孟慶煥 祖元剛 王化

(森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040) (黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所)

王洪政 路祺 李平 吳薇薇 鐘晨 段喜華

(森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學)) (哈爾濱市第三中學) (森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學))

2011 年，牡丹籽油被原衛(wèi)生部列為新資源食品［1-2］。牡丹種皮是在牡丹籽油生產(chǎn)過程中的廢棄物，一般作為垃圾直接丟棄，這樣不僅影響環(huán)境衛(wèi)生，也會造成自然資源的嚴重浪費，直接影響牡丹籽的高值化利用。前期研究發(fā)現(xiàn)牡丹種皮中含有黃酮類化合物，并且具有良好的清除自由基作用［3-5］。進一步對牡丹種皮黃酮類化合物進行研究分析，發(fā)現(xiàn)了一種重要的活性成分——木犀草素。木犀草素具有抑菌、抗氧化、降血脂、降血壓、抗腫瘤等多種生物活性，臨床常用于止咳、祛痰、消炎等［6-7］。目前對于木犀草素的提取方法主要采用熱回流萃取法、微波輔助法、超聲波輔助法等這些方法都有各自的優(yōu)缺點［8-9］。但針對提取木犀草素的原料牡丹種皮來說若使用上述方法，存在一個共同缺點，即粉碎牡丹種皮過程中產(chǎn)生大量粉塵，會嚴重影響操作人員的身體健康。所以本研究采用生物酶輔助乙醇勻漿法優(yōu)化木犀草素提取工藝，一方面可以直接將物料置于勻漿機中，與提取溶劑在勻漿裝置中混合均勻，通過機械及溶液之間的力的剪切作用將物料撕碎，使物料破碎和有效成分的提取同步進行，達到種皮中目的活性物質(zhì)快速和強化提取。另一方面，生物酶可以將細胞壁的組成成分水解或是降解，破壞細胞壁的結構，使有效成分充分暴露出來，溶解、混懸于溶劑中，從而達到提高木犀草素提取率的目的［10-11］。目前該方法在國內(nèi)外關于木犀草素的提取研究方面未見報道，本實驗以木犀草素的提取率為參考指標，探求酶法輔助乙醇提取木犀草素的最佳工藝條件，為牡丹種皮中的木犀草素提取提供一種新的高效的工藝方法。

1 材料與方法

1．1 材料

牡丹成熟干燥的種子，經(jīng)脫殼機去皮，收集種皮洗凈后于干燥箱中60 ℃烘干過夜，粉碎過40 目篩備用。木犀草素對照品(中國藥品生物制品鑒定所)、纖維素酶R-10(酶活力10 000 U/g，Amresco，美國)、果膠酶(酶活力500 U/mg，Amresco，美國)，甲醇為色譜純，超純水自制，其他試劑均為分析純。

717 型自動進樣高效液相色譜儀，包括1525 二元泵和2487 型紫外光檢測器(美國WATERS 公司);Mill-Q 去離子水制備系統(tǒng)(美國Millipore 公司);美國迪馬色譜柱(4．6 mm×250 mm，5 μm);3K-30 超速離心機(美國Sigma 公司)。

1．2 方法

1．2．1 HPLC 測定條件

HPLC 液相條件。色譜柱:Diamonsil C18(250 mm×4．6 mm，5 μm);流速1 mL·min-1，進樣量10 μL。流動相為V(甲醇)∶V(0．4%磷酸水溶液)=52 ∶48;檢測波長360 nm。

標準曲線的制作。配制標準品，準確稱取木犀草素對照品10 mg，用甲醇定容至10 mL，使之成為質(zhì)量濃度1 g·L-1的標準儲備液，再依次稀釋成0．5、0．25、0．125、0．062 5、0．031 25 g·L-1不同質(zhì)量濃度的標準溶液待測。每樣重復3 次，峰面積取平均值，以標準品質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標做標準曲線，得木犀草素對照品回歸方程y=38 813 650．58x+92 733．00(R2=0．999)，表明木犀草素在0．031 25 ～0．5 g·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系。

1．2．2 乙醇提取工藝單因素實驗

乙醇提取溶劑體積分數(shù)的篩選，準確稱取5．00 g牡丹種皮，按m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL混合均勻后，勻漿3 min 提取一次的條件下，用體積分數(shù)分別為30%、50%、60%、70%、80%和95%乙醇溶液提取牡丹種皮中木犀草素，比較提取率差異，討論乙醇質(zhì)量分數(shù)對提取率的影響。

料液比的篩選，準確稱取5．00 g 牡丹種皮，加入體積分數(shù)為80%的乙醇溶液，勻漿，混合均勻后，勻漿3 min 提取一次的條件下，按m(牡丹種皮)∶V(乙醇)為1 g ∶6 mL、1 g ∶8 mL、1 g ∶10 mL、1 g ∶12 mL、1 g ∶15 mL 和1 g ∶20 mL，提取牡丹種皮中木犀草素，比較提取率的差異，討論牡丹種皮樣品與乙醇溶液的料液比對提取率的影響。

勻漿時間的篩選，準確稱取5．00 g 牡丹種皮，按m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL 加入80%乙醇溶液，勻漿一次，提取時間分別為1、2、3、4、6 和8 min，提取牡丹種皮中木犀草素，比較提取率，討論勻漿時間對提取率的影響。

提取次數(shù)的篩選，準確稱取5．00 g 牡丹種皮，按m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL 加入乙醇溶液，混合均勻后，勻漿6 min，用體積分數(shù)為80%的乙醇溶液提取牡丹種皮中木犀草素，提取次數(shù)分別設為1、2、3 和4 次，比較提取率差異，討論勻漿提取次數(shù)對牡丹種皮中木犀草素提取率的影響。

1．2．3 酶解處理單因素實驗

纖維素酶和果膠酶種類和質(zhì)量濃度的篩選。準確稱取7 份1 g 牡丹種皮，在45 ℃、pH 值4．5 和孵育180 min 條件下進行酶解，每份牡丹種皮中加入HAc-NaAc 酶緩沖液2 mL，分別為0．1 g·L-1纖維素酶、0．2 g·L-1纖維素酶、0．3 g·L-1纖維素酶、0．5 g·L-1纖維素酶、0．01 g·L-1果膠酶、0．05 g·L-1果膠酶和0．1 g·L-1果膠酶。取出后在90 ℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照勻漿優(yōu)化條件進行勻漿后，測定牡丹種皮中木犀草素的提取率。

孵育時間的篩選。準確稱取1 g 牡丹種皮4份，加入含0．05 g·L-1果膠酶的HAc-NaAc 酶緩沖液2 mL，在45 ℃、pH 值4．5 條件下進行酶解，酶解孵育時間分別為90、120、150、180 min。取出后在90℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照勻漿優(yōu)化條件進行勻漿后，測定牡丹種皮中木犀草素的提取率。

孵育溫度的篩選。準確稱取1 g 牡丹種皮4份，加入含0．05 g·L-1果膠酶的HAc-NaAc 酶緩沖液2 mL，在pH 值4．5、時間150 min 條件下進行酶解、溫度分別為40、45、50、55 ℃。取出后在90 ℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照勻漿優(yōu)化條件進行勻漿后，測定牡丹種皮中木犀草素的提取率。

孵育pH 的篩選。準確稱取1 g 牡丹種皮4 份，加入含0．05 g·L-1果膠酶的HAc-NaAc 酶緩沖液2 mL，在溫度為45 ℃、時間150 min 條件下進行酶解，pH 值分別為3．5、4．0、4．5 和5．0。取出后在90 ℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 按照勻漿優(yōu)化條件進行勻漿后，測定牡丹種皮中木犀草素的提取率。

1．2．4 樣品測定溶液制備

將所得牡丹種皮木犀草素提取液，放入1．5 mL離心管中，置于離心機10 000 r·min-1離心10 min后，按照上述HPLC 液相條件，測定木犀草素提取率。

2 結果與分析

2．1 乙醇提取單因素實驗

由表1 可以看出:隨著乙醇體積分數(shù)升高，木犀草素的提取率也增加，在達到80%時，提取率最高;此后隨乙醇體積分數(shù)升高，提取率反而下降。而隨著料液比增加、勻漿時間延長和提取次數(shù)的增多，木犀草素提取率呈現(xiàn)先增加后基本保持平穩(wěn)的趨勢。

2．2 乙醇提取木犀草素正交試驗

在單因素實驗的基礎上，按照盡量減少實驗次數(shù)和尋求設計最優(yōu)的原則，選擇乙醇體積分數(shù)、料液比、勻漿時間和提取次數(shù)作為因素，每個因素各取3 水平。正交試驗方案(L9(34))及結果見表2 和表3。

表1 乙醇提取單因素實驗結果

表2 乙醇提取木犀草素正交試驗因素水平

表3 乙醇提取木犀草素正交試驗結果

由表3 極差分析結果可以看出，對木犀草素提取率影響最大的是乙醇體積分數(shù)，影響最少的因素是勻漿時間，各因素影響的主次順序為:乙醇體積分數(shù)、料液比、提取次數(shù)、勻漿時間。由k 值可以得到最佳組合:A2B2C1D2，即乙醇質(zhì)量分數(shù)80%、m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL、勻漿時間為4 min和提取2 次。在最優(yōu)乙醇提取條件下，經(jīng)過驗證實驗可得木犀草素最高提取率為0．754 mg·g-1。

2．3 酶解輔助乙醇提取工藝單因素實驗

由表4 所示，經(jīng)過酶解孵育后，牡丹種皮中木犀草素提取率呈顯著增加趨勢。木犀草素提取率在0．1 g·L-1纖維素酶孵育后增加緩慢，在0．05、0．1 g·L-1的果膠酶孵育后的牡丹種皮中木犀草素提取率增加明顯。隨著酶孵育時間的延長，木犀草素提取率呈增加趨勢;而隨著孵育溫度和孵育pH 值升高，木犀草素提取率出現(xiàn)了拐點，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。根據(jù)上述實驗結果，選取有意義的水平進行下一步實驗。選擇纖維素酶0．5 g·L-1、果膠酶0．05、0．1 g·L-1，孵育時間120、150、180 min，孵育溫度40、45、50 ℃，孵育pH 值4、4．5、5，進行下一步的正交試驗。

表4 酶解輔助乙醇提取工藝單因素結果

2．4 酶輔助乙醇提取木犀草素優(yōu)化工藝

在前期乙醇勻漿優(yōu)化工藝參數(shù)和酶解輔助提取單因素實驗基礎上，對酶解輔助乙醇提取木犀草素工藝進行了正交試驗優(yōu)化(L9(34))，試驗設計與結果見表5 和表6。

表5 酶輔助乙醇提取木犀草素正交試驗因素和水平

影響木犀草素提取率的各因素主次順序是:酶液質(zhì)量濃度、孵育溫度、孵育時間、孵育pH 值。由極差分析得最佳條件組合為:A2B3C2D2，即果膠酶質(zhì)量濃度為0．05 g·L-1，酶解孵育時間為180 min，孵育溫度45 ℃、孵育pH 值為4．5。

表6 酶解輔助乙醇提取木犀草素正交試驗結果

2．5 最佳工藝的驗證實驗

對正交試驗中酶解輔助乙醇勻漿提取木犀草素的最佳工藝條件進行驗證實驗:準確稱取1 g 牡丹種皮3 份，加入含0．05 g·L-1果膠酶的HAc-NaAc酶緩沖液2 mL，在溫度為45 ℃、pH 值4．5 條件下進行酶解孵育180 min。在90 ℃下滅活5 min，再加入乙醇溶液8 mL 勻漿4 min，提取2 次，測定牡丹種皮中木犀草素提取率平均值為3．241 mg·g-1，均高于單因素實驗和正交試驗結果，表明此工藝可以有效提高牡丹種皮中木犀草素的提取率。

3 結束語

復合酶解輔助乙醇提取木犀草素的工藝參數(shù)為:酶解孵育溫度45 ℃、果膠酶0．05 g·L-1、酶解孵育時間180 min、酶解孵育pH 值4．5、乙醇體積分數(shù)80%、m(牡丹種皮)∶V(乙醇)= 1 g ∶10 mL、勻漿時間4 min、提取2 次，在此最優(yōu)條件下所得木犀草素提取率為3．241 mg·g-1，相較于乙醇提取法所得木犀草素提取率0．754 mg·g-1，升高4．3 倍。

經(jīng)過酶孵育處理的牡丹種皮中木犀草素提取率顯著提高，并且果膠酶處理后所得木犀草素提取率高于纖維素酶，這與牡丹種皮的物質(zhì)組成有密切關系。纖維素酶主要是降解細胞壁中的纖維素，而果膠酶主要是降解細胞壁和胞間質(zhì)中的果膠。通過本實驗分析推斷，牡丹種皮中果膠的含量比較高，因此使用果膠酶可以使牡丹種皮中的有效成分充分溶出，達到強化提取的作用，最終獲得了一種提取木犀草素的最佳工藝。

［1］ 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:一部［S］．2010 版．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:160-161．

［2］ 雷克鴻．衛(wèi)生部批準元寶楓籽油和牡丹籽油為新資源食品［N］．中國食品報，2011-06-06(A6)．

［3］ 孟慶煥，王化，王洪政，等．牡丹種皮黃酮提取及對ABTS 自由基清除作用［J］．植物研究，2013，33(4):504-507．

［4］ 孟慶煥．牡丹種皮黃酮提取分離與抗氧化及抗疲勞作用研究［D］．哈爾濱:東北林業(yè)大學，2013．

［5］ 王洪政，劉偉，張琳，等．正交實驗優(yōu)化超生輔助提取牡丹種皮總黃酮及其抗凝血活性研究［J］．植物研究，2014，34(6):856-860．

［6］ 王超，林嬌，周建新．乙醇回流法提取花生殼中木犀草素工藝條件優(yōu)化［J］．糧食與食品工業(yè)，2013，20(6):29-36．

［7］ 楊穎，宋曙輝，徐桂花．木犀草素的生理功能、提取、純化及應用的研究［J］．食品工程，2010(1):19-23．

［8］ 楊穎，宋曙輝，徐桂花．黃酮類化合物木犀草素研究進展［J］．糧食與油脂，2009(9):45-47．

［9］ 鐘方麗，薛健飛，劉威振．超聲波輔助法提取錦燈籠宿萼中的木犀草素［J］．食品與機械．2012，28(1):171-174．

［10］ 熊清平，張強華，石瑩瑩，等．酶法輔助提取花生殼中木犀草素的工藝研究［J］．中國釀造，2012，31(1):46-49．

［11］ 王秋雪，顧成波，付麗楠，等．響應面優(yōu)化纖維素酶輔助提取木豆葉總黃酮工藝［J］．植物研究，2012，32(6):765-769．