倪少濱，劉 迪，趙忠山， 麻 立， 焦治興

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

·基礎研究·

不同來源前列腺基質(zhì)細胞對前列腺癌細胞IGF-1和p-AKT表達的影響

倪少濱，劉 迪，趙忠山， 麻 立， 焦治興

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150001)

目的 探討胰島素樣生長因子在前列腺癌腫瘤-基質(zhì)交互作用中的地位及其作用機制。方法 將前列腺癌旁基質(zhì)細胞和良性前列腺基質(zhì)細胞分別與前列腺癌細胞系PC-3細胞分隔共培養(yǎng)(并設空白對照)，之后檢測前列腺癌細胞中IGF-1 mRNA (半定量RT-PCR)和p-AKT蛋白表達(Western blot)。結(jié)果 與空白對照組相比較，癌旁基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組IGF-1 mRNA表達有所上調(diào)、p-AKT蛋白表達有所上調(diào)，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；良性基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組IGF-1 mRNA和p-AKT蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)。相關性分析顯示各組前列腺癌細胞IGF-1 mRNA與p-AKT蛋白表達呈正相關。結(jié)論 良性前列腺基質(zhì)細胞通過水溶性因子抑制前列腺癌細胞中IGF-1及其下游因子表達，前列腺癌旁基質(zhì)細胞則喪失了該抑制作用。

前列腺癌；胰島素樣生長因子；基質(zhì)細胞

前列腺癌為歐美男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在我國發(fā)病也逐年上升。近年來的研究成果顯示細胞信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)異常在腫瘤發(fā)生中有重要地位，該系統(tǒng)作為腫瘤治療靶點的潛力也日趨明朗。針對細胞信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的藥物，也成為了當前抗腫瘤藥物開發(fā)的重要方向。為了明確胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)在前列腺癌腫瘤-基質(zhì)交互作用的地位及其作用機制，我們檢測了前列腺癌腫瘤-基質(zhì)共培養(yǎng)條件下PC-3前列腺癌細胞中IGF-1及其下游癌相關基因表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 前列腺癌細胞：非雄激素依賴性前列腺癌細胞系PC-3。前列腺基質(zhì)細胞：前列腺癌基質(zhì)細胞分離自前列腺癌根治手術標本；良性前列腺基質(zhì)細胞分離自膀胱癌根治手術標本。

1.1.2 主要試劑和材料 RPMI 1640 培養(yǎng)基(Gibco)、小牛血清(Gibco)、WAJC 培養(yǎng)基(Gibco)、插入杯(Sigma)、RT-PCR試劑盒(Promab)、引物(上海生工)、Western blotting 試劑盒(PIERCE)、兔抗人多克隆抗體p-AKT(CST)、羊抗兔HRP-conjugated(PIRECE)。

1.2 方法

1.2.1 前列腺基質(zhì)細胞原代培養(yǎng) 取手術切除正常前列腺/前列腺癌組織標本，Ⅰ型膠原酶消化，得基質(zhì)細胞置入含5%小牛血清(體積分數(shù))的RPMI1640培養(yǎng)液，4℃保存，病理證實后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 上皮/基質(zhì)細胞共培養(yǎng) 取PC-3細胞和單獨培養(yǎng)14d后的原代間質(zhì)細胞，消化脫壁，用上皮/間質(zhì)細胞混合培養(yǎng)液(等容積混合)重懸并計數(shù)后，上皮細胞以20×103個細胞/孔接種至6孔板；間質(zhì)細胞以4×103個細胞/ 孔接種至插入杯。2 h培養(yǎng)使細胞充分沉降后，將含有間質(zhì)細胞的插入杯移到培養(yǎng)孔內(nèi)進行共培養(yǎng)，設置插入杯內(nèi)沒有細胞而其他條件完全相同的培養(yǎng)板為共培養(yǎng)空白對照組，每組8孔，每3 d 換液1次，共培養(yǎng)12 d。

1.2.3 半定量RT-PCR檢測IGF-1 mRNA表達 mRNA引物設計如表1。操作過程及其他參數(shù)略。

表1 mRNA引物序列設計

目的基因片段長度(bp)引物序列IGF-1171上游:5-GATCTAAGGAGGCTGGAGAT-3;下游:5-AGGGTCTTCCTACATCCTGT-3 GAPDH450上游:5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3;下游:5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3

1.2.4 Western blot檢測p-AKT蛋白表達 孔板中的貼壁細胞PBS洗滌后轉(zhuǎn)移到EP管，離心棄上清，加入細胞裂解液裂解后取上清-20℃儲存。上樣，80 V電泳積聚蛋白，100 V分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，TBS-T封閉1 h。加一抗4℃孵育過夜后，洗膜5 min×3次，在加二抗室溫下孵育1 h，洗膜5 min×3次，加入ECL化學發(fā)光顯示劑在室溫下反應1 min后，X光片曝光、定影、顯影。選擇β-actin作內(nèi)參照。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 10.0統(tǒng)計軟件處理。組間比較采用方差分析、Dunnet’t檢驗，相關性檢驗采用直線相關分析。P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺基質(zhì)細胞原代培養(yǎng)顯微鏡下觀察，約于培養(yǎng)開始72 h后始有細胞貼壁，20～24 d達到80%～85%融合，需要傳代。此時平滑肌細胞呈典型長梭狀，核/漿比例較大，細胞堆積呈“峰與谷”特征。傳代后生長速度稍加快，約每12 d傳代1次。

2.2 IGF-1 mRNA表達檢測用凝膠圖像分析儀分析電泳結(jié)果，各組IGF-1 mRNA表達比值(IGF-1/GAPDH)見表2。統(tǒng)計學分析顯示，與空白對照組相比較，癌旁基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組IGF-1 mRNA表達有所上調(diào)，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；正?；|(zhì)細胞共培養(yǎng)組IGF-1 mRNA表達顯著下調(diào)(P<0.05)。

2.3 p-AKT蛋白表達實驗結(jié)果見圖1。利用Quantity One軟件分析，各組p-AKT與內(nèi)參照β-actin的比值見表2。統(tǒng)計學分析顯示，與空白對照組相比較，癌旁基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組p-AKT蛋白表達有所上調(diào)，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；正常基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組p-AKT蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)。

表2 PC-3細胞中IGF-1 mRNA和p-AKT蛋白表達

組別nIGF-1表達比值p-AKT比值空白對照組80.513±0.0340.692±0.081良性基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組80.322±0.0510.557±0.079癌旁基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組80.581±0.0210.707±0.066

圖1 Western blot檢測p-AKT蛋白表達

A: 空白對照組；B：癌旁基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組；C：正?；|(zhì)細胞共培養(yǎng)組。

3 討 論

前列腺癌正成為我國發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一。現(xiàn)階段，早期發(fā)現(xiàn)的前列腺癌可以進行根治性切除，中晚期前列腺癌通常進行以雄激素阻斷為主的內(nèi)分泌治療，而進展至激素難治性階段后，就很難找到有效的治療方法。所以，醫(yī)學界迫切地需要進一步明確前列腺癌發(fā)生和發(fā)展的機制，找到新的有效的治療靶點。

腫瘤-基質(zhì)交互作用在前列腺癌的基礎研究中早已受到重視，而對于基質(zhì)細胞影響腫瘤細胞的作用途徑則尚無定論。JIANG等[1]發(fā)現(xiàn)分離自外周帶的前列腺基質(zhì)細胞對PC-3細胞的誘導增殖作用更強，這一作用是通過被性激素調(diào)節(jié)的生長因子達成的。還有其他研究證明前列腺基質(zhì)細胞在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中的作用，而生長因子在這一作用過程中占有重要位置[2-3]。

在與前列腺癌相關的諸多生長因子中，IGF是前列腺癌的研究中的熱點[4-6]。NORDSTRAND 等[7]發(fā)現(xiàn)IGF-1阻斷對于前列腺癌骨轉(zhuǎn)移具有強烈的誘導凋亡的作用。本研究在應用分隔共培養(yǎng)方式探討前列腺癌腫瘤-基質(zhì)交互作用機制的過程中發(fā)現(xiàn)，良性的前列腺基質(zhì)細胞可以明顯抑制PC-3細胞中IGF-1 mRNA和p-AKT蛋白的表達，且對以上兩者的抑制作用有明確的相關性。鑒于在分隔共培養(yǎng)系統(tǒng)中腫瘤、間質(zhì)細胞間無直接接觸，我們可以認為良性前列腺基質(zhì)細胞對于PC-3細胞的作用是通過水溶性因子達成的。這種抑制作用在前列腺癌相關基質(zhì)細胞與PC-3細胞之間則未觀察到。由此結(jié)果我們可以認為，正常的前列腺基質(zhì)細胞通過水溶性因子途徑對于前列腺癌細胞的部分生長因子及下游介質(zhì)表達有抑制作用，而前列腺癌相關基質(zhì)細胞則失去了這種抑制能力。該作用的具體作用途徑和介質(zhì)有待進一步研究確認。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示，良性前列腺基質(zhì)細胞可以通過水溶性因子對PC-3前列腺癌細胞中IGF-1 mRNA和p-AKT蛋白的表達發(fā)揮明確的抑制作用，而前列腺癌相關基質(zhì)細胞則不具備這種抑制能力。這驗證了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展與基質(zhì)細胞關系密切的觀點。

[1] JIANG Q, HAN BM, ZHAO FJ, et al. The differential effects of prostate stromal cells derived from different zones on prostate cancer epithelial cells under the action of sex hormones [J]. Asian J Androl, 2011, 13(6): 798-805.

[2] KAWADA M, INOUE H, ARAKAWA M, et al. Transforming growth factor-beta1 modulates tumor-stromal cell interactions of prostate cancer through insulin-like growth factor-I [J]. Anticancer Res, 2008, 28(2A):721-730.

[3] KAWADA M, INOUE H, OHBA S, et al. Leucinostatin A inhibits prostate cancer growth through reduction of insulin-like growth factor-I expression in prostate stromal cells [J]. Int J Cancer, 2010,15; 126(4):810-818.

[4] KAWADA M, INOUE H, MASUDA T, et al. Insulin-like growth factor I secreted from prostate stromal cells mediates tumor-stromal cell interactions of prostate cancer [J]. Cancer Res, 2006, 15; 66(8):4419-4425.

[5] KAPLAN-LEFKO PJ, SUTHERLAND BW, EVANGELOU AI, et al. Enforced epithelial expression of IGF-1 causes hyperplastic prostate growth while negative selection is requisite for spontaneous metastogenesis [J]. Oncogene, 2008, 1; 27(20): 2868-2876.

[6] BANUDEVI S, SENTHILKUMAR K, SHARMILA G, et al. Effect of zinc on regulation of insulin-like growth factor signaling in human androgen-independent prostate cancer cells [J]. Clin Chim Acta, 2010, 411(3-4): 172-178.

[7] NORDSTRAND A, LUNDHOLM M, LARSSON A, et al. Inhibition of the insulin-like growth factor-1 receptor enhances effects of simvastatin on prostate cancer cells in co-culture with bone [J]. Cancer Microenviron, 2013, 6(3):231-240.

(編輯 何宏靈)

Stromal cells from different sources influence the expression of IGF-1 and p-AKT in prostate cancer cells

NI Shao-bin, LIU Di, ZHAO Zhong-shan, MA Li, JIAO Zhi-xing

(Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China)

Objective To explore the role of insulin-like growth factor (IGF) in tumor-stromal cell interactions of prostate cancer. Methods PC-3 cells were seeded in TRANSWELL plate and interacted with different effector cells including benign and cancer-associated prostate stromal cells. Semi-quantitative RT-PCR was used to detect the expression of IGF-1 mRNA; Western blot was used to detect the expression of p-AKT. Results Compared with the control group, the expression of IGF-1 mRNA and p-AKT in PC-3 cells cocultured with benign prostate stromal cells were decreased (P<0.05), while there were no significant changes in the expression of IGF-1 mRNA and p-AKT in PC-3 cells cocultured with cancer-associated prostate stromal cells. The expression of IGF-1 mRNA was positively correlated with the expression of p-AKT (r=0.723,P<0.05). Conclusion Benign prostate stromal cells can suppress the expression of IGF-1 mRNA and its downstream protein factor in PC-3 cells, while cancer-associated prostate stromal cells do not have this effect.

prostate cancer; insulin-like growth factor; stromal cells

2014-09-29

2014-10-29

黑龍江省自然科學基金(No. D201080)

倪少濱(1960-)，男(漢族)，主任醫(yī)師，教授.E-mail：nsb1960@aliyun.com

R697.3

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015-01-014