張新愛 鄭光榮 申建忠 韓恩 董曉婭

摘要：將檢測抗體（dAb和二茂鐵甲酸（FCA固載于二氧化硅修飾的氧化鋅（nO@SiO2表面制備納米復合材料標記物（{dAb-nO-FCA}，并將其用于放大電化學免疫分析乳制品中大腸桿菌（Escherichia coli。采用“三明治”免疫分析模式，基于二茂鐵甲酸產(chǎn)生的電流信號與大腸桿菌濃度之間的關系實現(xiàn)了對大腸桿菌的檢測。結果表明，二茂鐵甲酸產(chǎn)生的電流信號與大腸桿菌濃度的對數(shù)在20×102 ～ 20×106 CFU/mL范圍內(nèi)保持良好的線性關系，檢出限為100 CFU/mL（S/N=3。利用該電化學免疫分析方法對乳制品進行了大腸桿菌的加標回收試驗，回收率在958%～105%之間。

關鍵詞：納米復合材料標記物；放大電化學免疫分析；乳制品；大腸桿菌

中圖分類號： TS2074文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0342-02[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-07-14

基金項目：國家自然科學基金（ 編號：21205051；中國博士后科學基金（ 編號：2013M541605；江蘇大學高級專業(yè)人才科研啟動基金（編號：11JDG144。

作者簡介：張新愛（1982—，女，博士，講師，從事食品質(zhì)量與安全研究。 E-mail：zhangxinai@mailujseducn。

乳制品含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，在生產(chǎn)、加工、運輸和儲存過程中極易受到致病性細菌的污染，從而會影響人們的生活質(zhì)量和健康水平[1]。人類通過乳源性途徑引起的食物中毒與乳制品中大腸桿菌（Escherichia coli的數(shù)量呈現(xiàn)一定的相關性，因此，大腸桿菌已經(jīng)成為評價乳制品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標，被世界各國乳制品微生物標準列為必檢項目。目前，大腸桿菌常用的檢測方法，由于耗時長在一定程度上已經(jīng)不能滿足快速檢測的需求。因此，建立乳制品中大腸桿菌的快速、靈敏、準確的檢測方法顯得尤為重要。

免疫檢測技術由于具有選擇性好、抗干擾能力強的特點而得到了人們的普遍關注[3-5]。其中，電化學免疫分析法具有簡單快速、選擇性好、易于小型化等優(yōu)點[6]。實現(xiàn)信號放大從而提高檢測靈敏度是制約電化學免疫分析方法快速發(fā)展的關鍵問題[7]。納米材料的應用為發(fā)展新型靈敏的電化學免疫分析體系打開了一片新天地[8-9]。納米復合材料突破了單一組分材料性能的局限，具有體積小、比表面積大等特點，因而被廣泛用于制備納米復合材料標記物進而提高電化學分析技術的靈敏度[10]。

采用二氧化硅修飾的氧化鋅（nO@SiO2固載檢測抗體（dAb和二茂鐵甲酸（FCA制備納米復合材料標記物 （{dAb-nO-FCA}，并將其用于放大電化學免疫分析乳制品中大腸桿菌?；诖竽c桿菌與其抗體之間的特異性相互作用構建“三明治”免疫分析模式，采用示差脈沖伏安法測定結合在電極表面的二茂鐵甲酸獲得電流信號。

1材料與方法

11儀器及試劑

二茂鐵甲酸（FCA、牛血清白蛋白（BSA、1-（3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽（EDC、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS購于Sigma公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES、正硅酸乙酯（TEOS由阿拉丁試劑公司（中國上海提供。半胱氨酸（L-cysteine購于上海晶純實業(yè)有限公司。試驗所用其他試劑均購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

12{dAb-nO-FCA}的制備

121制備氧化鋅納米棒在攪拌條件下，將60 mL氫氧化鈉溶液（10 mol/L逐滴加到100 mL硝酸鋅溶液（004 mol/L中。隨著氫氧化鈉的加入，有白色沉淀生成，繼續(xù)滴加，沉淀溶解。室溫攪拌2 h后，加熱至沸騰并回流1 h。趁熱用045 μm的微孔玻璃漏斗過濾，將所得白色沉淀置于空氣中晾干至恒重。

122制備二氧化硅修飾的氧化鋅納米棒將20 mg氧化鋅納米棒分散于20 mL丙醇和40 mL乙醇的混合液中并超聲10 min。在攪拌條件下，依次加入15 mL氨水溶液（25%、320 μL TEOS和80 μL APTES，室溫下反應8 h。將上述溶液在8 000 r/min，離心10 min制得nO@SiO2，隨后用去超純水清洗該沉淀并將其分散于20 mL磷酸緩沖溶液（PBS中。

123制備{dAb-nO-FCA}取10 mL nO@SiO2溶液，依次向其中加入10 mL 040 mol/L EDC-010 mol/L NHS混合液、40 mg/mL檢測抗體（dAb和10 mL二茂鐵甲酸飽和溶液，在37 ℃攪拌2 h。經(jīng)離心分離并洗滌后，將制得的{dAb-nO-FCA}用PBS分散并置于冰箱中4 ℃保存。

13免疫傳感器的制備

金電極（Ф=3 mm修飾前需進行預處理：首先依次用030、005 μm的Al2O3粉末在金相砂紙上打磨拋光，再依次用乙醇、水超聲清洗，最后置于050 mol/L硫酸溶液中在 -030～15 V 電位范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖。把預處理過的金電極浸入002 mol/L半胱氨酸的乙酸緩沖溶液（pH 值50中自組裝6 h。取出電極用水清洗后，置于040 mol/L EDC-010 mol/L NHS的溶液中反應1 h用于活化電極末端的羧基，然后用PBS清洗電極表面并用氮氣吹干。將10 μL捕獲抗體（cAb溶液（10 mg/mL滴涂在金電極表面并在37 ℃下培養(yǎng)1 h后，用PBS清洗電極以除去未結合的抗體并晾干。在電極表面滴加10% BSA-PBS溶液并培養(yǎng)30 min以封閉活性位點。

2結果與分析

21免疫測定條件的優(yōu)化

溫度對免疫蛋白分子的活性有一定的影響，本試驗研究了在20 ～ 45 ℃范圍內(nèi)對電化學免疫分析方法檢測大腸桿菌的影響。響應電流隨反應溫度的升高而逐漸增大，說明大腸桿菌和其抗體結合的速度隨著溫度的增加而提高。在35 ℃時，免疫反應最充分，電流響應最大。當溫度繼續(xù)上升，響應電流逐步下降，表明過高的反應溫度使少數(shù)免疫分子變性或失活，導致修飾電極表面的大腸桿菌和其抗體部分脫落，因此選擇35 ℃為最佳免疫反應溫度。

抗體與抗原發(fā)生免疫反應與時間有關。本研究考察了免疫時間在20 ～ 70 min范圍內(nèi)對電化學免疫分析方法檢測大腸桿菌的影響。結果表明，響應電流隨著免疫反應時間的增加而增強，在50 min時，響應電流趨于穩(wěn)定，因此選擇50 min為最佳免疫反應時間。

22免疫測定的工作曲線

電化學免疫分析方法用于大腸桿菌檢測的原理，首先將捕獲抗體固定在半胱氨酸修飾的金電極表面，然后免疫結合大腸桿菌，進而吸附{dAb-nO-FCA}構建“三明治”免疫分析模式，最后用示差脈沖伏安法測定電極表面的二茂鐵甲酸獲得電流信號。隨著待測溶液中大腸桿菌濃度的增大，固定在電極表面的{dAb-nO-FCA}就越多，因此產(chǎn)生的電流信號就越強。

[JP2]在優(yōu)化的試驗條件下，將該分析方法用于檢測不同濃度的大腸桿菌標準溶液。二茂鐵甲酸產(chǎn)生的響應電流隨著待測大腸桿菌濃度對數(shù)的線性關系見圖1。結果表明，二茂鐵甲酸產(chǎn)生的響應電流與大腸桿菌濃度的對數(shù)在20×102～20×106 CFU/mL的濃度范圍內(nèi)呈線性關系，線性回歸方程為I=[JP2]152×lgC-077，r=0984，檢出限為100 CFU/mL（S/N=3。

[F（W11][TPXA1tif][F]

23回收率試驗

為了進一步研究電化學免疫分析方法的實用性，本研究采用該方法對乳制品進行了大腸桿菌加標回收檢測。選擇加標濃度分別為50×102、10×103、10×104 CFU/mL，測定結果見表1，該免疫分析方法與平板計數(shù)法的相對誤差在±8%以內(nèi)，計算得到其回收率為958%～1050%，表明該電化學免疫分析方法用于乳制品中大腸桿菌檢測具有可靠性好、準確度高等優(yōu)點。

[F（W7][HT6H][J]表1乳制品加標回收率測定[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5，W18，W6W]樣品[B（][BHDWG12，W18W]加標回收量（CFU/mL[BHDWG12，W6。3W][XXSX2-SX172]檢出量加入量測出量[BW]回收率（%

[BHDG12，W5，W6。4W]酸奶未檢出50×102479958

[BHDW]嬰兒奶粉未檢出10×1031 0501050

純奶未檢出10×1049 720972[HJ][BG）F][F）]

3結論

采用nO@SiO2作為載體固定檢測抗體和二茂鐵甲酸制備了金納米棒標記物，并將其用于電化學免疫分析乳制品中大腸桿菌。nO@SiO2具有生物相容性好、比表面積大的優(yōu)點，能夠固載大量二茂鐵甲酸，從而放大電流信號提高大腸桿菌檢測的靈敏度。將該電化學免疫分析方法應用于乳制品的加標回收試驗，結果令人滿意。

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