林鳳，鄭君，周友珍(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京100038)

用基因芯片技術(shù)篩選人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中紫杉醇耐藥相關(guān)基因

林鳳，鄭君，周友珍
(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京100038)

摘要:目的應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中獲得性紫杉醇(TAX)耐藥相關(guān)基因。方法采用大劑量間歇誘導(dǎo)法，用TAX反復(fù)沖擊誘導(dǎo)培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株，建成Ishikawa/TAX耐藥株。應(yīng)用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0表達(dá)譜芯片檢測Ishikawa/TAX與Ishikawa細(xì)胞株基因。通過Gene Ontology (GO)聚類分析對差異表達(dá)的基因予以分類。采用qRT-PCR對部分差異表達(dá)的基因進(jìn)行驗證。結(jié)果與Ishikawa細(xì)胞相比，Ishikawa/TAX細(xì)胞中有110條基因表達(dá)有顯著性差異(ratio比值＞3)，包括87個上調(diào)基因、23個下調(diào)基因，GO分類涉及細(xì)胞信號傳導(dǎo)和調(diào)控、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞代謝及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等;其中上調(diào)最明顯的基因為S100A12，其次有CYP1B1、FUBP1、CEACAM6，下調(diào)基因有TNFAIP3、CD(44)、DKK1等。qRT-PCR檢測S100A12、CYP1B1在耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，TNFAIP3、CD(44)在耐藥細(xì)胞中低表達(dá)，與基因芯片結(jié)果一致。結(jié)論采用基因芯片技術(shù)篩選出的人子宮內(nèi)膜癌獲得性TAX耐藥相關(guān)基因的上調(diào)基因有S100A12、CYP1B1、FUBP1、CEACAM6，下調(diào)基因有TNFAIP3、CD(44)、DKK1。

關(guān)鍵詞:基因芯片技術(shù);子宮腫瘤;子宮內(nèi)膜癌;紫杉醇;耐藥基因

子宮內(nèi)膜癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，化療是子宮內(nèi)膜癌主要的輔助治療手段，用于晚期、復(fù)發(fā)和早期高?；颊摺Ｒ宰仙即?TAX)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是治療子宮內(nèi)膜癌的一線化療方案，但隨著用藥時間延長，化療耐藥的產(chǎn)生將導(dǎo)致治療失?。?，2］。了解TAX耐藥機(jī)理，對逆轉(zhuǎn)耐藥以保證化療的有效性和患者長期生存具有重要意義。本研究通過大劑量沖擊方法建立了人子宮內(nèi)膜癌TAX耐藥細(xì)胞株(Ishikawa/TAX)，應(yīng)用高通量的Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0基因芯片，比較耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞之間基因譜表達(dá)的變化，旨在篩選出與子宮內(nèi)膜癌TAX耐藥最為相關(guān)的基因，了解其耐藥機(jī)制，為臨床逆轉(zhuǎn)耐藥提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑TAX(批號: 050501)購自海南海藥股份有限公司。RNA提取試劑盒、RealqPCR Master Mix購自Exprogen公司; M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP Mix、MgCl2購自Promega公司; RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司; RNA酶抑制劑、DTT、基因芯片及雜交試劑購自Affymetrix公司; TaqDNA聚合酶、real-time PCR試劑盒購自TaKaRa公司; Primers購自Invitrogen公司;小牛血清購自北京鼎國生物有限公司。

1.2Ishikawa/TAX耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa(由Nishida等1985年建株，北京大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科魏麗惠教授饋贈，本實驗室傳代保存)均培養(yǎng)在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，含2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入濃度為300 μg/mL的TAX作用2 h，PBS洗3遍，用普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時傳代1次，同法進(jìn)行第2次處理。如此反復(fù)處理13次，歷時8個月建成Ishikawa/TAX耐藥細(xì)胞株。MTT法檢測其耐藥性，計算耐藥指數(shù)。Ishikawa/TAX的群體倍增時間(Td)為(30.41±2.89) h，半數(shù)致死濃度(IC50)為(14.674±0.326)μg/mL; Ishikawa細(xì)胞Td為(20.56±2.67) h，IC50為(2.81±0.346)μg/mL，其耐藥指數(shù)為5.23 ±0.49，屬于中度耐藥。撤藥培養(yǎng)2個月后復(fù)測IC50不變;細(xì)胞凍存3個月后復(fù)蘇，其耐藥性穩(wěn)定。取對數(shù)生長期Ishikawa及Ishikawa/TAX細(xì)胞，按TRIzol一步法抽提細(xì)胞總RNA，QIAGEN RNeasy Kit進(jìn)一步純化總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA含量，RIN鑒定RNA完整性。瓊脂糖凝膠電泳顯示28 S、18 S兩條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，表示RNA完整性良好，符合基因芯片標(biāo)準(zhǔn)。

1.3基因芯片的制備及相關(guān)基因檢測由RNA合成雙鏈DNA，以O(shè)ligo dT Primer為引物反轉(zhuǎn)錄合成第二鏈cDNA，然后經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄生成標(biāo)記有生物素的cRNA，純化的cRNA片段化為35～200 bp的小片段，再與Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0芯片雜交，反復(fù)洗滌后染色，用GeneChip?Scanner 3000掃描芯片的熒光信號圖像。用基因芯片操作軟件GCOS1.2對圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)定量處理和分析，差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為T檢驗P＜0.05且差異倍數(shù)＞2。根據(jù)Gene Ontology(GO，http://www.geneontology.org)及Netaffy(http://www.affymetrix.com)對基因的注釋，對差異顯著的基因按照分子功能、細(xì)胞組分及生物學(xué)行為進(jìn)行分類，再按生物學(xué)行為做GO聚類分析，并在GenBank中明確其功能。

1.4差異表達(dá)部分基因的mRNA檢測采用qRTPCR進(jìn)行驗證。根據(jù)GenBank人類基因的cDNA序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer5.0設(shè)計引物，引物由美國Invitrogen公司合成。提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR及預(yù)實驗，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物在100 bp附近有擴(kuò)增條帶，證明為陽性。再行SYBR GREEN real-time PCR檢測。取定量PCR專用的96孔板，每孔加入cDNA 1 μL、RealqPCR Master Mix 12 μL、引物F/R(上下游引物的終濃度各為15 pmol/μL) 0.5/0.5 μL，用雙蒸水補(bǔ)足體系至25 μL，封膜，用ABI7900HT定量PCR儀進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)條件:先50℃、2 min，95℃、10 min;然后95℃、15 s，60℃、1 min，共40個循環(huán)(生成擴(kuò)增曲線) ;最后95℃、15 s，60℃、15 s，95℃、15 s(生成溶解曲線)。記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值。利用管家基因?qū)δ康幕虻谋磉_(dá)進(jìn)行校正，得出相對定量結(jié)果。每次反應(yīng)均做3個復(fù)孔，Ct值取其均值。以18 S作為內(nèi)參照，同時以親代細(xì)胞Ishikawa作為基準(zhǔn)，Ishikawa/TAX耐藥細(xì)胞mRNA的表達(dá)量表示成親代細(xì)胞的N倍。N=2－ΔΔCt，樣品Ct－基準(zhǔn)Ct=(Ct樣品－Ct樣品18S)－(Ct基準(zhǔn)－Ct基準(zhǔn)18S)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

共篩選出1 400余條差異基因。通過提高篩選標(biāo)準(zhǔn)(ratio值＞3)同時去除轉(zhuǎn)錄本重復(fù)及功能尚未明確的基因后，發(fā)現(xiàn)Ishikawa/TAX耐藥細(xì)胞與Ishikawa細(xì)胞之間有110條基因差異顯著，其中87條在耐藥株中上調(diào)，23條在耐藥株中下調(diào)。110條差異基因的生物學(xué)功能主要集中在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控、細(xì)胞黏附、細(xì)胞代謝及轉(zhuǎn)錄等幾個方面。通過對篩選出的基因進(jìn)一步分析，挑選出了7條與耐藥關(guān)系最密切的基因(詳見表1)。其中，Ishikawa/TAX耐藥細(xì)胞株中S100A12和CYP1B1的mRNA表達(dá)分別是Ishikawa細(xì)胞的39.397倍、2.497倍，TNFAIP3、CD44的mRNA表達(dá)是Ishikawa細(xì)胞的0.473倍、0.902倍，兩者比較，P均＜0.05。結(jié)果與基因芯片一致，該基因芯片結(jié)果的可信性高。

3　討論

TAX化療耐藥的產(chǎn)生機(jī)制可能是一個多基因、多因素、多步驟的復(fù)雜生物過程，涉及腫瘤細(xì)胞、機(jī)體、靶組織的相互影響和作用，涉及一系列腫瘤相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和信號傳導(dǎo)?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、大規(guī)模、高靈敏性、高度自動化和重復(fù)性的特點，是尋找耐藥相關(guān)基因以及了解各基因之間復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系的最好方法［3］。人類全基因組Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0表達(dá)譜芯片包括人類全基因組47 000個轉(zhuǎn)錄本，代表了38 500個明晰的人類基因，其強(qiáng)有力的探針集以及一個轉(zhuǎn)錄本有多重獨(dú)立探針檢測，提供了最大的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，是目前研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展和化療耐藥機(jī)理最有效的方法。能幫助我們從分子水平全面了解腫瘤耐藥機(jī)制，尋找腫瘤耐藥標(biāo)志物，發(fā)掘腫瘤耐藥的基因治療的有效靶點，對腫瘤的早期診斷、個體化治療、預(yù)后判斷等有其他方法不可比擬的優(yōu)勢［4，5］。

本實驗通過該芯片技術(shù)檢測了子宮內(nèi)膜癌TAX耐藥細(xì)胞Ishikawa/TAX與敏感細(xì)胞之間的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有110條基因差異顯著，其中87條在耐藥株中上調(diào)、23條在耐藥株中下調(diào)。根據(jù)GO 及Netaffy對基因的注釋，再對這些基因進(jìn)行分子功能及生物學(xué)行為GO聚類分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因分別屬于多個分子功能家庭，參與多個生物過程。通過對篩選出的基因進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)有7個差異表達(dá)基因可能參與了Ishikawa/TAX細(xì)胞的耐藥機(jī)制，其中上調(diào)最明顯的基因為S100A12，其次為CYP1B1、FUBP1、CD66c;明顯下調(diào)的基因有TNFAIP3、CD44、DKK1。其編碼蛋白涉及細(xì)胞信號傳導(dǎo)和調(diào)控、細(xì)胞黏附及氧化還原反應(yīng)等。我們選擇了涉及NF-κB信號通路基因S100A12、TNFAIP3及細(xì)胞黏附分子CD44、CYP1B1基因進(jìn)行了進(jìn)一步的驗證，結(jié)果與芯片一致。

NF-κB是一種重要的細(xì)胞核轉(zhuǎn)入因子，除了參與炎癥、免疫、細(xì)胞分化及凋亡等生理功能外，還與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤及化療耐藥有關(guān)［6］?；熕幬锛せ頝F-κB/IκB信號通路是產(chǎn)生誘導(dǎo)性耐藥的重要機(jī)制。NF-κB/IκB信號通路的過度活化，是導(dǎo)致卵巢癌耐藥細(xì)胞COC1/DDP對順鉑耐藥的重要原因之一。Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的化療耐藥也與高水平的Nrf2密切相關(guān)［7］。S100A12是近年發(fā)現(xiàn)的S100蛋白家族成員之一，通過正向調(diào)控NF-κB的級聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮促炎、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗微生物等生物學(xué)功能。關(guān)于S100A12與化療耐藥的關(guān)系尚未見報道。TNFAIP3又稱鋅指蛋白A20，是一種具有抗細(xì)胞凋亡及抑制NF-κB活化雙重功能的胞液蛋白。在耐藥細(xì)胞株中，TNFAIP3的持續(xù)低表達(dá)可能通過激發(fā)RIP依賴的信號級聯(lián)反應(yīng)從而調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞生存，降低細(xì)胞凋亡水平，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥。本實驗發(fā)現(xiàn)，S100A12在Ishikawa/TAX耐藥株中表達(dá)上調(diào)最明顯，TNFAIP3在耐藥株中表達(dá)明顯下調(diào)，推測S100A12、TNFAIP3基因可能通過調(diào)控NF-κB信號通路及細(xì)胞凋亡，在子宮內(nèi)膜癌對TAX的獲得性耐藥中起主要作用。

CYP1B1基因為CYP1B1亞族的惟一成員，與其他P450酶不同，其在正常組織中不表達(dá)或表達(dá)水平很弱，但在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)過量［8，9］。CYP450是體內(nèi)重要氧化還原酶系，可以催化眾多的內(nèi)源性物質(zhì)如脂肪酸、類固醇激素、外源性物質(zhì)和進(jìn)入體內(nèi)的藥物的代謝，使藥物失活加速。Martinez等［10］研究發(fā)現(xiàn)，TAX是p糖蛋白外排轉(zhuǎn)運(yùn)的底物，主要通過細(xì)胞色素P450酶代謝。CYP1B1基因mRNA和蛋白的表達(dá)量在一定程度上能夠反映卵巢癌細(xì)胞對TAX的敏感性，可能由于高表達(dá)的CYP1B1酶增加了對TAX的代謝而導(dǎo)致耐藥。本實驗發(fā)現(xiàn)CYP1B1在Ishikawa/TAX耐藥株中上調(diào)最明顯，提示它可能通過氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)TAX耐藥。

CD44是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，其正常功能是作為透明質(zhì)酸受體參與細(xì)胞—細(xì)胞、細(xì)胞—基質(zhì)之間的特異性黏附過程。CD44與宮頸癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。Zieker等［11］報道，CD44表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致多細(xì)胞團(tuán)簇化療耐藥。CD44和抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而BcL-2家族蛋白持續(xù)高表達(dá)又是引起多細(xì)胞團(tuán)簇化療耐藥的原因。本實驗結(jié)果顯示，在耐藥株中CD44表達(dá)明顯下調(diào)，提示細(xì)胞黏附分子參與了TAX的獲得性耐藥過程，與文獻(xiàn)報道一致。

子宮內(nèi)膜癌TAX化療耐藥是一個多基因、多環(huán)節(jié)、多途徑參與的過程，可能涉及影響不同生化途徑的多群遺傳因子表達(dá)的改變。本實驗利用基因芯片技術(shù)，通過生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)的方法，篩選和鑒定了子宮內(nèi)膜癌TAX獲得性耐藥細(xì)胞Ishikawa/TAX的基因表達(dá)譜。為進(jìn)一步研究TAX耐藥的分子機(jī)理、尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的靶點和方法提供了線索。

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·基礎(chǔ)研究·

Application of gene chip technology for screening and identifying taxol-resistant related genes in human endometrial carcinoma cell line

LIN Feng，ZHENG Jun，ZHOU You-zhen
(Beijing Shijitan Hospital of Capital Medical University，Beijing 100038，China)

Abstract:Objective To screen and identify the acquired taxol (TAX) -resistant related genes in human endometrial carcinoma cell line by applying gene chip technology.Methods We established the Ishikawa/taxol (TAX) -resistant cell line by intermittent and repeated exposure to TAX of a high concentration on the human endometrial carcinoma cell line Ishikawa.The genes of Ishikawa/TAX and Ishikawa cells were examined by using Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0 expression profile chip.The differentially expressed genes were classified by Gene Ontology (GO) cluster analysis.Realtime quantitative PCR (qRT-PCR) was performed to confirm part of the differentially expressed genes.Results Compared with Ishikawa cells，there were 110 significantly differential expression genes in Ishikawa/TAX cells (ratio＞3)，of which the up-regulated and down-regulated genes were 87 and 23，respectively.The classification of GO involved the cell signal transduction and regulation，cell adhesion molecule，cell metabolism and transcription regulation，etc.S100A12 was upregulated significantly，followed by CYP1B1，F(xiàn)UBP1 and CEACAM6.TNFAIP3，CD(44)and DKK1 were significantly downregulated.The qRT-PCR showed that S100A12 and CYP1B1 was highly expressed in the drug-resistant cells，and TNFAIP3 and CD(44)was lowly expressed in the drug-resistant cells，which coincided well with the results of cDNA microarray.ConclusionGene chip technology screens that the up-regulated genes of acquired TAX-resistant related genes in human endometrial carcinoma cell line are S100A12，CYP1B1，F(xiàn)UBP1 and CEACAM6，and the down-regulated genes are TNFAIP3，CD(44)and DKK1.

Key words:gene chip technology; uterine neoplasms; endometrial carcinoma; paclitaxel;drug-resistant gene

(收稿日期:2015-02-19)

通信作者簡介:周友珍(1965-)，女，主任醫(yī)師，研究方向為婦科惡性腫瘤化療耐藥及逆轉(zhuǎn)。E-mail: bjzhouyouzhen@163.com

作者簡介:第一林鳳(1986-)，女，住院醫(yī)師，研究方向為婦科惡性腫瘤化療耐藥。E-mail: linfeng5698@ sina.com

文章編號:1002-266X(2015) 19-0021-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.007