周青松，靳風(fēng)爍，李彥鋒，張 軍，張克勤，孫中義

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科，重慶 400042)

·基礎(chǔ)研究·

真核表達(dá)質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b雄鼠免疫避孕效應(yīng)研究

周青松，靳風(fēng)爍，李彥鋒，張 軍，張克勤，孫中義

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科，重慶 400042)

目的 研究小鼠Bin1b真核表達(dá)重組質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b的DNA疫苗雄鼠免疫避孕效應(yīng)。方法 應(yīng)用pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b(C3d3-Bin1b組)肌注免疫雄鼠，觀察其精子活力及避孕效應(yīng)，ELISA法檢測(cè)雄鼠血清抗Bin1b蛋白IgG抗體最大稀釋度、IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平。PBS組、空載體pSG.SS.YL組(空載體組)和pSG.SS.YL.Bin1b組(Bin1b組)為對(duì)照組。結(jié)果 C3d3-Bin1b組雄鼠精子活力、雌鼠受孕率、平均產(chǎn)仔數(shù)量顯著降低，免疫避孕效果顯著好于Bin1b組。C3d3-Bin1b組雄鼠血清抗Bin1b蛋白IgG抗體滴度顯著升高，血清IL-2、INF-γ濃度顯著降低，血清IL-4、IL-10濃度顯著增加。結(jié)論 真核表達(dá)重組質(zhì)粒pSG.SS. C3d3.YL.Bin1b可有效誘導(dǎo)雄鼠產(chǎn)生免疫性避孕效應(yīng)，效果優(yōu)于pSG.SS.YL.Bin1b。

抗菌肽蛋白；避孕疫苗；C3d3

雄性免疫節(jié)育疫苗的開(kāi)發(fā)可能成為控制人口過(guò)度增長(zhǎng)的理想措施，而靶抗原的選擇及增強(qiáng)免疫效應(yīng)的有效途徑則是構(gòu)建該類(lèi)疫苗的最關(guān)鍵部分。附睪對(duì)精子具有促進(jìn)成熟、儲(chǔ)存和保護(hù)作用，目前認(rèn)為附睪是進(jìn)行抗生育的一個(gè)理想的靶器官[1-2]，因?yàn)楦讲G功能較為單一，藥物不致引起嚴(yán)重的副作用，而且精子在進(jìn)入附睪前已經(jīng)分化完全，不涉及DNA復(fù)制機(jī)能，干擾藥物不會(huì)引起DNA改變的遺傳病。目前認(rèn)為附睪頭部中段上皮細(xì)胞所分泌的抗菌肽蛋白(Bin1b)“啟動(dòng)”了精子的前向運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)精子的成熟，進(jìn)行這一功能的阻斷研究可能是雄性免疫節(jié)育的關(guān)鍵點(diǎn)[3-4]。研究表明，2～3個(gè)補(bǔ)體C3裂解片段(C3d)拷貝能顯著提高抗原免疫原性[5-6]。因此，本研究制備含有小鼠Bin1b和串聯(lián)3個(gè)C3d(C3d3)融合基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pSG. SS.C3d3.YL.Bin1b，將該DNA疫苗接種于雄性昆明小鼠，觀察其免疫性避孕效應(yīng)。

1 材料與方法

1．1 質(zhì)粒、動(dòng)物和儀器質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b和pSG.SS.YL.Bin1b為本課題組前期構(gòu)建。昆明小鼠雄性24只，雌性72只，均為8周齡以上有生育能力的健康成年鼠，每只小鼠體重為20～22 g。96孔酶標(biāo)板(丹麥NUNC)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó) Biorad)。

1．2 方法及檢測(cè)

1．2．1 小鼠免疫程序 隨機(jī)將24只雄性小鼠分為4組，pSG.SS.YL-Bin1b組(Bin1b組)、pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b組(C3d3-Bin1b組)、空載體pSG.SS.YL(空載體組)和 PBS陰性對(duì)照組(PBS組)，每組6只。C3d3-Bin1b組用質(zhì)粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b注射股四頭肌，輪流注射兩側(cè)肢體，初免及加強(qiáng)(0、2、4周)共3次，每次接種DNA量100 pmol/100 μL。等量無(wú)菌 0.01 mol/L PBS注射PBS組，用空載體pSG.SS.YL對(duì)空載體組進(jìn)行免疫，Bin1b組用pSG.SS.YL-Bin1b進(jìn)行免疫。

1．2．2 免疫避孕效應(yīng)觀察 把免疫后6周的各組雄鼠與同齡健康有生育力的雌鼠合籠喂養(yǎng)，雌雄鼠合籠比例為3∶1，若合籠雌鼠出現(xiàn)有陰道栓，則立即分籠喂養(yǎng)雌鼠，統(tǒng)計(jì)各組孕鼠數(shù)量及每窩產(chǎn)仔數(shù)量。

1．2．3 標(biāo)本采集 取各組小鼠初次免疫后2、4、8周斷尾血15 μL，混入 30 μL阿氏保存液，4℃靜置3 h，離心(1 000 r/min×5 min)后取上清液，在-70 ℃冰箱中保存，用于抗體檢測(cè)。首次免疫后第8周處死雄鼠，體表酒精消毒，解剖雄鼠，取出雙側(cè)附睪尾，放入生理鹽水中，清理表面血污及脂肪。將附睪尾置于培養(yǎng)皿液滴中央，切碎附睪采集精子，精子懸液立即進(jìn)行顯微觀察與活力計(jì)數(shù)。

1．2．4 血清Bin1b抗體檢測(cè) 采用ELISA分析法檢測(cè)抗體濃度， A背景值為PBS組血清稀釋10倍所測(cè)值，超過(guò)A背景值3倍為陽(yáng)性，抗體滴度為稀釋血清至非陽(yáng)性范圍內(nèi)的終末稀釋值。

1．2．5 血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平測(cè)定 按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作(美國(guó)R&D公司)。

1．3 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用軟件SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05差異顯著，P<0.01差異非常顯著。

2 結(jié) 果

2．1 免疫性避孕效應(yīng)觀察與兩對(duì)照組相比，C3d3-Bin1b組和Bin1b組雌鼠受孕率、平均產(chǎn)仔數(shù)量均顯著降低，雄鼠精子活力顯著下降，C3d3-Bin1b組變化趨勢(shì)較Bin1b組顯著(見(jiàn)表1)。

組別雌鼠受孕率(%)每胎產(chǎn)仔數(shù)(只)雄鼠精子活力(%)PBS組10011.3±2.182.6±5.5空載體組10010.9±2.882.3±5.8Bin1b組 55.6*5.9±1.2*42.5±6.6*C3d3-Bin1b組 27.8△3.4±1.1△27.1±9.3△

與PBS組、空載體組比較，*P<0.01;與其他三組比較,△P<0.01

2．2 雄鼠血清抗Bin1b抗體生成情況測(cè)定Bin1b組和C3d3-Bin1b組首次接種后2、4、8周均出現(xiàn)抗體陽(yáng)性反應(yīng)。Bin1b組最大稀釋度分別為1∶20、1∶80和1∶640，C3d3-Bin1b組最大稀釋度分別為1∶80、1∶320和1∶2 560，顯著高于同期Bin1b組。PBS組和空載體組均未出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。

2．3 雄鼠血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10水平測(cè)定結(jié)果IL-2和INF-γ質(zhì)量濃度在Bin1b組和 C3d3-Bin1b組呈降低趨勢(shì)，并且C3d3-Bin1b組顯著低于Bin1b組，PBS組和空載體組無(wú)顯著區(qū)別。IL-4和IL-10濃度在Bin1b組和 C3d3-Bin1b組呈升高趨勢(shì)， Bin1b組顯著低于C3d3-Bin1b組(表2～表5)。

組別2周 4周 8周 PBS組37.7±3.636.6±3.436.9±2.9空載體組36.8±2.836.2±3.136.3±2.8Bin1b組31.5±2.8*28.4±3.2*25.2±3.5*C3d3-Bin1b組25.6±2.7△22.4±2.6△18.1±1.4△

與PBS組、空載體組比較,*P<0.01;與其他3組比較,△P<0.01。

組別2周 4周 8周 PBS組9.15±0.629.02±0.849.10±0.51空載體組9.12±0.389.08±0.698.92±0.95Bin1b組8.04±0.55*7.13±0.45*5.94±0.68*C3d3-Bin1b組5.81±0.39△4.95±0.47△4.56±0.34△

與PBS組、空載體組比較,*P<0.01;與其他3組比較,△P<0.01。

組別2周 4周 8周 PBS組49.2±5.148.8±4.148.5±5.0空載體組49.1±3.049.3±3.850.9±4.2Bin1b組58.4±4.2*63.2±7.1*68.2±4.3*C3d3-Bin1b組68.7±5.1△74.1±4.9△79.5±5.5△

與PBS組、空載體組比較,*P<0.01;與其他3組比較,△P<0.01。

組別2周 4周 8周 PBS組30.9±3.831.1±3.330.2±3.8空載體組30.8±3.531.5±2.228.9±3.9Bin1b組39.3±4.6*44.0±5.3*50.1±3.4*C3d3-Bin1b組47.3±5.2△51.9±6.5△56.8±5.6△

與PBS組、空載體組比較，*P<0.01;與其他3組比較,△P<0.01。

3 討 論

抗菌肽蛋白(Bin1b)為附睪頭部中段的上皮細(xì)胞分泌的一種蛋白，它被分泌入管腔后，結(jié)合沒(méi)有運(yùn)動(dòng)能力的精子，使精子通過(guò)L型鈣離子通道攝取鈣離子，進(jìn)一步促進(jìn)了精子運(yùn)動(dòng)。前期研究也發(fā)現(xiàn)，將未成熟的附睪頭部精子和轉(zhuǎn)染Bin1b的小腸上皮細(xì)胞或附睪頭部上皮細(xì)胞(含Bin1b)共培養(yǎng)，精子運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)，但在加入Bin1b抗體后，精子的運(yùn)動(dòng)能力無(wú)變化；此外，向成熟的附睪尾部精子中加入Bin1b抗體后，沒(méi)有改變精子的運(yùn)動(dòng)能力。說(shuō)明Bin1b對(duì)成熟精子的運(yùn)動(dòng)不起作用，但是能促進(jìn)未成熟精子的運(yùn)動(dòng)[7]。

本研究組在前期實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b重組真核表達(dá)質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了重組質(zhì)粒DNA疫苗雄鼠免疫避孕效應(yīng)，采用的方法是DNA疫苗注射。相比傳統(tǒng)疫苗，DNA疫苗具有高效、持久、簡(jiǎn)便、廣譜、廉價(jià)、無(wú)致病性等突出的優(yōu)勢(shì)。

本研究結(jié)果表明，pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b DNA疫苗免疫雄性小鼠后，精子活力、雌性小鼠受孕率、平均產(chǎn)仔數(shù)量顯著降低，其避孕效應(yīng)顯著優(yōu)于Bin1b組。雄鼠在未加強(qiáng)免疫時(shí)，血清中就已產(chǎn)生Bin1b特異性抗體，而且滴度逐漸升高。機(jī)體在抗原刺激后，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，判斷免疫應(yīng)答類(lèi)型的主要依據(jù)是抗原刺激機(jī)體后導(dǎo)致細(xì)胞因子微環(huán)境的改變。前期研究發(fā)現(xiàn)，C3d作用機(jī)制與以下因素有關(guān)：① 補(bǔ)體C3是補(bǔ)體激活途徑中的樞紐，并保持與抗原共價(jià)連接的能力[8]。②C3d通過(guò)與抗原耦聯(lián)，增加抗原分子量，提高低親和性/小分子量抗原的免疫原性[9]。③B細(xì)胞表面的CR2/ CD21和BCR分別與耦連的C3d和抗原結(jié)合，使BCR與 CD19交聯(lián)，從而直接將免疫效應(yīng)細(xì)胞與抗原相連，產(chǎn)生共刺激信號(hào)[10]。

精漿中含有IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、腫瘤壞死因子、干擾素等多種細(xì)胞因子, 它們對(duì)精子的發(fā)生和功能等發(fā)揮著直接和間接的生物學(xué)作用[11], 從而對(duì)男性生育產(chǎn)生影響。IL-2 和IL-4 均由活化的輔助性T 細(xì)胞(Th) 分泌, 其中Th1 分泌IL-2，Th2 分泌IL-4, 在正常情況下，Th1 和Th2 維持一定平衡, 在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的增殖分化及功能調(diào)控方面起重要調(diào)節(jié)作用。IL-2最重要的作用是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖(從G0期進(jìn)入S期)和分化。其對(duì)T細(xì)胞的作用還包括增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的細(xì)胞毒活性，增加細(xì)胞內(nèi)pH，誘導(dǎo)c-myc、c-myb和IL-2受體表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)，增強(qiáng)細(xì)胞間的接觸和誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子干擾素(IFN)-7、IL-4、TNF和集落刺激因子CSF等。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，IL-2和INF-γ濃度在C3d3-Bin1b組呈降低趨勢(shì)，表明C3d3能顯著增強(qiáng)Bin1b疫苗免疫原性，抑制IL-2、IL-4和INF-γ的生物活性，進(jìn)而抑制精子細(xì)胞活力。C3d對(duì)Bin1b具有顯著調(diào)節(jié)作用。相對(duì)與Bin1b組，IL-4和IL-10濃度在C3d3-Bin1b組呈升高趨勢(shì)， IL-2和INF-γ濃度在C3d3-Bin1b組呈降低趨勢(shì)，表明C3d3能顯著增強(qiáng)Bin1b疫苗免疫原性，誘導(dǎo)更強(qiáng)免疫反應(yīng)。

綜上所述，pSG.SS. C3d3.YL.Bin1b DNA疫苗可有效誘導(dǎo)雄鼠產(chǎn)生免疫性避孕效應(yīng)，效果顯著優(yōu)于pSG.SS.YL.Bin1b。

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(編輯 王 瑋)

Immunocontraceptive effects of pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b on male mice

ZHOU Qing-song, JIN Feng-shuo, LI Yan-feng, ZHANG Jun, ZHANG Ke-qin, SUN Zhong-yi

(Department of Urology, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)

Objective To explore the immunological contraceptive effects induced by pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b on male mice. Methods After male mice were immunized with pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b,their serum IgG titres against Bin1b,the content of serum IL-2,INF-γ,IL-4 and IL-10 were detected using ELISA assays.PBS group, pSG.SS.YL group and pSG.SS.YL.Bin1b group (Bin1b group) served as control groups. Results The sperm viability, pregnancy rate of the female mice,and average litter number of the C3d3-Bin1b group were significantly lower than those of the Bin1b group.In the C3d3-Bin1b group,serum IgG titres was higher, the content of IL-2 and INF-γ decreased significantly, while the content of IL-4 and IL-10 increased markedly.Conclusion pSG.SS.C3d3.YL.Bin1b has better contraceptive effects on male mice than pSG.SS.YL.Bin1b.KEY WORDS:Bin1b; contraception vaccine; C3d3

2014-07-09

2014-11-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81100546)；重慶市自然科學(xué)基金(No.CSTC,2010BB5162)

孫中義，副主任醫(yī)師、副教授.E-mail: sun200801@hotmail.com

周青松(1984-),男(漢族)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事男科學(xué)基礎(chǔ)和臨床研究.E-mail: lobsper.j@163.com

R392

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-03-016