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        納米復(fù)合材料標(biāo)記物放大電化學(xué)免疫分析乳制品中的大腸桿菌

        2015-04-02 01:23:30張新愛鄭光榮申建忠韓恩董曉婭
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年12期
        關(guān)鍵詞:大腸桿菌乳制品

        張新愛 鄭光榮 申建忠 韓恩 董曉婭

        摘要:將檢測(cè)抗體(dAb和二茂鐵甲酸(FCA固載于二氧化硅修飾的氧化鋅(nO@SiO2表面制備納米復(fù)合材料標(biāo)記物({dAb-nO-FCA},并將其用于放大電化學(xué)免疫分析乳制品中大腸桿菌(Escherichia coli。采用“三明治”免疫分析模式,基于二茂鐵甲酸產(chǎn)生的電流信號(hào)與大腸桿菌濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)。結(jié)果表明,二茂鐵甲酸產(chǎn)生的電流信號(hào)與大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)在20×102 ~ 20×106 CFU/mL范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系,檢出限為100 CFU/mL(S/N=3。利用該電化學(xué)免疫分析方法對(duì)乳制品進(jìn)行了大腸桿菌的加標(biāo)回收試驗(yàn),回收率在958%~105%之間。

        關(guān)鍵詞:納米復(fù)合材料標(biāo)記物;放大電化學(xué)免疫分析;乳制品;大腸桿菌

        中圖分類號(hào): TS2074文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號(hào):1002-1302(201412-0342-02[HS][HT9SS]

        收稿日期:2014-07-14

        基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金( 編號(hào):21205051;中國博士后科學(xué)基金( 編號(hào):2013M541605;江蘇大學(xué)高級(jí)專業(yè)人才科研啟動(dòng)基金(編號(hào):11JDG144。

        作者簡(jiǎn)介:張新愛(1982—,女,博士,講師,從事食品質(zhì)量與安全研究。 E-mail:zhangxinai@mailujseducn。

        乳制品含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中極易受到致病性細(xì)菌的污染,從而會(huì)影響人們的生活質(zhì)量和健康水平[1]。人類通過乳源性途徑引起的食物中毒與乳制品中大腸桿菌(Escherichia coli的數(shù)量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性,因此,大腸桿菌已經(jīng)成為評(píng)價(jià)乳制品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo),被世界各國乳制品微生物標(biāo)準(zhǔn)列為必檢項(xiàng)目。目前,大腸桿菌常用的檢測(cè)方法,由于耗時(shí)長(zhǎng)在一定程度上已經(jīng)不能滿足快速檢測(cè)的需求。因此,建立乳制品中大腸桿菌的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

        免疫檢測(cè)技術(shù)由于具有選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)而得到了人們的普遍關(guān)注[3-5]。其中,電化學(xué)免疫分析法具有簡(jiǎn)單快速、選擇性好、易于小型化等優(yōu)點(diǎn)[6]。實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大從而提高檢測(cè)靈敏度是制約電化學(xué)免疫分析方法快速發(fā)展的關(guān)鍵問題[7]。納米材料的應(yīng)用為發(fā)展新型靈敏的電化學(xué)免疫分析體系打開了一片新天地[8-9]。納米復(fù)合材料突破了單一組分材料性能的局限,具有體積小、比表面積大等特點(diǎn),因而被廣泛用于制備納米復(fù)合材料標(biāo)記物進(jìn)而提高電化學(xué)分析技術(shù)的靈敏度[10]。

        采用二氧化硅修飾的氧化鋅(nO@SiO2固載檢測(cè)抗體(dAb和二茂鐵甲酸(FCA制備納米復(fù)合材料標(biāo)記物 ({dAb-nO-FCA},并將其用于放大電化學(xué)免疫分析乳制品中大腸桿菌?;诖竽c桿菌與其抗體之間的特異性相互作用構(gòu)建“三明治”免疫分析模式,采用示差脈沖伏安法測(cè)定結(jié)合在電極表面的二茂鐵甲酸獲得電流信號(hào)。

        1材料與方法

        11儀器及試劑

        二茂鐵甲酸(FCA、牛血清白蛋白(BSA、1-(3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽(EDC、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS購于Sigma公司;3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES、正硅酸乙酯(TEOS由阿拉丁試劑公司(中國上海提供。半胱氨酸(L-cysteine購于上海晶純實(shí)業(yè)有限公司。試驗(yàn)所用其他試劑均購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        12{dAb-nO-FCA}的制備

        121制備氧化鋅納米棒在攪拌條件下,將60 mL氫氧化鈉溶液(10 mol/L逐滴加到100 mL硝酸鋅溶液(004 mol/L中。隨著氫氧化鈉的加入,有白色沉淀生成,繼續(xù)滴加,沉淀溶解。室溫?cái)嚢? h后,加熱至沸騰并回流1 h。趁熱用045 μm的微孔玻璃漏斗過濾,將所得白色沉淀置于空氣中晾干至恒重。

        122制備二氧化硅修飾的氧化鋅納米棒將20 mg氧化鋅納米棒分散于20 mL丙醇和40 mL乙醇的混合液中并超聲10 min。在攪拌條件下,依次加入15 mL氨水溶液(25%、320 μL TEOS和80 μL APTES,室溫下反應(yīng)8 h。將上述溶液在8 000 r/min,離心10 min制得nO@SiO2,隨后用去超純水清洗該沉淀并將其分散于20 mL磷酸緩沖溶液(PBS中。

        123制備{dAb-nO-FCA}取10 mL nO@SiO2溶液,依次向其中加入10 mL 040 mol/L EDC-010 mol/L NHS混合液、40 mg/mL檢測(cè)抗體(dAb和10 mL二茂鐵甲酸飽和溶液,在37 ℃攪拌2 h。經(jīng)離心分離并洗滌后,將制得的{dAb-nO-FCA}用PBS分散并置于冰箱中4 ℃保存。

        13免疫傳感器的制備

        金電極(Ф=3 mm修飾前需進(jìn)行預(yù)處理:首先依次用030、005 μm的Al2O3粉末在金相砂紙上打磨拋光,再依次用乙醇、水超聲清洗,最后置于050 mol/L硫酸溶液中在 -030~15 V 電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖。把預(yù)處理過的金電極浸入002 mol/L半胱氨酸的乙酸緩沖溶液(pH 值50中自組裝6 h。取出電極用水清洗后,置于040 mol/L EDC-010 mol/L NHS的溶液中反應(yīng)1 h用于活化電極末端的羧基,然后用PBS清洗電極表面并用氮?dú)獯蹈?。?0 μL捕獲抗體(cAb溶液(10 mg/mL滴涂在金電極表面并在37 ℃下培養(yǎng)1 h后,用PBS清洗電極以除去未結(jié)合的抗體并晾干。在電極表面滴加10% BSA-PBS溶液并培養(yǎng)30 min以封閉活性位點(diǎn)。

        2結(jié)果與分析

        21免疫測(cè)定條件的優(yōu)化

        溫度對(duì)免疫蛋白分子的活性有一定的影響,本試驗(yàn)研究了在20 ~ 45 ℃范圍內(nèi)對(duì)電化學(xué)免疫分析方法檢測(cè)大腸桿菌的影響。響應(yīng)電流隨反應(yīng)溫度的升高而逐漸增大,說明大腸桿菌和其抗體結(jié)合的速度隨著溫度的增加而提高。在35 ℃時(shí),免疫反應(yīng)最充分,電流響應(yīng)最大。當(dāng)溫度繼續(xù)上升,響應(yīng)電流逐步下降,表明過高的反應(yīng)溫度使少數(shù)免疫分子變性或失活,導(dǎo)致修飾電極表面的大腸桿菌和其抗體部分脫落,因此選擇35 ℃為最佳免疫反應(yīng)溫度。

        抗體與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)與時(shí)間有關(guān)。本研究考察了免疫時(shí)間在20 ~ 70 min范圍內(nèi)對(duì)電化學(xué)免疫分析方法檢測(cè)大腸桿菌的影響。結(jié)果表明,響應(yīng)電流隨著免疫反應(yīng)時(shí)間的增加而增強(qiáng),在50 min時(shí),響應(yīng)電流趨于穩(wěn)定,因此選擇50 min為最佳免疫反應(yīng)時(shí)間。

        22免疫測(cè)定的工作曲線

        電化學(xué)免疫分析方法用于大腸桿菌檢測(cè)的原理,首先將捕獲抗體固定在半胱氨酸修飾的金電極表面,然后免疫結(jié)合大腸桿菌,進(jìn)而吸附{dAb-nO-FCA}構(gòu)建“三明治”免疫分析模式,最后用示差脈沖伏安法測(cè)定電極表面的二茂鐵甲酸獲得電流信號(hào)。隨著待測(cè)溶液中大腸桿菌濃度的增大,固定在電極表面的{dAb-nO-FCA}就越多,因此產(chǎn)生的電流信號(hào)就越強(qiáng)。

        [JP2]在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,將該分析方法用于檢測(cè)不同濃度的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)溶液。二茂鐵甲酸產(chǎn)生的響應(yīng)電流隨著待測(cè)大腸桿菌濃度對(duì)數(shù)的線性關(guān)系見圖1。結(jié)果表明,二茂鐵甲酸產(chǎn)生的響應(yīng)電流與大腸桿菌濃度的對(duì)數(shù)在20×102~20×106 CFU/mL的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,線性回歸方程為I=[JP2]152×lgC-077,r=0984,檢出限為100 CFU/mL(S/N=3。

        [F(W11][TPXA1tif][F]

        23回收率試驗(yàn)

        為了進(jìn)一步研究電化學(xué)免疫分析方法的實(shí)用性,本研究采用該方法對(duì)乳制品進(jìn)行了大腸桿菌加標(biāo)回收檢測(cè)。選擇加標(biāo)濃度分別為50×102、10×103、10×104 CFU/mL,測(cè)定結(jié)果見表1,該免疫分析方法與平板計(jì)數(shù)法的相對(duì)誤差在±8%以內(nèi),計(jì)算得到其回收率為958%~1050%,表明該電化學(xué)免疫分析方法用于乳制品中大腸桿菌檢測(cè)具有可靠性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

        [F(W7][HT6H][J]表1乳制品加標(biāo)回收率測(cè)定[HTSS][STB]

        [HJ5][BG(!][BHDFG3,W5,W18,W6W]樣品[B(][BHDWG12,W18W]加標(biāo)回收量(CFU/mL[BHDWG12,W6。3W][XXSX2-SX172]檢出量加入量測(cè)出量[BW]回收率(%

        [BHDG12,W5,W6。4W]酸奶未檢出50×102479958

        [BHDW]嬰兒奶粉未檢出10×1031 0501050

        純奶未檢出10×1049 720972[HJ][BG)F][F)]

        3結(jié)論

        采用nO@SiO2作為載體固定檢測(cè)抗體和二茂鐵甲酸制備了金納米棒標(biāo)記物,并將其用于電化學(xué)免疫分析乳制品中大腸桿菌。nO@SiO2具有生物相容性好、比表面積大的優(yōu)點(diǎn),能夠固載大量二茂鐵甲酸,從而放大電流信號(hào)提高大腸桿菌檢測(cè)的靈敏度。將該電化學(xué)免疫分析方法應(yīng)用于乳制品的加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果令人滿意。

        [HS2][HT85H]參考文獻(xiàn):[HT8SS]

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