李德和,王君為,趙 越

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

響應(yīng)面法優(yōu)化類球紅細菌中番茄紅素提取工藝

李德和,王君為,趙 越*

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

利用響應(yīng)面法研究有機溶劑提取類球紅細菌中番茄紅素的工藝。以每克菌體提取所得番茄紅素的量作為響應(yīng)值，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取皂化時間、料液比、超聲時間及提取次數(shù)為自變量，采用響應(yīng)面法研究各因素及其交互作用對類球紅細菌番茄紅素提取量的影響并建立了番茄紅素提取的回歸模型，確定了番茄紅素提取工藝的最佳條件為以丙酮為提取溶劑、皂化時間28 min、料液比1∶86（g/mL）、超聲時間11 min、提取次數(shù)2 次。在此條件下，番茄紅素提取量為9 326.48 μg/g。本實驗所得工藝方法切實可行，為類球紅細菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的進一步研究提供技術(shù)參考。

類球紅細菌；番茄紅素；提取；響應(yīng)面法

番茄紅素是一種類胡蘿卜素，因最早從番茄中分離制得而得名。番茄紅素習(xí)慣上被認為是一種色素，在眾多國家和地區(qū)被作為具有營養(yǎng)與著色雙重作用的食品添加劑[1]。番茄紅素具有抗氧化[2-3]、提高免疫力[4]、預(yù)防心血管疾病[5]、預(yù)防和抑制腫瘤[6]等多種生理功能，使其在食品、藥品或相關(guān)保健品以及化妝品、實用色素等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用[7]。常用番茄紅素生產(chǎn)方法中，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)成本低，易于大規(guī)模培養(yǎng)，產(chǎn)率高，因此被認為是目前生產(chǎn)番茄紅素最有前途的方法[8]。因此，建立一種對發(fā)酵菌體中番茄紅素進行優(yōu)化的科學(xué)合理的提取方法是非常必要的。

目前，番茄紅素提取方法主要有溶劑提取法、微波提取法、酶反應(yīng)法、超臨界提取法等[9-12]。有文獻[13-14]報道從三孢布拉霉菌、紅酵母等菌體中提取番茄紅素，但關(guān)于類球紅細菌中番茄紅素提取工藝的報道則甚少。響應(yīng)面法是目前設(shè)計試驗建模尋找響應(yīng)因子最佳條件最為常用的統(tǒng)計學(xué)技術(shù)[15-16]。因此，本研究通過單因素試驗及響應(yīng)面法設(shè)計尋求提取類球紅細菌中番茄紅素的最佳工藝條件，以期為類球紅細菌的綜合利用以及類球紅細菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母膏、蛋白胨為國產(chǎn)生物純，其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純；番茄紅素標準品 美國Sigma公司；類球紅細菌（編號:1.2174） 中國科學(xué)院微生物研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；BP211D電子天平 德國Sartorius公司；AY120電子天平日本Shimadzu公司；MJ-78A高壓滅菌鍋 美國Stik公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；RXZ人工氣候箱 寧波江南儀器廠；3-30K離心機 德國Sigma公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機寧波新芝超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的擴大培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基配方:KH2PO41.0 g，CaCl20.1 g，NaHCO33.0 g（過濾除菌），CH3COONa 1.0 g，MgCl21.0 g，NH4Cl 1.0 g，NaCl 1.0 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.5 g，丁二酸鈉1.0 g，微量元素液1.0 mL，去離子水1 000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方:NH4Cl 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，NaCl 0.4 g，KH2PO41.0 g，Na2CO30.5 g，MgCl2·6H2O 0.2 g，酵母膏1.0 g，微量元素液10 mL，去離子水1 000 mL。

微量元素液配方:Na2-EDTA 2.0 g，H3BO31.5 g，C u S O40.0 3 g，M n S O4·H2O 1.2 g，NaMoO4·2H2O 0.45 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g，ZnSO4·7H2O 0.15 g，NiCl2·6H2O 0.02 g，去離子水1 000 mL。

人工氣候箱培養(yǎng)條件:溫度35 ℃、光照4 000 lx、濕度60%。

按種子培養(yǎng)基配方配制500 mL種子培養(yǎng)基，于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌15 min，分裝至500 mL具塞透明玻璃瓶，接入菌種，置于人工氣候箱培養(yǎng)6 d得到500 mL對數(shù)期種子菌液。

同菌液擴大培養(yǎng)方法，配制發(fā)酵培養(yǎng)基4 750 mL，按5%的接種量接入上述對數(shù)期種子菌液，于實驗室人工氣候箱培養(yǎng)7 d即獲得5 000 mL擴大菌液。

1.3.2 類球紅細菌番茄紅素的提取工藝

吸取25 mL擴大菌液于50 mL離心管，6 000 r/min離心5 min，棄上清液得到約0.2 g濕菌體，生理鹽水水洗滌2次。加入5 mL預(yù)處理液處理30 min后，6 000 r/min離心3 min，棄上清液，所得菌泥加入有機溶劑進行避光超聲提取，破碎頻率為破碎5 s間隔5 s，破碎提取10 min。超聲提取后6 000 r/min離心1 min，所得上清液即為番茄紅素提取液。0.45 μm微孔濾膜過濾后作為試樣。

1.3.3 預(yù)處理液的選擇

為了提高番茄紅素的提取效率，減少提取過程中番茄紅素的氧化損失，需對菌體進行預(yù)處理后再作提取[13,17]。按上述方法得到濕菌體后，分別加入5 mL 95%乙醇溶液、0.25 mol/L Na2CO3溶液、0.25 mol/L NaHCO3溶液、0.25 mol/L NaOH溶液預(yù)處理30 min后，6 000 r/min離心1 min棄上清液，菌泥加20 mL丙酮（料液比為1∶100（g/mL）），混勻，避光超聲提取10 min，提取1 次。離心收集上清液，丙酮定容至50 mL，測定最大吸收波長處的吸光度，將吸光度最大者確定為最佳預(yù)處理液。

1.3.4 最佳溶劑的選擇

按上述方法對原料進行預(yù)處理后，分別加入20 mL丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、氯仿（料液比為1∶100（g/mL））[18-21]，在室溫條件下避光超聲提取10 min，提取1 次。用紫外-可見分光光度計測定不同提取液最大吸收波長處的吸光度，將吸光度最大者確定為最佳提取溶劑。

1.3.5 番茄紅素測定波長的確定及標準曲線的測定

精密稱取1.00 mg番茄紅素標準品，丙酮溶解，定容至10 mL，得100 μg/mL儲備液。吸取0.5 mL儲備液于1 cm厚比色杯中，在紫外-可見分光光度計上進行波長掃描（200～800 nm），得知番茄紅素丙酮溶液在446、471、502 nm波長處均有特征吸收峰，因多種類胡蘿卜素在471 nm波長處吸收較強，在502 nm波長處吸收較小[22]。為減少其他類胡蘿卜素對番茄紅素測定的干擾，本研究選取502 nm為類球紅細菌番茄紅素的檢測波長。

精密吸取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL儲備液于10 mL容量瓶，用丙酮稀釋至刻度，獲得5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/mL的標準品溶液，測定其在波長502 nm處的吸光度A。以標準品吸光度對標準品質(zhì)量濃度ρ（μg/mL）作線性回歸。

1.3.6 番茄紅素提取量的計算

對所得提取液稀釋一定倍數(shù)后，利用紫外-可見光分光光度計測定吸光度，從標準曲線可獲得供試品質(zhì)量濃度。

式中:ρ為供試品質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為提取液體積/mL；f為稀釋倍數(shù)；M為菌體濕質(zhì)量/g。

1.3.7 單因素試驗設(shè)計

采用丙酮作為提取溶劑，選擇皂化時間、料液比、超聲時間、提取次數(shù)這4 個對類球紅細菌番茄紅素提取效果有影響的工藝參數(shù)進行單因素試驗。各因素的水平梯度設(shè)置分別為皂化時間20、30、40、50、60 min，料液比1∶50、1∶75、1∶100、1∶125、1∶150（g/mL），超聲時間5、10、15、20、30 min，提取次數(shù)1、2、3、4次。不同條件下提取番茄紅素后，按照1.3.6節(jié)方法計算該方法條件下的番茄紅素提取量。

1.3.8 響應(yīng)面試驗設(shè)計

以單因素試驗為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計的原理，利用Minitab 16軟件設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗，對提取工藝進行優(yōu)化試驗設(shè)計并進行數(shù)據(jù)處理，試驗結(jié)果用二次多項式回歸擬合，用微分計算預(yù)測最佳提取工藝。選取皂化時間、料液比、超聲時間、提取次數(shù)4 個主要影響因素為自變量，以番茄紅素提取量為響應(yīng)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理液的選擇

從圖1可以看出，在皂化30 min、料液比1∶100（g/mL）、超聲破碎10 min、提取1 次的條件下，NaHCO3溶液對類球紅細菌的預(yù)處理效果最好。這是由于皂化作用及乙醇處理可以破壞類球紅細菌的細胞壁和組織結(jié)構(gòu)，有利于番茄紅素的溶出；另一方面，一些不溶于水的脂類、脂肪酸等物質(zhì)會溶于醇或在堿的作用下溶于水而被離心除去，這有利于提取溶劑對番茄紅素的提取。但番茄紅素會溶于乙醇且對堿不穩(wěn)定，pH值過高可能會破壞番茄紅素的結(jié)構(gòu)，因此95%乙醇溶液、NaOH溶液或Na2CO3溶液作為預(yù)處理液時色素的提取量均較低，因此選NaHCO3溶液作為預(yù)處理液。

2.2 最佳提取溶劑的選擇

從表1可以看出，在皂化30 min、料液比1∶100（g/mL）、超聲破碎10 min、提取1 次的條件下，番茄紅素在不同有機溶劑中的最大吸收波長及其吸光度不同，其中丙酮的吸光度最大，提取效果最好。因此本實驗確定丙酮為類球紅細菌番茄紅素的最佳提取溶劑。

2.3 標準曲線的測定

按1.3.5節(jié)方法制得番茄紅素的標準曲線，得A=0.040 0ρ-0.027 6，R2=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明:番茄紅素在5.00～25.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4 單因素試驗結(jié)果

2.4.1 皂化時間對提取效果的影響

采用NaHCO3溶液皂化一定時間后，離心收集菌泥，按料液比為1∶100（g/mL）加入丙酮，超聲10 min，提取1次，考察皂化時間對類球紅細菌番茄紅素提取效果的影響。

從圖2可以看出，在皂化時間小于30 min時，番茄紅素提取量隨著時間的延長而增大，這是因為皂化過程可以在一定程度上破碎細胞以及去雜質(zhì)，當皂化充分后，由于番茄紅素的不穩(wěn)定性，繼續(xù)皂化可能將導(dǎo)致番茄紅素發(fā)生結(jié)構(gòu)上的破壞，故在30 min后，隨著皂化時間延長，番茄紅素提取量呈下降趨勢。因此選取皂化時間為30 min。

2.4.2 料液比對提取效果的影響

采用NaHCO3溶液皂化30 min后，離心收集菌泥，按不同料液比（g/mL）加入丙酮，超聲10 min，提取1 次，考察料液比對類球紅細菌番茄紅素提取效果的影響。

由圖3可以看出，當料液比從1∶50降低到1∶75時，提取量隨之提高，這是因為溶劑用量越大，越有利于番茄紅素在溶劑中的有效溶解。但當繼續(xù)降低料液比時，由于番茄紅素的提取漸達平衡，故提取量亦趨穩(wěn)定。綜合考慮經(jīng)濟成本及提取效果，選取料液比1∶75（g/mL）為宜。

2.4.3 超聲時間對提取效果的影響

采用NaHCO3溶液預(yù)處理30 min后，離心收集菌泥，按料液比為1∶75（g/mL）加入丙酮，超聲提取1 次，考察超聲時間對類球紅細菌番茄紅素提取效果的影響。

從圖4可知，在5～10 min內(nèi)，類球紅細菌中番茄紅素提取量隨著超聲時間的延長而增加。這是因為超聲不但提高了細菌的破碎效果，而且促進番茄紅素與有機溶劑的接觸，故隨著超聲時間的延長番茄紅素提取量也隨著增加。但當繼續(xù)延長超聲時間時，由于細菌已完全破碎，提取也趨平衡，延長超聲時間反而會由于番茄紅素的不穩(wěn)定性而降低番茄紅素的提取量。故超聲10 min為宜。

2.4.4 提取次數(shù)的選擇

采用NaHCO3溶液預(yù)處理30 min后，離心收集菌泥，按料液比為1∶75（g/mL）加入丙酮，超聲提取10 min，考察提取次數(shù)對類球紅細菌番茄紅素提取效果的影響。

從圖5可見，經(jīng)過第2次提取后，大部分番茄紅素已被提取，當再增加提取次數(shù)時，番茄紅素提取量很低，這說明類球紅細菌中番茄紅素已幾近提取完全，綜合考慮經(jīng)濟成本及提取效果，提取2 次為宜。

2.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以提取量為響應(yīng)值，對皂化時間（X1）、料液比（X2）、超聲時間（X3）、提取次數(shù)（X4）4 個因素與番茄紅素提取量進行Box-Behnken四因素三水平響應(yīng)面分析試驗，響應(yīng)面分析方案與試驗結(jié)果見表2。

2.5.2 模擬方程的建立及顯著性檢驗

應(yīng)用Minitab 16軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，可得出4 個因素和提取量之間的二次多項回歸模型:

Y=9 146.63-135.55X1+491.20X2+520.32X3+ 737.93X4-943.89X12-801.17X22-1462.08X32-820.48X42-144.94X1X2+104.94X1X3-410.47X1X4+ 382.97X2X3+160.44X2X4-14.50X3X4

對所得回歸模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。從表中可知:回歸項P＜0.001表明回歸模型極顯著，失擬項P=0.178＞0.05，表明回歸模型失擬不顯著，說明模型擬合度良好。同時可得知，4個因素的線形、平方、交互作用對提取量的影響都極顯著。方程的相關(guān)系數(shù)表明模型回歸方程的擬合程度良好，可用來分析和預(yù)測類球紅細菌番茄紅素的提取工藝。

對所得回歸模型系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示:模型的X1X2、X1X3、X2X4、X3X4項不顯著，其余項均極顯著，說明這4 個因素對類球紅細菌番茄紅素提取量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.5.3 響應(yīng)面分析與工藝優(yōu)化

根據(jù)回歸方程繪出響應(yīng)面圖及等高線圖，以確定各因素對番茄紅素提取效果的影響，響應(yīng)面圖和等高線圖見圖6。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱大小，橢圓越明顯則兩因素間交互作用越顯著。從圖6可以看出，皂化時間與提取次數(shù)及料液比與超聲時間的相互作用較顯著。

利用Minitab軟件進行試驗結(jié)果優(yōu)化得到最佳工藝條件。分別得到X1（皂化時間）=27.878 8 min、X2（料液比）=1∶85.858 6（g/mL）、X3（超聲時間）= 11.161 6 min、X4（提取次數(shù)）=2.535 4，預(yù)測提取量為9 525.92 μg/g。為檢驗該最佳提取工藝的可靠性，采用上述響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果進行番茄紅素提取的驗證實驗，考慮到實際操作可行性，將工藝條件改進為皂化時間28 min、料液比1∶86（g/mL）、超聲時間11 min、提取次數(shù)2 次，提取番茄紅素提取量為9 326.48 μg/g，與理論值的相對誤差較小，因此該類球紅細菌番茄紅素提取方法是有效可行的，具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié) 論

目前，番茄紅素相關(guān)產(chǎn)品的研究開發(fā)已成為國際功能性食品和新藥研究中的一個熱點，在國外已有以番茄紅素為主要成分的針劑類等藥物100多種[23]?？梢灶A(yù)計，未來幾年對番茄紅素產(chǎn)品的需求會越來越大，而具有經(jīng)濟、高效等特點的微生物發(fā)酵生產(chǎn)法恰好解決了這一難題[24-25]，因而建立相應(yīng)的方便快捷的、準確的番茄紅素提取方法是非常有意義的。

本研究分別用單因素試驗和響應(yīng)面法對類球紅細菌番茄紅素的提取工藝進行了優(yōu)化。單因素試驗結(jié)果顯示，丙酮為類球紅細菌番茄紅素提取的最佳有機溶劑，NaHCO3溶液為最佳皂化液，皂化時間30 min、料液比1∶75（g/mL）、超聲時間10 min、提取次數(shù)2 次為最佳提取條件。在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面法分析，對類球紅細菌番茄紅素提取工藝進行了優(yōu)化，得到了各因素對提取量影響的二次回歸模型。經(jīng)優(yōu)化得到番茄紅素提取工藝為:皂化時間27.878 8 min、料液比1∶85.858 6（g/mL）、超聲時間11.161 6 min、提取次數(shù)2.535 4?？紤]到實際操作的可行性，最后優(yōu)化的提取工藝為:皂化時間28 min、料液比1∶86（g/mL）、超聲時間11 min、提取次數(shù)2 次。經(jīng)實驗驗證，該提取方法切實可行。因此，利用響應(yīng)面法對類球紅細菌番茄紅素提取方法進行優(yōu)化，可獲得最佳工藝參數(shù)，能夠為進一步實驗研究提供理論依據(jù)。

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Optimization of Extraction Process for Lycopene from Rhodobacter sphaeroides by Response Surface Methodology

LI Dehe, WANG Junwei, ZHAO Yue*
(College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

This study aimed to optimize the extraction of lycopene from Rhodobacter sphaeroides by response surface methodology. With the extraction yield of lycopene per gram of cells as the response value, based on single factor experiments, response surface methodology was used to explore the effects of saponifi cation time, liquid-to-material ratio, ultrasonic treatment time and extraction number as well as their interactions on the extraction rate of lycopene. As a result, a regression model was established and the optimal extraction parameters were determined as 28 min saponifi cation, 11 min ultrasonic treatment and extraction performed twice using acetone as the extraction solvent with a material-to-liquid ratio of 1:86 (g/mL). Under these extraction conditions, the extraction yield of lycopene was 9 326.48 μg/g. The extraction method developed in this study is feasible and will lay a foundation for further study of industrial production of lycopene by R. sphaeroides fermentation.

Rhodobacter sphaeroides; lycopene; extraction; response surface methodology

TS201.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201510004

2014-09-30

國家自然科學(xué)基金面上項目(81374072)

李德和(1990—),男,碩士研究生,研究方向為中藥微生物代謝。E-mail：lear19900811@gmail.com

*通信作者：趙越(1955—),女,教授,學(xué)士,研究方向為中藥新劑型開發(fā)與研究。E-mail：zybmbylk688@163.com