李翠蘭，石其光

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是主要累及神經(jīng)肌肉接頭突觸后膜的乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR） 由 B 細(xì)胞 /自身抗體介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與的自身免疫性疾?。?，2］。 近年來，AChR 抗體的檢測(cè)方法得到了很大發(fā)展，靈敏度和特異性也有了提升。但仍有一部分MG患者血清AChR抗體陰性，研究發(fā)現(xiàn)部分AChR抗體陰性的MG患者血清中含有特異性針對(duì)肌肉特異性受體酪氨酸激酶 （muscle specific receptor tyrosine kinase，MuSK）及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 4（low－density lipoprotein receptor－related protein 4，LPP4）的抗體。

1 血清AChR抗體陽性MG

目前認(rèn)為，AChR是大多數(shù)MG患者的特異性自身抗原，分為兩種亞型，胚胎型AChR由α2、β、δ、γ亞基組成，主要存在于胎兒的肌肉中，出生后γ亞基逐漸被ε亞基取代，稱為成熟型AChR，其由α2、β、δ、ε亞基組成［3］。 目前認(rèn)為在成人骨骼肌中只有眼外肌同時(shí)表達(dá)成熟型和胚胎型AChR亞單位，其他骨骼肌只表達(dá)成熟型亞單位［4］。乙酰膽堿受體有兩個(gè)乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)，分別位于α與γ或ε，α與δ之間［3］。主要免疫原區(qū)域位于α亞基的67～76位氨基酸殘基［5］。因此重癥肌無力患者血清中主要含有針對(duì)AChR－α亞基的抗體［6］。但后來研究發(fā)現(xiàn)，另有少部分患者含有特異性針對(duì)AChR－γ和AChR－ε 的抗體［7］。 AChR 抗體類型為 IgG，主要亞型為IgG1和IgG3［8］?？贵w發(fā)揮作用可能有3種機(jī)制［9］，即：①補(bǔ)體固定并激活引起突觸后膜溶解導(dǎo)致含AChR的膜損傷、釋放AChR－抗體—補(bǔ)體復(fù)合物至突觸間隙；②可能通過蛋白質(zhì)的環(huán)鏈和內(nèi)在化調(diào)節(jié)AChR數(shù)量；③抗AChR抗體直接與AChR結(jié)合引起功能阻滯。

2 血清AChR抗體陰性MG

2.1 MuSK抗體陽性MG MuSK是表達(dá)于骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭的酪氨酸激酶受體，胞外區(qū)有4個(gè)Ig樣區(qū)域和1個(gè)半胱氨酸聚集區(qū)組成，胞內(nèi)區(qū)有1個(gè)激酶區(qū)、近膜區(qū)和羧基末端尾部組成［10］。其功能是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)釋放的聚集蛋白（Agrin）同肌肉細(xì)胞表面的MuSK受體接觸，活化MuSK，引起細(xì)胞支架蛋白（Rapysn）聚集，然后Rapysn啟動(dòng)AChR和和表皮生長(zhǎng)因子受體（erbBR），促使骨骼肌表面突觸后膜上AChR 聚集［11，12］。 肌肉活檢發(fā)現(xiàn) MuSK－Ab 陽性的MG患者，神經(jīng)肌肉接頭處的AChR數(shù)量較正常組無明顯差異。這一點(diǎn)同AChR抗體陽性的MG患者不同，后者AChR數(shù)量明顯減少。MuSK－Ab主要通過與MuSK的胞外區(qū)結(jié)合后，抑制AChR聚集相關(guān)蛋白的功能，進(jìn)而抑制AChR在突觸后膜的聚集，影響神經(jīng)肌肉接頭信息傳遞［13］。同AChR－Ab主要由 IgG1型 IgG3型組成不同，MuSK－Ab主要為IgG4型，其發(fā)揮作用并不通過激活補(bǔ)體。所以通常在MuSK－Ab陽性的MG患者神經(jīng)肌肉終板上并無補(bǔ)體 C3 的沉積［7］。

2.2 低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4（LPP4）抗體陽性MG 盡管目前血清AChR抗體檢測(cè)方法的敏感性和特異性較以往有了較大的提高，但是仍有近5%～10%的MG患者血清AChR抗體和MuSK抗體陰性。近年來，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4已被證實(shí)為骨骼肌細(xì)胞膜上聚集蛋白（agrin）的受體［14，15］。LPP4表達(dá)在神經(jīng)肌肉突觸后膜上，其通過與聚集蛋白的結(jié)合從而活化MuSK，在MuSK胞外區(qū)域形成細(xì)胞支架，招募其他成分組成一個(gè)突觸后膜的復(fù)合體，促使突觸后膜上AChR的聚集［16］。2011年，Higuchi等［16］首次在 300例 AChR抗體和 MuSK抗體均陰性的患者血清中發(fā)現(xiàn)了9例抗LPP4的抗體，隨后于2012年，Higuchi和Waters分別在研究中發(fā)現(xiàn)，約50%和9.2%的雙抗體陰性的MG患者血清中含有 LPP4 的抗體［16，18］。目前認(rèn)為，LPP4 的抗體導(dǎo)致肌無力的可能通過以下兩種機(jī)制干擾突觸后膜AChR的聚集：①LPP4的抗體影響聚集蛋白和LPP4結(jié)合；②LPP4的抗體影響LPP4和MuSK的相互作用［16］。 研究發(fā)現(xiàn)，LPP4的抗體主要為IgG1，通過激活補(bǔ)體而發(fā)揮其致病作用［17］。以上研究均表明LPP4作為一種新的自身抗原，在AChR抗體和MuSK抗體均陰性的患者血清中可能含有針對(duì)LPP4的抗體。

3 MG中自身抗體的檢測(cè)方法

3.1 放射免疫沉淀法 （RIPA） 早在1960年人們就認(rèn)識(shí)到重癥肌無力是由于患者體內(nèi)存在抗肌肉終板蛋白自身抗體，到20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)該抗體所針對(duì)的靶抗原為AChR。這個(gè)發(fā)現(xiàn)是歸功于環(huán)蛇毒素（a－BuTX），它能特異性地結(jié)合肌肉AChR。此方法所需的標(biāo)記有125I－α－銀環(huán)蛇毒素的AChR抗原最初是來源于去神經(jīng)支配的骨骼肌，其主要為胚胎型AChR。隨著抗原提取方法的不斷改進(jìn)，后來有人將表達(dá)AChR－ε的基因轉(zhuǎn)染進(jìn)TE671細(xì)胞，這樣TE671細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)成熟型和胚胎型兩種不同類型的AChR，這進(jìn)一步提高了AChR抗體檢測(cè)的敏感性。盡管后來放射免疫法亦廣泛用于MuSK抗體的檢測(cè)，但是其本身具有放射性及其技術(shù)缺陷，以后，為避免使用核素，各種非放射性檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生。

3.2 非放射性方法 ①酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）：此方法主要原理為以α－銀環(huán)蛇毒素包被酶標(biāo)板，并與骨骼肌勻漿（含AChR）作用，再加入待測(cè)血清和對(duì)照血清，最后加HRP標(biāo)記的二抗，于酶標(biāo)儀上測(cè)492 nm吸光度。以陽性混合血清作為標(biāo)準(zhǔn)血清，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)血清中抗AChR抗體含量，可根據(jù)吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上換算。因?yàn)槠錂z測(cè)效率較RIPA并未提高，因此此方法并未被常規(guī)使用。盡管上述乙酰膽堿受體抗體檢測(cè)方法不斷改進(jìn)，但是仍有一部分MG患者血清抗體陰性，此外，隨著熒光免疫技術(shù)的不斷成熟，因此一種新的、利用熒光免疫技術(shù)檢測(cè)AChR抗體的方法開始出現(xiàn)。②熒光免疫沉淀法（FIPA）：利用標(biāo)記有熒光蛋白的抗原，此方法最早被用于視神經(jīng)脊髓炎 （neuromyelitis optica，NMO）中 AQP－4 抗體的檢測(cè)［19］。 此方法的優(yōu)點(diǎn)是，可以通過標(biāo)有不同顏色的熒光蛋白同時(shí)進(jìn)行針對(duì)不同抗原的多種抗體的檢測(cè)。例如，可以對(duì)重癥肌無力患者同時(shí)進(jìn)行AChR抗體和MuSK抗體的檢測(cè)。此方法將增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的AChR 4種不同的亞基按照自然比并在聚乙烯亞胺 （PEI）介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入人胚腎細(xì)胞（HEK－293），后通過裂解細(xì)胞來獲取標(biāo)記有EGFP的AChR，使其與待測(cè)血清混合，后加入二抗，通過酶標(biāo)儀讀取熒光值來判斷結(jié)果［2，19］。此方法同RIPA方法具有較高的相關(guān)性。③熒光細(xì)胞染色方法（CBA）：考慮到傳統(tǒng)的RIPA方法，其抗原處于溶液中，且較分散，而神經(jīng)肌肉接頭處的AChR通過聚集蛋白（rapsyn）的連接而以高度密集的狀態(tài)存在。通常情況下AChR抗體同高度密集表達(dá)在細(xì)胞表面的AChR結(jié)合性最好。因此有人推測(cè)血清陰性MG（SNMG）患者中可能含有低親和力的AChR抗體，這些低親和力的抗體同溶液中相對(duì)分散的AChR不易結(jié)合，從而造成那些含有低親和力抗體的MG患者血清抗體檢測(cè)結(jié)果陰性。2008年，有研究報(bào)道首次應(yīng)用熒光免疫細(xì)胞染色技術(shù)在66%的“血清陰性”的重癥肌無力患者血清中檢測(cè)出呈低親和力的AChR抗體［7］。該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)的工作原理及獨(dú)特之處在于：通過聚集蛋白rapsyn使AChR蛋白的5個(gè)亞基聚集并濃縮表達(dá)在細(xì)胞表面，不僅使抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)從傳統(tǒng)的放射免疫沉淀法液相環(huán)境改進(jìn)為生長(zhǎng)活躍的活性細(xì)胞表面，為下一步的熒光顯微鏡下肉眼觀察與抗原結(jié)合的抗體提供了直觀、形象的讀片平臺(tái)；而且提高了細(xì)胞表面反應(yīng)環(huán)境中的抗原濃度，進(jìn)而增加其與血清中AChR抗體結(jié)合能力［2，7］。綜上所述，此方法較其他方法更敏感。

目前仍有部分患者臨床表現(xiàn)和輔助檢查類似MG的患者血清中上述抗體均為陰性。因此對(duì)于MG患者血清抗體的檢測(cè)仍有待于進(jìn)一步提高，對(duì)于MG患者血清中是否還含有針對(duì)其他自身抗原的MG相關(guān)抗體，目前尚不明確。

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