史本濤，蘇博興，方 冬，何 群，李學松，周利群*

(北京大學:1.第一醫(yī)院泌尿外科,2.泌尿外科研究所,3.第一醫(yī)院泌尿病理科,北京 100034)

·基礎研究·

KPNA2基因沉默和過表達對人膀胱癌細胞株5637增殖能力的影響

史本濤1,2，蘇博興1,2，方 冬1,2，何 群2,3，李學松1,2，周利群1,2*

(北京大學:1.第一醫(yī)院泌尿外科,2.泌尿外科研究所,3.第一醫(yī)院泌尿病理科,北京 100034)

目的 觀察KPNA2(karyopherin a2)基因沉默和過表達對人膀胱癌細胞株5637增殖能力的影響。方法 將KPNA2 siRNA干擾質粒和過表達質粒pcDNA3.1(+)-KPNA2用LipofectaminTM2000方法瞬時轉染膀胱癌細胞株5637，轉染后48 h，應用蛋白質印跡法檢測轉染細胞中KPNA2蛋白表達，CCK-8(cell counting kit-8)法檢測細胞增殖活性，通過生長曲線檢測KPNA2基因沉默和過表達后細胞增殖能力的改變。結果 與陰性對照組比較，KPNA2 siRNA干擾質粒轉染5637細胞后，轉染組細胞KPNA2蛋白表達水平顯著下降，細胞增殖能力明顯受到抑制，pcDNA3.1(+)-KPNA2過表達質粒轉染5637細胞后，轉染組細胞KPNA2蛋白表達水平顯著升高，細胞增殖能力明顯增強(P<0.05)。結論 KPNA2基因沉默和過表達可以調節(jié)人膀胱癌細胞株5637的增殖能力，為膀胱癌的臨床治療提供了新方向。

膀胱癌；KPNA2；RNA干擾；過表達；增殖

核轉運蛋白基因2(karyopherin a2,KPNA2)是一種具有核定位信號區(qū)域的接頭蛋白，作為核孔靶向復合物的組成部分，與核定位信號結合，運輸?shù)鞍踪|進入核內發(fā)揮作用，調節(jié)效應基因的表達，與細胞的惡性轉化密切相關[1]。目前關于KPNA2基因與膀胱癌的關系研究較少，確切分子機制尚不清楚。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種常用的基因沉默技術，是外源或內源雙鏈RNA在生物體內誘導的特異性基因沉默現(xiàn)象。本研究探討了KPNA2基因干擾和過表達對人膀胱癌5637細胞株增殖能力的影響，為深入研究KPNA2基因在腫瘤中異常表達的分子機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑人膀胱癌細胞株5637、EJ、J82由北京大學泌尿外科研究所提供。SV-HUC-3細胞株購自美國ATCC公司。Ham’s F-12培養(yǎng)基和DMEM 培養(yǎng)基購自北京中杉金橋生物技術有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。脂質體LipofectamineTM2000 轉染試劑盒購自美國Invitrogen 公司。兔抗人多克隆抗體KPNA2購自英國Abcam公司，兔抗人多克隆抗體GAPDH 購自美國Santa Cruz 公司。pcDNA3.1(+)-KPNA2過表達質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司。CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒購自日本Dojindo公司。BCA蛋白定量檢測試劑盒購自美國Thermo公司。免疫組織化學檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向KPNA2干擾質粒的設計和合成 根據(jù)GenBank提供的人KPNA2基因序列(序列號：NM_002266)，按照小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)設計原則，由上海吉瑪制藥技術有限公司化學合成2對siRNA序列，通過GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST序列比對，確定所選序列與其他基因無同源性，為特異性序列。同時合成1對陰性對照序列，5′端標記熒光素FAM，即siRNA-NC-FAM，評價siRNA轉染的效率。序列見表1。

表1 KPNA2 siRNA序列

基因序列(5'～3')KPNA2siRNA-1正義GACUCAGGUUGUGAUUGAUTT反義AUCAAUCACAACCUGAGUCTTKPNA2siRNA-2正義CCGUUGAUGAACCUCUUAATT反義UUAAGAGGUUCAUCAACGGTTKPNA2siRNA-NC正義UCCUCCGAACGUGUCACGUTT反義ACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染 將冷凍保存于液氮中的膀胱癌細胞株5637、J82、EJ和正常尿路上皮細胞株SV-HUC-3復蘇后,分別接種于含10%(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI1640、DMEM和Ham’s F-12培養(yǎng)基中，加入終濃度各為100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內生長，胰酶消化細胞傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗，調整細胞濃度，接種至6孔培養(yǎng)板，每孔約1×106個細胞，細胞生長至80%～90%融合時，采用脂質體LipofectamineTM2000方法進行轉染，整個轉染步驟嚴格按照說明書進行。實驗設2個組: 質粒轉染組[采用KPNA2 siRNA干擾質?；騪cDNA3.1(+)-KPNA2過表達質粒轉染]、陰性對照組(采用無關序列RNA 轉染)，每組設置3個復孔。轉染前后、倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測不同細胞株中KPNA2蛋白表達 取對數(shù)生長期的各組細胞，加入RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，BCA 法進行蛋白質定量，取等量總蛋白用10%(體積分數(shù)) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，PVDF膜進行轉膜，5%(體積分數(shù))脫脂牛奶-TBST封閉液室溫反應1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗人多克隆抗體KPNA2、兔抗人多克隆抗體GAPDH(內參照)。4℃ 反應過夜。TBST 洗膜3次，將洗滌后的一抗反應膜放入二抗工作液中作用1 h。暗室中ECL 試劑盒顯色，拍照，采用美國 UVP 分析儀器，對膠片進行掃描，比較各組灰度變化。實驗重復 2 次。

1.2.4 蛋白質印跡法檢測5637細胞干擾前后KPNA2蛋白表達 收集轉染后48 h的5637細胞，加入RIPA裂解緩沖液提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白質濃度，取等量總蛋白用10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，PVDF膜進行轉膜，5%脫脂牛奶-TBST封閉液室溫反應1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗人多克隆抗體KPNA2、兔抗人多克隆抗體GAPDH(內參照)。余實驗步驟同1.2.3。

1.2.5 CCK-8法檢測5637細胞干擾前后細胞增殖活性 取對數(shù)生長期的5637細胞，2 000個/孔細胞的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，用不含抗生素的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)；次日，當5637細胞融合度達30% ～50% 時，采用脂質體LipofectamineTM2000方法進行轉染，每組取4個重復孔。分別在轉染后24、48、72、96 h，按 CCK-8 試劑盒說明書提供的方法檢測細胞增殖活性，于各時間點檢測前更換培養(yǎng)液，加入100 μL/孔培養(yǎng)液和10 μL/孔CCK-8試劑，細胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測450 nm波長處各孔的吸光度(A)值。

2 結 果

2.1 KPNA2在不同膀胱癌細胞株中的蛋白表達如圖1所示，在正常尿路上皮細胞株SV-HUC-3中KPNA2蛋白表達水平較低，在各組膀胱癌細胞株(EJ、5637、 J82)中，KPNA2蛋白表達均不同程度升高。

圖1 不同膀胱癌細胞株中KPNA2蛋白表達

2.2 轉染siRNA和過表達質粒對膀胱癌5637細胞KPNA2蛋白水平的影響選取KPNA2高表達的膀胱癌5637細胞株為研究對象，將KPNA2 siRNA干擾質粒和pcDNA3.1(+)-KPNA2過表達質粒轉染膀胱癌5637細胞。48 h后，分別提取轉染組和陰性對照組的蛋白質進行蛋白印跡法檢測。

與陰性對照組比較，KPNA2 siRNA干擾質粒轉染5637細胞后，轉染組KPNA2蛋白表達水平顯著下降(圖2A、2B)，pcDNA3.1(+)-KPNA2過表達質粒轉染5637細胞后，轉染組KPNA2蛋白表達水平明顯升高(圖2C、2D)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 蛋白印跡法檢測膀胱癌5637細胞KPNA2蛋白表達

A,B： KPNA2在敲低組及對照組灰度定量和蛋白表達;C,D ：KPNA2在過表達組及對照組灰度定量和蛋白表達。

2.3 轉染siRNA和過表達質粒對膀胱癌5637細胞增殖能力的影響取轉染后對數(shù)期生長期的各組細胞，檢測細胞的增殖能力。結果發(fā)現(xiàn)，KPNA2 siRNA干擾質粒轉染5637細胞后，轉染組細胞增殖活性明顯受到抑制(圖3A)。pcDNA3.1(+)-KPNA2過表達質粒轉染5637細胞后，轉染組細胞增殖活性明顯增強(圖3B),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 沉默和過表達KPNA2對膀胱癌5637細胞增殖能力的影響

A：KPNA2在敲低組及對照組細胞增殖能力變化；B：KPNA2在過表達組及對照組細胞增殖能力變化。

3 討 論

膀胱癌在我國泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率和死亡率均居首位，隨著社會老齡化程度加劇，其發(fā)病率、死亡率呈逐年上升趨勢[2]。90%以上膀胱癌源自于移行上皮，具有易復發(fā)和進展的特點。在首診的膀胱癌患者中肌層浸潤性膀胱癌約占30%，其中33%的患者在接受首次治療時已發(fā)生遠處轉移，25%的患者在根治性膀胱切除術過程中發(fā)現(xiàn)有淋巴浸潤，術后約50%的患者在2年內發(fā)生遠處轉移，5年生存率不到40%[3-4]。因此，早期診斷和阻止膀胱癌的進展和轉移是當前研究的熱點之一。

隨著分子生物學研究的進展，尤其是cDNA技術的應用，目前己經明確多種與膀胱癌發(fā)生和發(fā)展相關的分子標志物。核轉運蛋白基因2(karyopherin a2，KPNA2)就是本實驗室早期利用cDNA芯片技術，結合文獻挖掘的生物信息學方法，篩選出的一個與膀胱癌進展密切相關的新基因，并在膀胱癌中對相關基因進行深入研究[5-6]。

KPNA2基因位于染色體17q23-q24，mRNA全長1 981 bp，其編碼產物是含529個氨基酸的蛋白質。Karyopherin a2蛋白是karyopherin a/importin a輸入蛋白家族一員，是一種進化上保守的核轉運蛋白[1]。已知大多數(shù)細胞內信號傳導通路的最后的主要步驟之一是核漿通訊，即細胞質中的一些蛋白質(如轉錄因子)進入細胞核并在核內調節(jié)效應基因或其他信號分子的表達。細胞質內的分子要想穿過核膜進入細胞核，必須通過核孔復合物。小分子例如離子和分子量小于20～40 ku的蛋白，能通過擴散作用直接穿過核孔復合物；而分子量大于40 ku的蛋白，必須借助一些核轉運蛋白的幫助才能通過核孔。目前已經發(fā)現(xiàn)了很多核轉運蛋白，例如karyopherin a2(KPNA2)、Ran/TC4、importin β等[7]。

由于KPNA2基因是新近發(fā)現(xiàn)的一個候選癌基因，目前關于該基因在腫瘤中的研究主要集中在乳腺癌、食管癌、卵巢癌[8-10]，而且主要是有關臨床病理特征或預后關系的研究。關于KPNA2基因在腫瘤中的確切分子機制目前尚不清楚，對于其表達調控的機制研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，KPNA2與c-Jun、E2F1、Rac1、OCT4等基因的異常表達或失活有關[11-12]，可能參與腫瘤細胞的增殖和侵襲[13]。

在前期研究中，我們采用基因芯片技術篩選非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌的差異表達基因，篩選到KPNA2基因在膀胱癌中高表達。在正在進行的上尿路移行細胞癌的腫瘤標記物的研究中，我們使用組織芯片技術同樣檢測到了該基因在腎盂癌和輸尿管癌中存在差異表達，并且與上尿路腫瘤的不良預后以及術后繼發(fā)膀胱癌有關。JENSEN等[14]研究也發(fā)現(xiàn)膀胱癌中KPNA2差異表達與非肌層浸潤性膀胱癌的進展和行根治性膀胱切除術的肌層浸潤性膀胱癌患者的不良預后有關，提示該基因可能與移行細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程有關。本研究選用適度表達KPNA2的人膀胱癌5637細胞系作為細胞模型進行相關功能研究。設計并合成靶向KPNA2的siRNA干擾質粒和過表達質粒，通過脂質體轉染方法轉染5637細胞，結果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組比較，KPNA2 siRNA干擾質粒轉染5637細胞后，轉染組細胞KPNA2和PCNA蛋白表達水平顯著下降，細胞增殖活性明顯受到抑制。pcDNA3.1(+)-KPNA2過表達質粒轉染5637細胞后，轉染組細胞KPNA2蛋白表達水平顯著升高，細胞增殖能力明顯增強。

綜合上述，KPNA2基因的表達水平與膀胱癌5637細胞異常的增殖能力有關。以KPNA2作為抑制膀胱癌生長和轉移的期望靶點，通過RNAi技術沉默KPNA2基因表達，阻止腫瘤生長，可能是腫瘤基因治療的途徑之一。

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(編輯 何宏靈)

Effect of KPNA2 gene silence and overexpression on proliferation of human bladder cancer cell lines 5637

SHI Ben-tao1,2, SU Bo-xing1,2, FANG Dong1,2, HE Qun1,2, LI Xue-song1,2, ZHOU Li-qun1,2

(1. Department of Urology, the First Hospital of Peking University, 2. Institute of Urology, Peking University, 3. Department of Urological Pathology, the First Hospital of Peking University, Beijing 100034, China)

Objective To observe the effect of KPNA2 gene silence and overexpression on the proliferation of bladder cancer cell lines 5637. Methods KPNA2 siRNA interfering plasmid and pcDNA3.1 (+)-KPNA2 overexpression plasmid were transiently transfected in vitro into human bladder cancer cell lines 5637 using LipofectamineTM2000. The expression of KPNA2 protein was detected with Western blot assay 48 hours after transfection. The proliferation of bladder cancer cell lines 5637 was evaluated with CCK-8 method in vitro. The variation of cell proliferation after KPNA2 gene silencing and overexpression was assessed with cell growth curve. Results Compared with the negative control group, in the siRNA transfected group, the expression of KPNA2 protein was significantly decreased, and the proliferation of cells was markedly suppressed (P<0.05). However, in the pcDNA3.1(+)-KPNA2 transfected group, the expression of KPNA2 protein was significantly increased, and the proliferation of cells was obviously enhanced (P<0.05). Conclusion The silence and overexpression of KPNA2 gene can modulate the proliferation of human bladder cancer cell lines 5 637, which provides a new therapeutic target for the clinical treatment of bladder cancer.

bladder cancer; KPNA2; RNA interference; overexpression; proliferation

2014-10-09

2014-11-26

國家自然科學基金(No:81372746)；北京自然科學基金(No:7122183)；廣東省醫(yī)學科研基金(No:A2014653)；深圳市科技計劃項目(No:201302052)

周利群，教授，醫(yī)學博士.E-mail：zhoulqmail@china.com

史本濤(1977-)，男(漢族)，醫(yī)學博士，主要從事泌尿系統(tǒng)腫瘤的臨床研究工作.E-mail：shibentaopku@126.com.

Q737.14

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-03-015