單莉，郝春妮(煙臺山醫(yī)院，山東煙臺264001)

宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞計數變化及意義

單莉，郝春妮
(煙臺山醫(yī)院，山東煙臺264001)

摘要:目的觀察宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞的表達變化，并探討其意義。方法108例宮頸鱗狀細胞癌患者，手術切除腫瘤組織，免疫組化學染色觀察宮頸鱗狀細胞癌組織中、Foxp3+、GranzymeB+、細胞的分布，同時對其進行計數。分析其與患者臨床病理參數和預后的關系。結果宮頸鱗狀細胞癌患者Foxp3+細胞數量癌內大于癌周、細胞數量癌周大于癌內(P均＜0.05)。宮頸鱗狀細胞癌組織中細胞數量與臨床分期有關，Foxp3+細胞數量與病理分級有關和Foxp3+細胞數量與淋巴轉移有關(P均＜0.05)。宮頸鱗狀細胞癌組織Foxp3+細胞與患者無瘤生存時間呈負相關(HR: 2.217，95%CI: 1.843～2.671，P=0.012)，與總生存時間呈負相關(HR: 2.451，95% CI: 1.992 ～2.734，P=0.033)。結論宮頸鱗狀細胞癌組織內、細胞數量增多，Foxp3+細胞數量減少。Foxp3+細胞是宮頸鱗狀細胞癌術后的獨立預后因素。

關鍵詞:宮頸腫瘤;宮頸鱗狀細胞癌;免疫微環(huán)境;免疫逃逸;腫瘤浸潤淋巴細胞

宮頸鱗狀細胞癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女的健康和生命。關于宮頸鱗狀細胞癌的預后因素研究一直聚焦于腫瘤細胞本身，較少研究與腫瘤局部免疫微環(huán)境指標的關系。腫瘤浸潤淋巴細胞是存在于腫瘤間質內以T細胞為主的一種異質性淋巴細胞群體，是機體淋巴細胞浸入到腫瘤組織內部對腫瘤的抵抗現象，它們的抗腫瘤免疫效應主要是細胞免疫反應［1，2］。本研究主要的腫瘤浸潤淋巴細胞的亞型有、Foxp3+細胞，暫未列入細胞［3，4］。本研究觀察了宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞的表達變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2010年1月～2014年12月在煙臺山醫(yī)院住院手術的宮頸鱗狀細胞癌患者108例，年齡35～72(45.3±9.6)歲，均有完整的臨床病理資料。依據國際婦產科聯(lián)盟(FIGO，2000年)修訂的臨床分期標準，Ⅰ期42例、Ⅱ期31例、Ⅲ期35 例;病理分級: G1級30例、G2級43例、G3級35例;有淋巴結轉移41例?；颊呔惺中g完整切除腫瘤，組織學檢查切緣陰性。排除標準:曾接受過放化療及免疫治療;合并免疫系統(tǒng)疾病;合并慢性消耗性疾病及傳染病;合并有其他類型惡性腫瘤。

1.2腫瘤浸潤淋巴細胞檢測及其與宮頸鱗狀細胞癌患者預后的關系分析方法采用免疫組化法檢測108例宮頸鱗狀細胞癌患者腫瘤組織中NK細胞、Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg)、GranzymeB+活化的細胞毒性淋巴細胞、CD45RO+記憶T細胞、細胞毒T細胞的數量。用不同的單克隆抗體［鼠抗人CD45RO、鼠抗人CD57、兔抗人CD8、鼠抗人GranzymeB購自Maixin-Bio(邁新生物)，Foxp3+抗體購自BioLegend(USA)］對上述細胞行免疫組化染色。二抗為Leica-二抗套裝試劑。采用Leica公司的全自動免疫組化染色一體機，所有步驟由Bond-Max自動完成。在400倍高倍顯微鏡下觀察陽性細胞(細胞膜或細胞核呈棕色或棕黑色顆粒者判定為陽性細胞)。采用電腦圖像采集系統(tǒng)隨機選取5個高倍視野拍照，再用圖像分析軟件(NIH Image 1.46 bundled with 64-bit Java)計算總陽性細胞數。由2位高年資病理科醫(yī)師讀片，采取雙盲交叉讀片，取平均值?；颊吲R床病理資料包括年齡、臨床分期、淋巴結轉移情況、腫瘤分化程度、術后復發(fā)轉移情況等。生存期從手術當天計算，終止日期為死亡日期或末次隨訪日，所有病例截止日期為2014年6月31日。對可疑復發(fā)者進行強化CT和(或) MR掃描來確診復發(fā)/轉移。分析上述免疫細胞與患者臨床病理參數和預后的關系。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用one-way ANOVA，兩組間比較用t檢驗;計數資料比較用χ2檢驗或Fisher精確檢驗;相關分析采用Spearman相關;累積生存時間和累積生存率計算采用Kaplan-Meier法，生存檢驗采用Log-rank檢驗;用Cox回歸模型作單因素和多因素與預后關系的分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞的分布、數量除Foxp3+陽性染色細胞為細胞核棕色著色外，其余細胞均呈細胞質和(或)細胞膜棕色染色。細胞呈圓形或橢圓形，散在分布于腫瘤細胞和周圍間質中，沒有明顯的密集趨勢。GranzymeB+陽性染色呈顆粒狀的細胞質著色，細胞無密集趨勢，均散在分布于癌組織、周圍增生的纖維組織中，棕色陽性顆?？森h(huán)繞細胞呈圓形或半圓形。CD45RO+陽性細胞呈細胞質或細胞膜棕褐色，細胞體積較小，大部分彌散性分布。細胞為細胞膜和細胞質呈棕黃色染色的小圓細胞。宮頸鱗狀細胞癌患者癌內、癌旁組織中細胞分別為30.15±細胞分別為340.53±50.11、430.29±38.74，GranzymeB+細胞分別為29.03±1.53、40.37±3.42細胞分別為128.71 ±22.73、240.38±37.97，Foxp3+細胞分別為31.03 ±2.41、19.32±3.56，兩者比較，P均＜0.05。

2.2宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞與患者臨床病理參數的關系宮頸鱗狀細胞癌組織中細胞數量與患者臨床分期有關(P均＜0.05)，腫瘤臨床分期越高細胞局部浸潤越少。宮頸鱗狀細胞癌組織中Foxp3+和細胞數量與患者病理分級有關(P均＜0.05)，腫瘤分化越差患者Foxp3+細胞越多，腫瘤分化越好患者細胞越多。宮頸鱗狀細胞癌組織中細胞數量與患者淋巴轉移有關(P均＜0.05)，有淋巴轉移的患者Foxp3+細胞越多，無淋巴轉移的細胞越多。詳見表1。

表1　宮頸鱗狀細胞癌組織中浸潤淋巴細胞數量與患者臨床病理參數的關系(個，±s)

臨床病理參數　n　CD+57　CD45RO+　GranzymeB+　CD+8　Foxp3+年齡≤40歲　35　29.65±2.56　346.78±98.54　28.43±6.21　126.65±23.97　30.23±4.56 ＞40歲　73　30.42±6.16　334.53±65.11　29.85±3.47　130.91±31.17　31.77±7.23臨床分期Ⅰ42　28.32±3.61　394.28±64.14　29.72±5.33　149.83±25.14　28.41±4.34 Ⅱ31　31.77±2.79　336.43±23.77　28.63±2.37　124.74±35.36　30.28±5.16 Ⅲ35　29.32±1.57　287.24±71.35　29.09±3.24　96.23±13.42　30.13±3.75病理分級G1　30　27.57±9.47　380.79±31.11　30.41±2.31　121.37±13.41　36.24±5.6 G2　43　29.91±3.04　326.88±26.12　29.04±4.27　128.43±13.54　30.27±1.02 G3　35　28.97±1.45　286.27±24.41　28.78±3.44　128.17±12.87　25.97±3.47淋巴轉移有41　31.22±3.82　328.59±79.31　27.13±1.25　106.43±18.64　39.27±3.86 無67　28.89±2.63　357.64±81.35　29.23±3.51　147.59±18.17　22.23±4.76

2.3宮頸鱗狀細胞癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞與患者預后的關系108例患者整體的5年無瘤生存率分別為53.70%，總生存率為47.22%。中位隨訪時間為28個月(3～80個月)。主要死于腫瘤復發(fā)轉移。使用X-tile軟件計算出的最小P值作為cutoff值將各腫瘤浸潤淋巴細胞分成高浸潤組、低浸潤組。CD5+7細胞cut-off值為29.36，高浸潤組45例、低浸潤組63例; CD45RO+細胞cut-off值為310.58，高浸潤組68例、低浸潤組40例; CD8+細胞cut-off值為115.71，高浸潤組60例、低浸潤組48例; GranzymeB+細胞cut-off值為28.47，高浸潤組57例、低浸潤組51例; Foxp3+細胞cut-off值為27.17，高浸潤組49例、低浸潤組59例。COX單因素生存分析顯示，患者無瘤生存時間(DFS)與宮頸鱗狀細胞癌組織CD8+細胞(HR: 0.997，95% CI: 0.684～1.314，P=0.028)呈正相關、Foxp3+細胞(HR: 2.217，95%CI: 1.843～2.671，P=0.012)呈負相關;患者總生存時間(OS)與宮頸鱗狀細胞癌組織CD8+細胞(HR: 1.057，95%CI: 0.792～1.372，P=0.046)呈正相關、Foxp3+細胞(HR: 2.451，95% CI: 1.992～2.734，P=0.033)呈負相關;患者DFS、OS與癌組織CD5+7、CD45RO+、GranzymeB+細胞無關。COX多因素生存分析顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織Foxp3+細胞與患者DFS呈負相關(HR: 2.217，95% CI: 1.843～2.671，P=0.012)，與OS呈負相關(HR: 2.451，95%CI: 1.992～2.734，P=0.033)。

3　討論

作為腫瘤與機體作用的主要部位，腫瘤局部免疫反應在一定程度上反映了機體抗腫瘤免疫的總體水平。腫瘤局部的免疫以特異性的細胞免疫為主導，其效應細胞為細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞。NK細胞具有無需抗原刺激即能殺傷腫瘤細胞的能力。細胞毒性T淋巴細胞被一致認為是最主要的免疫效應細胞［1，5］?；罨募毎拘訲細胞以GranzymeB+為標志物?？乖禺愋杂洃汿淋巴細胞可以在特定細胞因子的作用下分化為效應T淋巴細胞，也可以像干細胞一樣自我更新、繼續(xù)分化為記憶/效應細胞，因此記憶T細胞可以作為T細胞活化標志［3，4］。Foxp3+Treg具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能。以上細胞均在局部免疫微環(huán)境中發(fā)揮著免疫監(jiān)視、免疫效應、殺傷腫瘤細胞的作用［6，7］。

本研究發(fā)現宮頸鱗狀細胞癌周圍的、細胞數量明顯多于癌內部，這表明機體在腫瘤周圍的免疫反應明顯強于腫瘤內部。進一步分析發(fā)現，宮頸鱗狀細胞癌的臨床分期越晚，細胞局部浸潤越少;腫瘤分化越差，CD45RO+細胞越少，這說明隨著病情進展，腫瘤晚期內部微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)越來越嚴重。同時，細胞在有淋巴轉移的宮頸鱗狀細胞癌中數量少于無淋巴轉移者，提示腫瘤是否發(fā)生淋巴轉移與局部免疫反應有密切關系。

本研究還發(fā)現宮頸鱗狀細胞癌內的Foxp3+細胞浸潤數量較腫瘤周圍多。說明腫瘤內微環(huán)境中，T細胞介導的免疫反應受到了抑制。類似的差異也見于許多實體腫瘤，如胃癌、肺癌等。腫瘤局部Foxp3+Treg細胞數量反映了在腫瘤內部宿主與腫瘤之間的免疫活動。有效的抗腫瘤免疫反應能抑制腫瘤細胞的潛在侵襲性，具有免疫抑制能力的Foxp3+Treg細胞則可能放任腫瘤侵襲［8，9］。這也進一步可以解釋，在較差臨床分期的宮頸鱗狀細胞癌組織中有高浸潤的Foxp3+Treg細胞?？梢?，宮頸鱗狀細胞癌局部微環(huán)境中免疫抑制與免疫效應作用的力量對比關系決定了局部的免疫狀態(tài)，并影響甚至決定了腫瘤的進展方向，局部免疫效應作用越強越不利于腫瘤生長侵襲，局部免疫抑制作用越強越有利于腫瘤侵襲轉移。

通過Cox單因素和多因素生存分析發(fā)現，宮頸鱗狀細胞癌組織內Foxp3+Treg細胞數量的多少是宮頸鱗狀細胞癌術后的獨立預后因素。有研究［10］曾報道Foxp3+Treg細胞高浸潤是胃癌的獨立預后因素?？梢?，Treg對免疫環(huán)境起負性作用，局部高浸潤Treg細胞可能直接導致宮頸鱗狀細胞癌患者有較差的預后。其可能的機制主要是通過各種途徑直接或間接抑制效應性T細胞的增殖，活化及抑制T細胞和NK細胞對腫瘤的殺傷作用［11］;引起DC細胞的凋亡［12］;競爭抑制IL-2［8］等影響效應T細胞對腫瘤的免疫應答。

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(收稿日期:2015-01-21)

文章編號:1002-266X(2015) 19-0061-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.022