吳炳山，程宏偉，王衛(wèi)紅，李志范，謝玉環(huán)，何昊沅，楊露露，董浩(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥230032)

EGCG對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞SHP1表達(dá)的影響

吳炳山，程宏偉，王衛(wèi)紅，李志范，謝玉環(huán)，何昊沅，楊露露，董浩
(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥230032)

摘要:目的觀察表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)處理后人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞SHP1表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況的變化，并探討其對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法以不同濃度的EGCG處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化，RT-PCR及Western blotting法檢測(cè)U251細(xì)胞SHP1基因及蛋白表達(dá)，MSP法檢測(cè)EGCG處理后SHP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化。結(jié)果經(jīng)不同濃度EGCG處理后，U251細(xì)胞增殖被抑制，EGCG的抑制作用呈濃度依賴性; U251細(xì)胞中SHP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量及蛋白表達(dá)水平明顯升高; SHP1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，由高甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)榈图谆?。結(jié)論EGCG可能通過(guò)引起人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞SHP1啟動(dòng)子區(qū)去甲基化使SHP1表達(dá)增加，從而抑制細(xì)胞增殖。

關(guān)鍵詞:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯;細(xì)胞增殖;蛋白酪氨酸磷酸酶; DNA甲基化

膠質(zhì)母瘤是最常見(jiàn)的并最有侵襲性的惡性原發(fā)腦腫瘤，惡性程度高，治療效果差，對(duì)人類健康危害極大［1，2］。多酚是一類提取于蔬菜水果的化合物的統(tǒng)稱，除了具有抗氧化作用，還具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是一種常見(jiàn)多酚，在綠茶中含量很高;研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，但作用機(jī)制目前尚不清楚［3］。SHP1是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的重要成員，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［4］。2014年7 ～12月，我們使用EGCG處理膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，檢測(cè)其SHP1的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況的變化，進(jìn)一步探討其對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料U251細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司，EGCG購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，PCR試劑購(gòu)自TAKaRa公司，Cell Counting Kit-8購(gòu)自Dojindo公司，Rabbit anti-SHP1 Antibody購(gòu)自CST公司，Goat anti-Rabbit HRP-IgG(H+ L) Antibody購(gòu)自中杉金橋公司，引物合成由Invitrogen公司完成，基因測(cè)序由上海生工公司完成。

1.2U251細(xì)胞培養(yǎng)U251細(xì)胞用含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，酌情加入或不加入青霉素、鏈霉素，置于37℃含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)70%～80%時(shí)傳代。吸去培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的PBS洗1次，棄去PBS，加入預(yù)熱的0.25%的胰蛋白酶(直徑10 cm平皿加入約1 mL)消化約2 min，并在倒置顯微鏡下觀察。不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，至細(xì)胞基本回縮變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞與底脫離，加入適量預(yù)熱新鮮全培養(yǎng)基中和胰酶，小心吹打使細(xì)胞與壁脫離，防止聚集成團(tuán)。細(xì)胞以1 000 r/min離心5 min，重懸，可直接根據(jù)經(jīng)驗(yàn)按1∶5～1∶3傳代，或計(jì)數(shù)后按實(shí)驗(yàn)需要傳代。每周約傳代兩次，保持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。傳代后的細(xì)胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3EGCG處理U251細(xì)胞EGCG 50 mmol/L溶于無(wú)菌水中，－20℃保存，使用前解凍，原則上不反復(fù)凍融。處理前1 d細(xì)胞計(jì)數(shù)傳代，24 h后細(xì)胞生長(zhǎng)70%～80%匯合。按需要濃度取相應(yīng)量EGCG，加入到預(yù)熱后的新鮮全培養(yǎng)基中，反復(fù)吹打使之充分溶解。吸除培養(yǎng)板內(nèi)的陳舊培養(yǎng)基，加入含有藥物的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)到指定時(shí)間，收集細(xì)胞備用。

1.4U251細(xì)胞增殖抑制測(cè)定采用CCK-8法。在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液，每孔加入5 ×103～1×104個(gè)細(xì)胞，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h。更換新鮮培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板中加入含EGCG不同濃度(0、12.5、25、50、100、200 μmol/L)的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度，得出EGCG不同濃度處理后U251細(xì)胞存活率，并作出細(xì)胞增殖抑制曲線。

1.5U251細(xì)胞SHP1基因表達(dá)檢測(cè)采用RTPCR法。將細(xì)胞樣品使用Total RNA KitⅠ提取細(xì)胞RNA，紫外分光光度測(cè)定儀測(cè)定RNA樣品在波長(zhǎng)260、280 nm處的吸光度A260和A280，根據(jù)A260/A280比值，估測(cè)RNA質(zhì)量。用TaKaRa公司PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit將提取的細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用TaKaRa公司Premix Ex TaqTMVersion 2.0 (Loading dye mix)以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增，測(cè)定SHP1基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6U251細(xì)胞SHP1蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting法。將細(xì)胞樣品裂解，提取細(xì)胞總蛋白(裂解液中加入Halt蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)，測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，而后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉，分別加入一抗和二抗孵育，洗膜后發(fā)光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.7EGCG處理后SHP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)采用MSP法。使用TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit提取基因組，提取得到的基因組DNA通過(guò)吸光度測(cè)定后定量，而后將DNA用NaOH及對(duì)苯二酚處理后加入亞硫酸氫鈉避光水浴進(jìn)行修飾并純化，最后行PCR擴(kuò)增及核酸電泳。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用珋x±s表示，并進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1EGCG對(duì)U251細(xì)胞增殖的抑制作用不同濃度(0、12.5、25、50、100、200 μmol/L) EGCG處理U251細(xì)胞24 h后細(xì)胞增殖抑制情況見(jiàn)圖1。U251細(xì)胞經(jīng)12.5 μmol/L EGCG處理后對(duì)其增殖無(wú)明顯影響，而經(jīng)25 μmol/L及以上濃度的EGCG處理后，增殖明顯抑制。即隨著EGCG濃度的增高，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用增強(qiáng)，EGCG對(duì)U251細(xì)胞增殖的抑制呈濃度依賴性(P＜0.05)。

2.2EGCG處理后U251細(xì)胞中SHP1基因及蛋白表達(dá)經(jīng)0、40、80 μmol/L的EGCG處理后U251細(xì)胞中SHP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00± 0.00、2.48±0.11、4.34±0.19，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。不同濃度EGCG處理后U251細(xì)胞中SHP1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3EGCG處理后U251細(xì)胞SHP1啟動(dòng)子區(qū)的去甲基化狀態(tài)經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT) DAC處理證實(shí)在U251細(xì)胞中SHP1啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化;經(jīng)40 μmol/L EGCG處理后U251細(xì)胞的SHP1啟動(dòng)子的甲基化水平發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，即由高甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)榈图谆?，在凝膠電泳上表示為甲基化條帶消失，證實(shí)EGCG 對(duì)SHP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的翻轉(zhuǎn)作用。見(jiàn)圖3。

3　討論

對(duì)腫瘤來(lái)說(shuō)，DNA甲基化是一種保持基因長(zhǎng)期沉默的手段;通常情況下，DNA甲基化狀態(tài)應(yīng)受到嚴(yán)格控制。但在一些特殊情況下，DNA甲基化的狀態(tài)可能發(fā)生變異，由此對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控就有所松動(dòng)，這是腫瘤發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的高度甲基化和全基因組的低甲基化促進(jìn)了腫瘤基因表達(dá)的沉默和整個(gè)基因組狀態(tài)的不穩(wěn)定［5］。全基因組低甲基化與癌細(xì)胞染色質(zhì)重構(gòu)和核異常息息相關(guān)，引發(fā)了染色體的不穩(wěn)定。不過(guò)，DNA甲基化狀態(tài)是可以改變的。表觀遺傳調(diào)控有關(guān)的治療可使DNA甲基化的狀態(tài)恢復(fù)正常，并防止細(xì)胞繼續(xù)發(fā)生甲基化，從而使一些基因的表達(dá)沉默。使用去甲基化藥物可以控制細(xì)胞的增殖、分化、調(diào)亡以及其他內(nèi)環(huán)境狀態(tài)。抑制DNMT活性是降低DNA甲基化最有效的一種方法［6，7］。DNA甲基化抑制劑有兩大類，一類是擬核苷劑［8，9］，一類是非擬核苷劑。有研究將DNA甲基化抑制劑和組蛋白去乙?；种苿┙Y(jié)合起來(lái)，發(fā)現(xiàn)二者在抑制腫瘤的基因表達(dá)和生長(zhǎng)方面有協(xié)同作用［10］。

EGCG是綠茶中最為常見(jiàn)的活性成分，其能夠通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí)EGCG能夠抑制U251細(xì)胞的增殖，并且這一抑制作用隨著EGCG濃度增大而增強(qiáng)。有研究報(bào)道，EGCG能夠引起多種腫瘤細(xì)胞的周期停滯［3］，但至于是引起G1期還是G2/M期停滯，依據(jù)細(xì)胞不同而不同，較低濃度的EGCG即能引起細(xì)胞周期停滯［3］。另外，G2/M期停滯可以引起細(xì)胞調(diào)亡，起到抑制腫瘤的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在人類膠質(zhì)瘤組織中SHP1因?yàn)閱?dòng)子區(qū)高度甲基化而表達(dá)被沉默，并且發(fā)現(xiàn)SHP1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的SHP1啟動(dòng)子序列內(nèi)的CpG島去甲基化，并從轉(zhuǎn)錄水平提高SHP1的表達(dá)。事實(shí)上，SHP1確實(shí)能夠通過(guò)啟動(dòng)子區(qū)去甲基化的改變而調(diào)節(jié)表達(dá)［11］。當(dāng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中SHP1表達(dá)升高，細(xì)胞增殖受到抑制。因此，EGCG引起SHP1的表達(dá)升高可能會(huì)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡中起作用。由此推測(cè)，EGCG是通過(guò)表觀遺傳調(diào)節(jié)作用，使SHP1啟動(dòng)子區(qū)去甲基化調(diào)節(jié)其表達(dá)，從而起到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用。另外，異常的DNA甲基化狀態(tài)也有可能由組蛋白修飾狀態(tài)所調(diào)節(jié)，特別是組蛋白賴氨酸的乙?；GCG能夠抑制CBP/p300，從而通過(guò)抑制組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶削弱組蛋白的乙酰化狀態(tài)。

綜上所述，EGCG可能通過(guò)引起人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞SHP1啟動(dòng)子區(qū)去甲基化使SHP1的表達(dá)增加，從而抑制U251細(xì)胞增殖。此為表觀遺傳途徑治療膠質(zhì)瘤提供了依據(jù)，也為SHP1作為膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)提供了線索。

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·基礎(chǔ)研究·

Influence of EGCG on SHP1 expression in human glioblastoma U251 cell line

WU Bing-shan，CHENG Hong-wei，WANG Wei-hong，LI Zhi-fan，XIE Yu-huan，HE Hao-yuan，YANG Lu-lu，DONG Hao
(The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Abstract:Objective To observe the SHP1 expression changes and methylation in the promoter region of human glioblastoma U251 cell line after the treatment of Epigallocatechin Gallate(EGCG)，and to investigate the effect and mechanism of EGCG on the cell proliferation of U251 cell line.Methods U251 cells in the logarithmic phase were treated by different concentrations of EGCG.The cell proliferation was detected by CCK-8.The SHP1 gene and protein expression of U251 cells was evaluated by RT-PCR or Western blotting.MSP was used to testify methylation in the promoter region of SHP1 after EGCG treatment.Results After the treatment of different concentrations of EGCG，the proliferation of U251 cell was inhibited，and the inhibitory effect was in a concentration-dependent manner.The SHP1 mRNA and protein expression was elevated in U251 cells，and the promoter methylation of SHP1 was reversed from hypermethylation to hypomethylation.Conclusions EGCG may increase SHP1 expression by causing the methylation in the promoter region of SHP1 of the human glioblastoma U251 cell line，and thus inhibit the proliferation of U251 cell.

Key words:glioblastoma; Epigallocatechin Gallate; cell proliferation; protein tyrosine phosphatase; DNA methylation

(收稿日期:2015-03-12)

通信作者簡(jiǎn)介:程宏偉(1975-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槟X部腫瘤的發(fā)病機(jī)制及臨床治療。E-mail: chw001@163.com

作者簡(jiǎn)介:第一吳炳山(1985-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)槟z質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制及臨床治療。E-mail: wubingshan@ gmail.com

文章編號(hào):1002-266X(2015)21-0020-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R739.41

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.007