修曉宇董 賀胡華英

(1.吉林省前郭縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,吉林前郭 138000; 2.吉林省前郭縣八郎鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,吉林前郭 138000)

豬喘氣病的實(shí)驗(yàn)室診斷

修曉宇1董 賀2胡華英1

(1.吉林省前郭縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,吉林前郭 138000; 2.吉林省前郭縣八郎鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,吉林前郭 138000)

引起豬喘氣病的病原是豬肺炎支原體,是一種慢性傳染病,主要的臨診表現(xiàn)是咳嗽與喘氣。剖檢變化為肺的心葉、尖葉、腦葉發(fā)生實(shí)變,以及肺淋巴結(jié)增生。本病是規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)常見疫病之一,也是無特定病原豬場(chǎng)要求凈化的疫病之一。

豬喘氣病;診斷

1 臨診特點(diǎn)

本病的主要臨診癥狀是體溫不高、咳嗽與喘氣，并隨運(yùn)動(dòng)加重，慢性病豬生長發(fā)育遲緩或死亡，造成飼料和人力的大量浪費(fèi)。主要病理變化是肺的心葉、尖葉、膈葉前下緣及中間葉有實(shí)變區(qū)，呈“蝦肉樣”。肺門和縱隔淋巴結(jié)腫大。

2 實(shí)驗(yàn)室檢查

2.1 檢驗(yàn)方法

（1）X射線診斷：被檢豬正位及側(cè)位保定，用X光機(jī)透視，觀察肺部是否有陰影。

（2）病原學(xué)檢查：A.病料的直接觸片鏡檢：在無菌條件下取急性死亡的豬的病變比較明顯的肺組織觸片，用姬姆薩染色后在顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)特征。B.豬肺炎支原體的分離與鑒定：先進(jìn)行病料的采集與處理。用無菌手術(shù)采集肺臟實(shí)變與正常區(qū)交界處的組織（應(yīng)包括支氣管），也可用棉拭子收集氣管支氣管分泌物和呼吸道洗液，制成10%懸液。用含有1～2ml的選擇性培養(yǎng)基（含抗豬鼻霉形體血清）和非選擇性培養(yǎng)基的試管，分別作10-1至10-6稀釋。

豬肺炎霉形體的分離與純化可采用以下方法：a.豬肺炎霉形體的液體培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)：將含有稀釋病料的液體培養(yǎng)基放置于37℃中培養(yǎng)，每天觀察pH值的變化，再將產(chǎn)酸的培養(yǎng)物移植于新鮮的液體培養(yǎng)基中。如此多次移植，直到培養(yǎng)1～2d時(shí)培養(yǎng)基pH降至約6.8，表明已適應(yīng)生長為止。b.豬肺炎霉形體在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)：在A260瓊脂平皿上加0.1毫升待純化的肉湯培養(yǎng)物，使流淌均勻，吸干多余的液體，置于含5～20%二氧化碳的潮濕大氣中。在37℃中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。c.豬肺炎霉形體的純化：一般采用單菌落移植法，將形成的菌落反復(fù)移植3次。

豬肺炎霉形體的鑒定可從以下幾方面進(jìn)行：a.豬肺炎霉形體的形態(tài)學(xué)觀察。b.豬肺炎霉形體的生化特性鑒定：主要進(jìn)行葡萄糖代謝實(shí)驗(yàn)，水解精氨酸還原四氮唑?qū)嶒?yàn)，磷酸酶活性實(shí)驗(yàn)等。c.生長抑制實(shí)驗(yàn)：用已知的抗血清對(duì)霉形體分離物進(jìn)行菌落的生長抑制實(shí)驗(yàn)，是國際霉形體分類委員會(huì)推薦的法定血清方法之一。其方法如下：取新鮮制備的瓊脂平皿，厚度不小于4mm，在37℃中，底與蓋分開放置30min，使水蒸氣揮發(fā)。然后將對(duì)數(shù)期霉形體肉湯培養(yǎng)物稀釋100倍，其濃度應(yīng)約為10-2～10-6CFU/ml（能在瓊脂平皿上產(chǎn)生一個(gè)菌落的霉形體懸液的最高稀釋度即為一個(gè)CFU），然后接種100μl至瓊脂平皿上，用“L”型玻棒涂布均勻后，短暫放置室溫中使接種物吸收。用滅菌鑷子將選定的預(yù)先準(zhǔn)備好的抗血清濾紙片（直徑5mm，已吸收了約20μl抗血清，并已干燥）小心的放置于接種后的平皿上，紙片間保持1.5～2cm的距離；按所測(cè)定霉形體的生長需要，選擇培養(yǎng)條件與時(shí)間，然后在低倍顯微鏡下測(cè)量抗血清紙片抑菌圈的寬度。

（3）血清學(xué)檢查：A.微量間接血凝實(shí)驗(yàn)：在96孔微量反應(yīng)板上，吸取稀釋液25μl加入第一至六孔中，每份血清占一排孔，然后取被檢血清25μl于第一孔中，以后做對(duì)倍稀釋至第六孔，第六孔遺棄25μl。每孔中滴加25μl2%致敏紅細(xì)胞。同時(shí)各設(shè)一排陰性豬血清和抗原致敏紅細(xì)胞對(duì)照。放置于微型震蕩器上震蕩30s后，室溫中（最適溫度18～25℃，夏天宜放置4～8℃冰箱）靜置2h，觀察記錄。B.試管乳膠凝集實(shí)驗(yàn)：取標(biāo)準(zhǔn)血清、待檢血清和生理鹽水與豬肺炎支原體培養(yǎng)物混勻，放置37℃培養(yǎng)24～48h，Wright式染色，1000倍顯微鏡下觀察結(jié)果。C.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：抗原的包被、洗滌，加入被檢豬血清，加入酶標(biāo)抗豬的IgG，加入底物顯色，判斷結(jié)果。

2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)

（1）X射線診斷：如果在豬的肺視野內(nèi)側(cè)面及心膈角區(qū)觀察到不規(guī)則的云絮狀陰影，中等密度，邊緣模糊，即為病變，結(jié)合病豬的臨診癥狀即可確切診斷。

（2）病原學(xué)檢查：A.病原的形態(tài)、培養(yǎng)結(jié)果觀察：病料經(jīng)姬姆薩染色后觀察到呈典型的兩極狀、車輪狀和戒指狀等多形態(tài)的豬肺炎霉體為陽性。病料經(jīng)稀釋后在液體選擇性培養(yǎng)基上生長，pH值降至6.8，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長出典型的油煎雞蛋狀菌落，為陽性。B.病原的生化特性：水解精氨酸（－），磷酸酶（－），還原四氮唑（－弱），解朊活性（－），血細(xì)胞吸附（－）。C.生長抑制實(shí)驗(yàn)：抑菌圈的寬度大于1mm者為陽性；小于0.5mm者為陰性；界于二者之間者即為可疑。

（3）血清學(xué)試驗(yàn)：A.微量間接血凝實(shí)驗(yàn)：a.如果抗原致敏紅細(xì)胞對(duì)照樣無自凝現(xiàn)象，陽性豬血清抗體價(jià)＞1：20（＋＋），陰性對(duì)照豬血清抗體價(jià)＜1：5，表明反應(yīng)正常進(jìn)行。b.判定記錄：被檢血清抗體效價(jià)≥1：10（＋＋）者，判為陽性；被檢血清抗體價(jià)＜1：5者判為陰性；被檢血清抗體價(jià)介于二者之間者，判為可疑。B.試管乳膠凝集實(shí)驗(yàn)：菌體出現(xiàn)凝集反應(yīng)判斷為陽性；菌體不出現(xiàn)凝集反應(yīng)判斷為陰性。C.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：反應(yīng)結(jié)束后用72型分光光度計(jì)在495納米的波長下測(cè)定各反應(yīng)孔中溶液的光密度值。凡試驗(yàn)血清光密度值高于陰性血清1.5倍以上者判定為陽性。

[1] 姜波.豬喘氣病的診斷與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008，（17）：278-279.

[2] 鄭行義，張?zhí)祀p，呂忠輝，等.豬喘氣病的診斷與防治[J].養(yǎng)殖與飼料，2006，（1）：37-38.

修曉宇（1984—），男，助理獸醫(yī)師，本科，主要從事內(nèi)容疾病預(yù)防與控制、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)檢驗(yàn)、技術(shù)管理與應(yīng)用研究指導(dǎo)工作。