房敬超，張曉龍，張晴，曹蕾，姜愛(ài)娜，李茜(協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司，天津300384;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

人臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠腫瘤的趨化作用

房敬超1，張曉龍2，張晴2，曹蕾1，姜愛(ài)娜1，李茜1
(1協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司，天津300384;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

摘要:目的觀察人臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)小鼠B系惡性淋巴瘤和肝癌的趨化作用。方法通過(guò)酶切、連接等方法構(gòu)建pLenti-fLuc慢病毒表達(dá)載體，利用293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒，并感染人臍帶組織華通氏膠來(lái)源的MSCs(WJ-MSCs)，使其表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶(fLuc)。分別于NOD/SCID小鼠中建立BJAB淋巴瘤細(xì)胞皮下移植模型及BALB/c裸鼠中建立HepG2肝癌原位移植瘤模型，經(jīng)尾靜脈將MSCs-fLuc注射至荷瘤小鼠體內(nèi)，采用體內(nèi)生物發(fā)光成像系統(tǒng)觀察MSCs-fLuc向腫瘤部位的遷移情況。結(jié)果成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLenti-fLuc，且經(jīng)慢病毒感染可在WJ-MSCs中穩(wěn)定表達(dá)。成功建立BJAB淋巴瘤細(xì)胞皮下移植瘤模型，MSCs-fLuc經(jīng)小鼠尾靜脈注射24 h后選擇性地定位于腫瘤部位。成功建立BALB/c裸鼠的HepG2肝癌皮下原位移植瘤模型，MSCs-fLuc經(jīng)尾靜脈注射2 d后遷移并聚集于肝臟。結(jié)論WJ-MSCs具有向小鼠淋巴瘤和肝癌歸巢的能力，此為以MSCs為載體的腫瘤靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:淋巴瘤;肝腫瘤;間充質(zhì)干細(xì)胞;生物發(fā)光成像;趨化作用;小鼠

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)為一群異質(zhì)性的非造血干細(xì)胞，具有高度增殖活性和多向分化潛能，廣泛分布于全身多種組織［1～6］。MSCs具有低免疫源性、分離純化方便、易于基因改造以及向腫瘤部位歸巢等特點(diǎn)［7～9］，已成為腫瘤靶向治療的理想載體?；铙w動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像系統(tǒng)(IVIS)通過(guò)靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器可以直接監(jiān)控生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為，相比傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。為了研究MSCs在體內(nèi)對(duì)腫瘤的趨化作用，2013年6月～2014年9月，我們用螢火蟲(chóng)熒光素酶(fLuc)標(biāo)記了人臍帶華通氏膠來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(WJMSCs)，并觀察其對(duì)小鼠B系惡性淋巴瘤和肝癌的趨化作用。

1　材料與方法

1.1材料pGL3-basic載體、慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP及包裝載體pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G由本室保存;大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2WJ-MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定從手術(shù)臺(tái)上取下的人臍帶在24 h內(nèi)進(jìn)行處理，用含雙抗的PBS沖洗臍帶，將其剪成1 cm長(zhǎng)的小塊，沖洗干凈;剝離臍帶動(dòng)靜脈血管壁，取華通氏膠部分，剪碎至0.5 cm3大小，依次擺放于預(yù)先濕潤(rùn)的T-75塑料培養(yǎng)瓶中倒置培養(yǎng); 4～8 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，次日添加1 mL 含10%FBS及2 mmol/L L-谷氨酰胺的DF-12培養(yǎng)基，連續(xù)添加3 d，第4天全量換液，以后每周換液兩次;培養(yǎng)10～14 d后，去除組織塊，用含0.125%胰酶及0.01%EDTA的細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，進(jìn)行初次原瓶傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，二次傳代(3×103/cm2)或凍存。取第3～5代的WJMSCs用于實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的WJ-MSCs，冷PBS洗滌3次，將細(xì)胞分別重懸于20 μL直標(biāo)抗體CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE中，4℃孵育1 h，PBS洗滌3次后重懸于400 μL PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)WJ-MSCs相應(yīng)表型的陽(yáng)性率。

1.3慢病毒表達(dá)載體pLenti-fLuc的構(gòu)建按照質(zhì)粒小提試劑盒(DP103-03，天根生化科技有限公司)操作步驟，利用Nhe I、BamH I雙酶切慢病毒表達(dá)載體pLenti-R和含fLuc報(bào)告基因的載體pGL3-basic。1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，并用瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒純化回收得到載體大片段和編碼熒光素酶的小片段。用T4快速連接酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接兩片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)菌，挑取單克隆于2-YT(含氨芐青霉素100 μg/mL)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。小提質(zhì)粒，用Nhe I和BamH I雙酶切鑒定，并于－80℃凍存鑒定正確的克隆。

1.4慢病毒的包裝及感染W(wǎng)J-MSCs按照無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(DP117，天根生化科技有限公司)的操作步驟同時(shí)提取3種慢病毒包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G以及慢病毒表達(dá)載體pLenti-fLuc。胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，按2×106/mL的細(xì)胞密度接種5 mL至10 cm培養(yǎng)板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。按照LipofectaminTM2000操作步驟，將4種質(zhì)粒pPACKH1-GAG(6 μg)、pPACKH1-REV(2 μg)、pVSV-G(2 μg)以及pLenti-fLuc(2 μg)共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集293T細(xì)胞培養(yǎng)上清，4℃離心(4 000 r/min，10 min)去除細(xì)胞碎片，并用0.45 μm濾器過(guò)濾。病毒上清直接用于感染細(xì)胞或－80℃中保存。取第3～5代的WJ-MSCs 按8×103個(gè)/cm2的密度接種于T-75培養(yǎng)瓶中。次日，將WJ-MSCs培養(yǎng)基換為含病毒上清的DF-12培養(yǎng)基(按MOI=8將病毒上清與新鮮含10% FBS的DF-12培養(yǎng)基混合成8 mL，同時(shí)加入polybrene，終濃度為8 μg/mL)，12 h后終止感染。WJ-MSCs經(jīng)慢病毒感染后第4天，熒光顯微鏡下觀察CopGFP熒光，0.125%胰酶消化后收集細(xì)胞用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，或液氮凍存。

1.5MSC-fLuc中報(bào)告基因fLuc的表達(dá)檢測(cè)用含fLuc報(bào)告基因的慢病毒顆粒按照MOI=8感染W(wǎng)JMSCs，使其穩(wěn)定表達(dá)fLuc。取24孔板1塊，分別加入5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105、5 ×105個(gè)細(xì)胞，并設(shè)PBS空白對(duì)照。每孔加入終濃度為150 μg/mL的D-luciferin，30 s后在IVIS上檢測(cè)生物發(fā)光情況。

1.6荷瘤小鼠模型的建立

1.6.1BJAB移植瘤模型的建立選用雌性6周齡NOD/SCID小鼠(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供) 6只，體質(zhì)量18～20 g，于SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，并對(duì)小鼠行γ射線(260 cGy/只)照射。BJAB細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BJAB細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×107/mL，于小鼠右前肢根部背側(cè)皮下接種BJAB細(xì)胞，每只小鼠接種200 μL，待腫瘤生長(zhǎng)至200～300 mm3時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6.2HepG2肝癌皮下原位移植瘤模型的建立選用雌性5周齡BALB/c裸鼠(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供) 15只，體質(zhì)量18～20 g，于SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。取其中5只皮下接種前5 h對(duì)小鼠行γ射線照射。HepG2肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM完全培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2肝癌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后用冷PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×107/mL。用帶21 G針頭的1 mL注射器于小鼠右后肢根部背側(cè)皮下接種HepG2細(xì)胞，每只小鼠接種200 μL。接種后約2周左右腫瘤成長(zhǎng)至1 cm3。原位移植參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行，脫頸處死皮下移植瘤小鼠，無(wú)菌條件下取魚(yú)肉狀瘤組織，放入含有慶大霉素的生理鹽水中漂洗，并修剪成1～2 mm3大小備用。另取10只使用2%戊巴比妥鈉以100 mg/kg的劑量行腹腔麻醉，常規(guī)消毒后沿劍突下腹中線剪開(kāi)1～2 cm，擠出肝臟，用手術(shù)刀切一小口，將瘤塊用眼科鑷放入切口約3 mm深，用生理鹽水浸潤(rùn)的紗布止血1 min以防止瘤塊脫落?？p合切口后用紅霉素眼膏涂于切口處預(yù)防感染。術(shù)后2周，脫頸處死小鼠，取肝臟、肺、脾、腎進(jìn)行病理學(xué)檢查，確定原位模型是否建立成功及有無(wú)轉(zhuǎn)移。

1.7MSCs-fLuc對(duì)腫瘤的趨化作用觀察待BJAB皮下移植瘤長(zhǎng)至200～300 mm3及HepG2肝癌原位移植瘤模型建立后，經(jīng)尾靜脈注射200 μL MSCsfLuc細(xì)胞懸液(5×105個(gè)細(xì)胞/只) ;注射24 h后，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(濃度2%)，待小鼠麻醉后按150 μg/g腹腔注射熒光素酶底物D-luciferin。10 min后，采用IVIS觀察MSCs-fLuc對(duì)腫瘤的趨化作用。

2　結(jié)果

2.1WJ-MSCs的分離及鑒定結(jié)果倒置顯微鏡下可觀察到分離的WJ-MSCs成纖維狀梭形貼壁生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀測(cè)定WJ-MSCs的表面標(biāo)志CD73、CD90、CD105陽(yáng)性率均在99%以上。

2.2MSCs-fLuc中fLuc的表達(dá)熒光顯微鏡下觀察MSCs-fLuc可見(jiàn)綠色熒光，證明MSCs-fLuc高效表達(dá)fLuc。WJ-MSCs感染后第4天，流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染效率達(dá)71.3%。IVIS觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與MSCs-fLuc的數(shù)量呈正相關(guān)。

2.3WJ-MSCs對(duì)腫瘤的趨化作用在NOD/SCID小鼠體內(nèi)成功建立BJAB皮下移植瘤模型; IVIS觀察可見(jiàn)腫瘤部位BLI信號(hào)(曝光時(shí)間為5 min)，證明在小鼠體內(nèi)WJ-MSCs向BJAB腫瘤部位定向遷移。在BALB/c裸鼠中建立人肝癌HepG2細(xì)胞的皮下原位移植瘤模型;病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，原位移植后2周，小鼠肝臟可見(jiàn)腫瘤結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)中央大片壞死，且壞死部分有大量分葉核炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其他臟器如肺、脾、腎不見(jiàn)轉(zhuǎn)移; MSCs-fLuc經(jīng)尾靜脈注射入荷瘤小鼠，24 h后IVIS觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞聚集于肝臟腫瘤部位。

3　討論

目前，有關(guān)骨髓、脂肪以及臍帶血來(lái)源的MSCs用于腫瘤治療的研究報(bào)道較多，而對(duì)于人臍帶組織WJ-MSCs介導(dǎo)的腫瘤靶向治療研究較少。WJ-MSCs除具有傳統(tǒng)骨髓來(lái)源MSCs的特點(diǎn)外還擁有其自身優(yōu)點(diǎn)，如分離方便、易于基因改造、增殖速度快、免疫源性低等，同時(shí)WJ-MSCs的使用不涉及倫理學(xué)問(wèn)題。因此WJ-MSCs越來(lái)越受到臨床及基礎(chǔ)研究的重視。MSCs的可塑性及其向損傷部位遷移的能力使其成為組織再生修復(fù)中的有利工具［11］。實(shí)體瘤浸潤(rùn)并破壞正常組織形成腫瘤微環(huán)境，同時(shí)分泌大量趨化因子及其他蛋白，這一微環(huán)境與損傷組織的微環(huán)境極為相似，因此MSCs會(huì)將腫瘤認(rèn)為是正常損傷或是炎癥部位，從而向腫瘤部位遷移。這一特點(diǎn)可使MSCs作為細(xì)胞載體用于基因治療。MSCs可將抗腫瘤藥物(細(xì)胞因子、干擾素、凋亡誘導(dǎo)劑等)運(yùn)輸至腫瘤部位從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)［12，13］。

IVIS是運(yùn)用生物發(fā)光或熒光報(bào)告基因來(lái)追蹤標(biāo)記細(xì)胞在體內(nèi)活動(dòng)過(guò)程的一項(xiàng)成像技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)中我們將fLuc標(biāo)記的WJ-MSCs注射至荷瘤小鼠體內(nèi)，趨化到腫瘤部位的MSCs表達(dá)fLuc，在底物熒光素以及氧、ATP的存在下通過(guò)酶促反應(yīng)產(chǎn)生光子，產(chǎn)生的光子可被IVIS檢測(cè)到。IVIS方便、靈敏，為體內(nèi)觀察細(xì)胞的動(dòng)向提供了直觀、可靠的數(shù)據(jù)。本研究采用IVIS觀察發(fā)現(xiàn)WJMSCs經(jīng)尾靜脈注射24 h后聚集于腫瘤部位。有研究對(duì)MSCs的趨化作用解釋為MSCs跨過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞而被某種組織的脈管系統(tǒng)捕獲的過(guò)程［14］，但MSCs趨化作用的具體機(jī)制尚未闡明。目前，普遍認(rèn)為MSCs表面的趨化因子受體在相應(yīng)趨化因子或細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下使其發(fā)生定向遷移;其中依賴CXCR4-SDF-1相互作用產(chǎn)生的遷移在腎細(xì)胞癌［15］、乳腺癌［16］等惡性腫瘤中也存在。本研究?jī)H觀察了WJ-MSCs對(duì)淋巴瘤及肝癌的趨化作用，而且其中涉及的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Chemotaxis of mesenchymal stem cells in human umbilical cord tissues on tumor in mice

FANG Jing-chao1，ZHANG Xiao-long，ZHANG Qing，CAO Lei，JIANG Ai-na，LI Qian
(1 Union Stemcell＆Gene Engineering Co.LTD，Tianjin 300384，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the tropism of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (MSCs) for malignant lymphoma of B department and liver carcinoma by using in vivo bioluminescent imaging system (IVIS).Methods The lentivirus expression vector pLenti-fLuc was constructed by restriction enzyme cleavage and linkage.Human umbilical cord Wharton＇s Jelly-derived MSCs (WJ-MSCs) were labeled with firefly luciferase (fLuc) by stable transfection with lentivirus which had been packaged in 293T cells.To demonstrate the tumor tropism of WJ-MSCs，MSC.fLuc were injected intravenously into NOD/SCID mice bearing BJAB lymphoma or BALB/c nude mice which burdened hepatocellular carcinoma in situ with HepG2cells，and the migration in vivo was monitored by IVIS.Results The lentivirus expression vector pLenti-fLuc was successfully constructed，and the expression of fLuc was stable in WJ-MSCs by transfection with lentivirus.The subcutaneous BJAB lymphoma xenograft model was successfully established in NOD/SCID mice，and MSC.fLuc migrated to tumor site after 24 hours by intravenous injection.The HepG2orthotopic hepatocarcima model was successfully established in BALB/c nude mice.When it was injected intravenously，MSC.fLuc＇s tropism for liver was found 48 hours later.Conclusion WJ-MSCs have the capacity of tumor tropism for lymphoma and hepatocarcima，and it provides basis for tumor-targeting therapy which uses MSCs as the vector.

Key words:lymphoma; liver neoplasms; mesenchymal stem cells; bioluminescence imaging; chemotaxis; mice

(收稿日期:2015-02-12)

通信作者簡(jiǎn)介:李茜(1961-)，女，副研究員，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。E-mail: 1360501260@ qq.com

作者簡(jiǎn)介:第一房敬超(1980-)，女，實(shí)習(xí)研究員，主要從事臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞腫瘤趨化研究。E-mail: fangjch_80@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30971291)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)21-0001-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R73-3; R394

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.001