處于封閉狀態(tài)下，防止假陽(yáng)性的結(jié)果［19］。

2.3.1.4多重PCR檢測(cè)技術(shù)

多重PCR檢測(cè)技術(shù)是指在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系加入兩對(duì)或多對(duì)引物，以擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)片段的PCR技術(shù)，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)對(duì)象或快速分型的目的。與普通PCR相比，多重PCR技術(shù)具有普通PC R的快速、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，同時(shí)節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間與成本，使檢測(cè)效率大大提高。該檢測(cè)技術(shù)需要克服的缺點(diǎn)是檢測(cè)體系復(fù)雜導(dǎo)致的檢測(cè)靈敏度下降和定量準(zhǔn)確性等問(wèn)題。目前也有針對(duì)這些問(wèn)題的研究，如通用引物多重PCR技術(shù)，由于特異引物只在前面幾輪PCR擴(kuò)增需要，后面大部分PCR擴(kuò)增只需單一的通用引物，所以大大降低了PCR擴(kuò)增的復(fù)雜性，提高了多重?cái)U(kuò)增的靈敏度與準(zhǔn)確性［20-22］。此類(lèi)技術(shù)產(chǎn)品有迪奧公司采用雙重PCR-熒光探針?lè)z測(cè)沙門(mén)氏菌（FAM通道）和志賀氏菌（JOE通道），可以同時(shí)快速定量檢測(cè)兩種致病微生物。

2.3.1.5活菌定量分子檢測(cè)技術(shù)

EMA-qPCR技術(shù)是利用光敏性EMA染料只能選擇性地結(jié)合細(xì)胞死亡后（細(xì)胞膜破裂）暴露的DNA分子，從而阻斷了DNA分子的PCR擴(kuò)增。暴露于強(qiáng)光下的EMA的疊氮基團(tuán)轉(zhuǎn)化為高活性氮自由基，并與結(jié)合位點(diǎn)附近的任意碳?xì)浠衔锓磻?yīng)形成穩(wěn)定的共價(jià)氮碳鍵，使DNA分子永久修飾。該技術(shù)由Nogva等［23］首次報(bào)告，并已有很多人研究，Shi Hui等［24-25］建立的EMA-qPCR精準(zhǔn)活菌定量技術(shù)被證明與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法沒(méi)有顯著性區(qū)別，檢測(cè)時(shí)間僅為1.5～3 h。

2.3.1.6可視基因芯片

可視芯片技術(shù)是一種新型基因芯片，與傳統(tǒng)基因芯片不同，它可以將特定的分子結(jié)合轉(zhuǎn)變成可以直接肉眼觀(guān)察到的信號(hào)。該技術(shù)采用生物素化標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上的探針進(jìn)行雜交，接著用辣根過(guò)氧化物酶抗體處理，此時(shí)結(jié)合了生物素標(biāo)記的雜交DNA鏈就會(huì)在辣根過(guò)氧化物酶抗體和3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）的作用下產(chǎn)生沉淀改變芯片的厚度，從而產(chǎn)生肉眼可辨的信號(hào)［26］。有研究者報(bào)道稱(chēng)該技術(shù)由Ostroff首次報(bào)道［27］，現(xiàn)已發(fā)展成一個(gè)高通量、靈敏且快速的檢測(cè)技術(shù)，但由于其發(fā)展比較慢，還存在一些缺點(diǎn)，如芯片穩(wěn)定性和檢測(cè)范圍等問(wèn)題［28］。

2.3.2免疫生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)技術(shù)是通過(guò)抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)的原理，再輔以放大技術(shù)來(lái)鑒別細(xì)菌。該方法具有高靈敏度和速度快等優(yōu)點(diǎn)，樣品經(jīng)增菌后可在數(shù)分鐘內(nèi)即可檢出。應(yīng)用此原理的方法有競(jìng)爭(zhēng)法和雙抗夾心法等，其中放大技術(shù)有酶法、熒光法和納米顆粒等。

2.3.2.1熒光酶標(biāo)免疫

該技術(shù)應(yīng)用免疫雙抗夾心法，將已知抗體固定于載體上，加入待測(cè)抗原，抗原與固相抗體結(jié)合，然后加入酶標(biāo)抗體，再與抗原結(jié)合?？贵w上的酶與酶底物反應(yīng)，釋放出帶熒光的產(chǎn)物，發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與抗原量成正比，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度進(jìn)行定性或定量分析。如4-甲基傘形酮磷酸酯在磷酸酶的催化作用下，生成具有熒光性的物質(zhì)——4-甲基傘形酮和磷酸鹽［29］。法國(guó)生物梅里埃公司的熒光酶標(biāo)分析儀就是建立在此原理上，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種微生物的檢測(cè)。綠色熒光蛋白是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的一種蛋白質(zhì)，當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)，該蛋白即可發(fā)射綠色熒光。當(dāng)綠色熒光蛋白和抗體或蛋白質(zhì)相結(jié)合，在紫外或藍(lán)光下即可定位抗體或蛋白質(zhì)［30］。

2.3.2.2免疫膠體金技術(shù)

膠體金是指具有顏色的粒子直徑在1～100 nm之間的金溶膠，顏色隨金溶膠粒子大小不同而變。膠體金在可見(jiàn)光范圍內(nèi)具有單一光的吸收峰，吸收峰的位置隨膠體金顆粒的變化而變化，膠體金顆粒越大，其吸收峰的波長(zhǎng)也越大。

膠體金免疫層析法即是將膠體金標(biāo)記、免疫反應(yīng)及色層分析法等方法結(jié)合為一體的一種固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)。相關(guān)研究［31-32］表明其自1971年被Faulk等創(chuàng)立以來(lái)，由于其具有方 便快速、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、不需要特殊儀器和試劑、肉眼可判讀結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。該法是以微孔膜為固相載體，如硝酸纖維膜，將已知的抗原或抗體固定在載體上，形成檢測(cè)限（T線(xiàn)）或質(zhì)控線(xiàn)（C線(xiàn)），當(dāng)樣品通過(guò)毛細(xì)管作用在微孔膜上移動(dòng)，與標(biāo)有抗體的膠體金反應(yīng)形成復(fù)合物，然后至檢測(cè)線(xiàn)時(shí)又發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，形成肉眼可見(jiàn)的紅色線(xiàn)條。膠體金免疫層析法包括有雙抗夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，其中競(jìng)爭(zhēng)法常用于檢測(cè)小分子抗原。如美國(guó)SDIX公司的微生物致病菌檢測(cè)條，符合AOAC、GB等相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2.3流式細(xì)胞技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段［33］，它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)微生物主要是基于單個(gè)細(xì)胞的熒光標(biāo)記技術(shù)，可對(duì)樣品中死活菌總數(shù)、活菌數(shù)或特定細(xì)菌（如酵母和霉菌）進(jìn)行定量檢測(cè)［34］。該檢測(cè)技術(shù)平均1 min即可得到檢測(cè)結(jié)果，無(wú)需培養(yǎng)和樣品制備，靈敏度可以達(dá)到1～100 CFU，但儀器投入較大，檢測(cè)成本相對(duì)較高。如美國(guó)FOSS公司的Bactoscan FC微生物檢測(cè)系統(tǒng)采用核酸熒光標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀，可檢測(cè)死活菌 總數(shù)；法國(guó)AES Chemunex公司采用的是活細(xì)胞熒光探針技術(shù)，活細(xì)胞經(jīng)標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀，檢測(cè)活細(xì)胞，與國(guó)標(biāo)的要求吻合。

2.3.3傳感器技術(shù)

傳感器是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，其突出特點(diǎn)是可以實(shí)時(shí)地、在線(xiàn)地檢測(cè)生物分子之間的相互作用。在微生物檢測(cè)中應(yīng)用的傳感器主要有電化學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器、氣體傳感器等。微生物的生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基的各種性質(zhì)發(fā)生變化，如電導(dǎo)率、pH值或CO2等。通過(guò)監(jiān)控這些指標(biāo)的變化，可以達(dá)到檢測(cè)樣品中微生物數(shù)量的目的。這些方法只要先用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比做出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，就可以達(dá)到快速定量檢測(cè)菌數(shù)的目的。

2.3.3.1電化學(xué)傳感器

微生物利用低電導(dǎo)率的大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多 肽及碳水化合物等）進(jìn)行新陳代謝，生成低分子帶電荷的分解物，使電導(dǎo)率發(fā)生變化，電信號(hào)經(jīng)放大后顯示并記錄電導(dǎo)率的變化。電化學(xué)技術(shù)的一般線(xiàn)性范圍是從102～107CFU/mL（g）［35］。此技術(shù)最關(guān)鍵是檢測(cè)成本便宜，且可以2～12 h內(nèi)出結(jié)果。此類(lèi)產(chǎn)品最為被廣泛應(yīng)用且認(rèn)可的為是奧地利Sy-lab公司的微生物自動(dòng)快速檢測(cè)系統(tǒng)BacTrac4300，檢測(cè)靈敏度為0.2～1個(gè)/mL（g）樣品，且沒(méi)有假陰性結(jié)果。

2.3.3.2光學(xué)傳感器

微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物使預(yù)加的指示劑顏色發(fā)生變化，并由光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)其顏色變化，記錄達(dá)到突變點(diǎn)的時(shí)間，達(dá)到檢測(cè)微生物數(shù)量的目的，可以在30～48 h內(nèi)高通量檢測(cè)大量樣品［36］。美國(guó)Foss公司的Microfoss微生物自動(dòng)檢測(cè)儀是利用在特定培養(yǎng)基培養(yǎng)樣品，微生物生長(zhǎng)使培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，產(chǎn)生的CO2改變CO2傳感器的顏色這一原理［37］。梅里埃的BacT/Alert微生物檢測(cè)儀和美國(guó)BioLumix公司的實(shí)時(shí)微生物快速熒光光電檢測(cè)儀使用光子探測(cè)器實(shí)時(shí)檢測(cè)CO2導(dǎo)致的培養(yǎng)瓶底部顏色變?yōu)樽凕S的CO2傳感器。利用的代謝產(chǎn)物有李斯特菌生長(zhǎng)產(chǎn)生秦皮甲素酶［38］，念珠菌屬的葡糖胺酶、副溶血弧菌的β-半乳糖苷酶和所有微生物都產(chǎn)生的氧化酶等。

此類(lèi)產(chǎn)品還有美國(guó)NHD公司的手持式大腸類(lèi)細(xì)菌快速檢測(cè)系統(tǒng)，其將含熒光的底物加入到選擇性培養(yǎng)基中，細(xì)菌的特異性酶水解底物后釋放出熒光，通過(guò)熒光檢測(cè)儀來(lái)確定樣品中微生物的量。此檢測(cè)方法將熒光底物、培養(yǎng)基組成和不同培養(yǎng)溫度三位一體來(lái)保證檢測(cè)指標(biāo)的特異性，最低檢測(cè)限為1 CFU/100 mL或1 MPN/100 mL，最快檢測(cè)時(shí)間為15 min。

2.3.3.3微熱量熱法

微熱量熱法是利用細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生熱量的原理。由于各種微生物的代謝產(chǎn)物熱效應(yīng)不同，因此可顯示出特異性的熱效應(yīng)曲線(xiàn)圖。熱效應(yīng)曲線(xiàn)圖的形成，是由于培養(yǎng)基含有多種成分，微生物則產(chǎn)生多種不同的代謝物，以此表現(xiàn)出的熱效應(yīng)為多個(gè)曲線(xiàn)峰［39］。微量熱技術(shù)是一項(xiàng)靈敏度高、測(cè)量準(zhǔn)確的熱分析技術(shù)，具有定量、實(shí)時(shí)、在線(xiàn)、動(dòng)態(tài)描述等特點(diǎn)，如美國(guó)TA公司的TAM III。

2.3.3.4放射測(cè)量法

利用細(xì)菌在代謝碳水化合物時(shí)產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性標(biāo)記引入葡萄糖或其他糖類(lèi)分子中。細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，糖被利用并放出標(biāo)記的CO2，將生成的放射性標(biāo)記CO2從培養(yǎng)裝置中導(dǎo)出或用化學(xué)法吸收后，利用專(zhuān)用的放射測(cè)量?jī)x來(lái)測(cè)定放射性CO2，如Bactec MGIT 960即可完成此檢測(cè)。放射量與菌數(shù)成正比。

2.3.4利用微生物生長(zhǎng)特征的新型技術(shù)

Biolog微生物鑒定系統(tǒng)利用微生物對(duì)不同碳源代謝率的差異的原理。針對(duì)每一類(lèi)微生物篩選95 種不同碳源，接種菌懸液后培養(yǎng)一定時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)微生物細(xì)胞在新陳代謝過(guò)程中利用不同碳源產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化以及由于微生物生長(zhǎng)造成的濁度差異，與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，即可得出最終鑒定結(jié)果［40］。MIT1000致病微生物快速鑒定系統(tǒng)采用600 nm激光照射微生物活體細(xì)胞，通過(guò)35 個(gè)光學(xué)檢測(cè)器全方位檢測(cè)反應(yīng)和透射光譜信號(hào)，信號(hào)經(jīng)過(guò)特殊算法合成一個(gè)光譜圖，每種微生物的特征譜是不同的，用各種標(biāo)準(zhǔn)菌株建立光譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定時(shí)系統(tǒng)只需分析10～50 個(gè)細(xì)胞的光譜圖，在10 min內(nèi)將檢測(cè)到圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，給出最可能的鑒定結(jié)果。其主要特點(diǎn)是：鑒定成本低，與其他產(chǎn)品相比，無(wú)需專(zhuān)用鑒定耗材；鑒定速度快，10 min出鑒定結(jié)果；數(shù)據(jù)庫(kù)正在不斷升級(jí)中，目前可鑒定26 種常見(jiàn)致病菌；已經(jīng)獲得AOAC權(quán)威認(rèn)可。ATP生物熒光法利用ATP普遍存在于所有活生物體內(nèi)的原理，采用ATP與熒光素酶復(fù)合物的生物發(fā)光反應(yīng)來(lái)測(cè)定ATP的存在與否。如美國(guó)NHD公司推出的ATP食品細(xì)菌快速檢測(cè)系統(tǒng)——Profi le-13560通過(guò)底部有篩孔的比色杯將非細(xì)菌細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞分離，這種比色杯細(xì)菌細(xì)胞過(guò)不去，之后用細(xì)菌細(xì)胞釋放液裂解細(xì)菌細(xì)胞，檢測(cè)釋放出的ATP量則為細(xì)菌的ATP量，從而得出細(xì)菌總數(shù)，該產(chǎn)品已經(jīng)被美軍采用［41］。ATP生物熒光法由于不好區(qū)別細(xì)菌、霉菌和酵母，且很多微生物休眠體，如芽孢和孢子，ATP活性極低，所以ATP生物熒光容易造成假陰性結(jié)果。

3　結(jié) 語(yǔ)

由于我國(guó)食品安全問(wèn)題具有長(zhǎng)期性和艱巨性等特點(diǎn)，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)是今后控制食品安全的主要手段之一，所以快速篩查技術(shù)將有良好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。過(guò)去幾十年間，微生物快速篩查技術(shù)經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)期的研發(fā)，發(fā)展了一批多種多樣的商品化微生物快速篩查產(chǎn)品，微生物檢測(cè)已進(jìn)入快速、靈敏且儀器化的階段。但是由于我國(guó)微生物快速篩查技術(shù)研究起步晚，發(fā)展滯后，相關(guān)技術(shù)不成熟，產(chǎn)品還嚴(yán)重依賴(lài)進(jìn)口。故而檢測(cè)部門(mén)的微生物檢測(cè)手段仍以傳統(tǒng)檢測(cè)手段為主，所以我國(guó)快速篩查技術(shù)急需快速研究與發(fā)展，盡快實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，開(kāi)發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品以應(yīng)對(duì)我國(guó)嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題。

微生物檢測(cè)包括前處理、增菌、富集、檢測(cè)等環(huán)節(jié)。為實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)食品微生物，每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)有相應(yīng)的篩查技術(shù)及產(chǎn)品。由于分子檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏、高特異、快速等特點(diǎn)，在近幾十年得到快速發(fā)展與應(yīng)用，但相關(guān)技術(shù)還應(yīng)向標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)品化方向發(fā)展，且開(kāi)發(fā)更適合實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查技術(shù)與設(shè)備。免疫技術(shù)以高特異、快速的特點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用，但由于微生物抗原種類(lèi)各異、抗體制備昂貴而滯后了該類(lèi)產(chǎn)品的發(fā)展，所以更低廉且特異性強(qiáng)的抗體制備技術(shù)還有待繼續(xù)發(fā)展，如重組抗體、適配體等。而其他快速篩查技術(shù)，如傳感器技術(shù)等，由于在我國(guó)研究發(fā)展緩慢，且這類(lèi)技術(shù)涉及材料科學(xué)、光學(xué)技術(shù)、微生物等學(xué)科，所以各類(lèi)學(xué)科技術(shù)的相互交叉與引進(jìn)也是我國(guó)科研工作者的研究重點(diǎn)。

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Development of New Rapid Screening Technologies for Microbes in Food

HE Jing1，2， CHENG Nan1， XU Wentao1，2，*
（1. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China；2. Beijing Laboratory of Food Quality and Safety， Beijing 100083， China）

With the frequent outbreak of food safety incidents caused by harmful microbes， rapid， sensitive and accurate methods are needed to detect microbes in food. Although， there are currently diverse types of rapid screening kits or equipment for food microorganisms available in the market， the performance is uneven. Rapid microbial screening technologies which are well recognized worldwide and commercialized are reviewed in this article with regard to sample pretreatment， and microbial enrichment， separation and detection， with the aim to provide comprehensive information for the research and development of related products. Meanwhile， the future trends of rapid screening technologies are proposed.

food safety； foodborne pathogenic microorganism； rapid screening technology

Q93.331

A

1002-6630（2015）13-0288-06

10.7506/spkx1002-6630-201513053

2014-08-18

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA101606）

何景（1986—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：nigu.1999@163.com

許文濤（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：xuwentao1111@sina.com