瑪依古麗·庫(kù)爾班，米爾班古麗·阿卜杜如蘇力，麥合甫再木·阿不都熱合曼，艾爾肯·熱合曼

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046)

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新疆地方特色馕面團(tuán)優(yōu)良酵母菌的篩選

瑪依古麗·庫(kù)爾班，米爾班古麗·阿卜杜如蘇力，麥合甫再木·阿不都熱合曼，艾爾肯·熱合曼*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046)

[目的] 篩選馕面團(tuán)優(yōu)質(zhì)酵母菌。[方法] 從新疆烏魯木齊、阿爾泰，喀什3個(gè)樣品點(diǎn)采集樣品，采用PDA和YEPD培養(yǎng)基分離純化了馕面團(tuán)發(fā)酵酵母菌，并進(jìn)行了26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析。[結(jié)果] 試驗(yàn)得出，29株菌相互之間的26S rDNA D1/D2基因序列同源性比例為99%。在這29株菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列的基礎(chǔ)上采用鄰近法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，從中選出了11株代表菌，它們被認(rèn)為是該地區(qū)特殊而獨(dú)特的酵母品系，完成了初篩。進(jìn)一步測(cè)定11株菌的發(fā)酵活力、發(fā)酵前后的pH與面團(tuán)醒發(fā)時(shí)間，完成了復(fù)篩并獲得了6株菌。接著對(duì)6株酵母菌進(jìn)行了感官測(cè)試，最后獲得了一株優(yōu)質(zhì)酵母菌K24(KM454437)，馕感官評(píng)分為 97.1 分。[結(jié)論]研究篩選出來(lái)的一株馕面團(tuán)酵母菌發(fā)酵效率高，為新疆馕加工產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)依據(jù)。

馕面團(tuán)；酵母菌；26S rDNA D1/D2 區(qū)域；篩選

新疆獨(dú)特的地理與氣候環(huán)境[1]決定了以馕為中心的獨(dú)特的飲食文化。 馕是以小麥面、玉米面或高梁面為原料，加少許鹽水和酵面烤制而成的一種面餅，是維吾爾族的傳統(tǒng)主食之一[2]。近年來(lái)隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活水平的不斷提高和生活節(jié)奏的加快，城鎮(zhèn)居民對(duì)馕商品的需求量急劇增加，同時(shí)對(duì)馕的質(zhì)量也提出了更高的要求，馕的工業(yè)化生產(chǎn)已成為現(xiàn)代社會(huì)的需求。在馕的制造過(guò)程中，馕面團(tuán)發(fā)酵是一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)，馕面團(tuán)發(fā)酵最關(guān)鍵的是酵母菌，它與成品的質(zhì)量有著密切的關(guān)系。當(dāng)前制馕中馕面團(tuán)發(fā)酵大都采用自然發(fā)酵或者直接采用外購(gòu)普通的酵母粉，而熟知制馕工藝或者喜愛(ài)馕的人都明白酵母對(duì)于馕的口感和風(fēng)味都具有重要的作用。很多新疆人都非常愛(ài)吃用傳統(tǒng)的馕面團(tuán)發(fā)酵的馕。馕面團(tuán)又稱(chēng)老酵、酵頭、老肥、面種、面頭[3]，發(fā)酵是我國(guó)的傳統(tǒng)面團(tuán)發(fā)酵方法，在新疆廣大城鄉(xiāng)居民家庭中至今仍被廣泛應(yīng)用。這種方法成本低廉，簡(jiǎn)便易行，并且可使馕保持原汁原味。但是馕面團(tuán)中大量雜菌的存在，不但具有傳播病源的風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)導(dǎo)致面團(tuán)發(fā)酵過(guò)酸，需要添加蘇打進(jìn)行中和酸味。目前常見(jiàn)的各種廠家生產(chǎn)的商品酵母粉產(chǎn)品雖然馳名國(guó)內(nèi)外，但尚未見(jiàn)到能被新疆原居民廣泛采用和在口感上認(rèn)可的馕面團(tuán)發(fā)酵酵母粉；這主要可能是馕發(fā)酵酵母是該地區(qū)保存的特殊酵母品系，它們與酵母粉制品中的酵母是不同的酵母品種或品系，因而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有差異；酵母粉發(fā)酵馕餅面團(tuán)導(dǎo)致馕餅口感變味，降低了馕餅應(yīng)有的食用價(jià)值和觀賞性。在我國(guó)目前對(duì)酵母菌資源的開(kāi)發(fā)利用中，李自紅從民間采集的饅頭老酵頭中分離酵母菌 25 株，篩選出制作饅頭的優(yōu)良酵母菌被鑒定為釀酒酵母[4]。李寶坤等從自然發(fā)酵的 5 種哈密瓜汁中分離得到 25 株酵母菌并從中篩選得到1株產(chǎn)酒精能力高的釀酒酵母[5]。但目前為止，國(guó)內(nèi)外研究中還沒(méi)發(fā)現(xiàn)與新疆馕面團(tuán)優(yōu)質(zhì)酵母篩選有關(guān)的研究。采用現(xiàn)代微生物技術(shù)，從新疆傳統(tǒng)的馕面團(tuán)中篩選出優(yōu)良的發(fā)酵酵母菌，確保馕制品的原有風(fēng)味，為提高馕加工品質(zhì)提供技術(shù)依據(jù)，是實(shí)現(xiàn)馕工業(yè)化烤制進(jìn)程的必要途徑，也是一個(gè)新產(chǎn)業(yè)發(fā)展的增長(zhǎng)點(diǎn)，具有極大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酵母菌株。2014年3月份從南北疆的3個(gè)地點(diǎn)采集樣品，采樣位點(diǎn)分別是：烏魯木齊、阿爾泰、喀什。將馕面團(tuán)樣品放入滅菌的容器里，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器。量筒(1 000 ml)；和面機(jī)(2 kg)；環(huán)保電子馕坑；PCR 擴(kuò)增儀，Biometra；PHB-8型筆式 pH 計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司；SW-CJ-IF 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HZQ-2全溫振蕩器，金壇市醫(yī)療儀器廠；冷凍離心機(jī)，Thermo LEGEND MICRO 17R；凝膠成像分析儀 ALPHAIMAGERTM 2200，AlphaInnotech 公司；數(shù)控恒溫水浴鍋，寧波東勝儀器公司；DYY-III-3A水平電泳槽，北京六一儀器廠。1.1.3 主要原料試劑。小麥粉、土豆，從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)；酵母浸粉、蛋白胨、 瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉、 硝酸鉀、 硝酸銨、 尿素、 可溶性淀粉，天津市福晨化學(xué)試劑廠；蔗糖、 葡萄糖，天津市化學(xué)試劑三廠；均為國(guó)產(chǎn)分析純。Taq酶、10×TaqBuffer、DNA聚合酶，dNTP Mixture，北京天根生化科技有限公司；通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC-GG-3′)[6]引物對(duì)，上海生工生物工程有限公司合成。1.1.4 培養(yǎng)基。馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，鏈霉素20 mg，瓊脂粉20 g，水1 000 ml(pH自然，121 ℃ 20 min)。YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，瓊脂粉20 g，水1 000 ml(pH自然，115 ℃，20 min)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方案。馕面團(tuán)優(yōu)質(zhì)酵母菌篩選工藝流程見(jiàn)圖1。

圖1 新疆地方特色馕面團(tuán)優(yōu)質(zhì)酵母菌的篩選工藝流程

1.2.2 目標(biāo)酵母菌的分離與純化。采用梯度稀釋涂布平板法進(jìn)行分離，稱(chēng)取馕面團(tuán)樣品10 g，溶解于90 ml含有玻璃珠的滅菌生理鹽水中，振蕩30 min。分別取10-1～10-5共5個(gè)梯度濃度，每皿100 μl，涂布分離。28 ℃培養(yǎng)48～120 h，挑取不同形態(tài)單菌落，編號(hào)，經(jīng)多次劃線(xiàn)純化，獲得純培養(yǎng)物[7]。

1.2.3 菌落形態(tài)細(xì)胞形態(tài)的觀察。YEPD固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48～72 h，觀察其菌落形態(tài)、邊緣、大小、顏色、表面及質(zhì)地、側(cè)面、透明度等特征。酵母細(xì)胞形態(tài)觀察采用堿性伊紅美藍(lán)染色法[8]。將待測(cè)菌株置于28 ℃，培養(yǎng)2 d后挑選單個(gè)菌落進(jìn)行鏡檢并記錄細(xì)胞的微觀形態(tài)(大小、形狀等)特征。1.2.4 菌株基因組DNA的提取、PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定。菌株DNA的提取采用CTAB法[9-11]。用引物NL1和NL4擴(kuò)增所分離菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，最后于4 ℃保存[12-13]。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增的目標(biāo)產(chǎn)物。所得產(chǎn)物委托給北京鼎國(guó)測(cè)序有限公司進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST search)，比較供試菌株與已知酵母菌之間的親緣關(guān)系及GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)得到菌株注冊(cè)號(hào)。根據(jù)相關(guān)模式菌種的D1/D2區(qū)域序列，與供試菌的序列一起，用Clustal X軟件進(jìn)行序列校準(zhǔn)排齊，用Mega 5.0 軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)方法，進(jìn)行1 000次Bootstrap 檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[14-15]。

1.2.6 面團(tuán)發(fā)酵力測(cè)定。 稱(chēng)量70 g揉制好的面團(tuán)迅速置于500 ml 的量筒中。用木棒將其填充實(shí)于量筒底部并將面團(tuán)頂部壓平，記錄初體積。讀取體積時(shí)，將木棒伸入量筒內(nèi)，使其低端輕觸面團(tuán)最高部位，并貼于量筒讀數(shù)一側(cè)以減小讀數(shù)誤差，并每隔30 min測(cè)體積增長(zhǎng)量。記錄第1小時(shí)的排水量(V1)和第4小時(shí)的排水量(V2)。用第4小時(shí)的排水量減去第1小時(shí)的排水量即為該酵母的發(fā)酵力[16]。

F(發(fā)酵力)=V2-V1

1.2.7 面團(tuán)發(fā)酵前后的pH的測(cè)定。稱(chēng)取10 g發(fā)酵前的面團(tuán)，把它放入100 ml蒸餾水內(nèi)，用組織搗碎機(jī)把它勻漿，離心并過(guò)濾。用pH計(jì)對(duì)其上清液進(jìn)行pH測(cè)定。稱(chēng)取10 g發(fā)酵后的面團(tuán)，同樣的方法測(cè)定發(fā)酵后的面團(tuán)pH。

1.2.8 面團(tuán)醒發(fā)測(cè)定。 成形后的馕餅在28～29 ℃溫度下靜置，觀察其醒發(fā)情況。一般以達(dá)到成品體積的80%～90%為準(zhǔn)。

1.2.9 感官測(cè)試。

1.2.9.1 和面。面粉 800 g，酵母菌 4 g，加碘精制鹽10 g，消毒純牛奶100 g，水250 ml(30 ℃)。將這些材料加入到真空和面機(jī)中，定速充分?jǐn)嚢?0 min。避免和面過(guò)程中人為因素造成差異。

1.2.9.2 面團(tuán)發(fā)酵。將和好的面團(tuán)置于醒發(fā)箱中，在28～29 ℃下進(jìn)行發(fā)酵。避免發(fā)酵過(guò)程中人為因素造成誤差。

1.2.9.3 馕制作按照常見(jiàn)的方式制作。按照成品的重量要求，將面團(tuán)短時(shí)間內(nèi)分塊和稱(chēng)重，搓面和靜置手工搓圓要領(lǐng)是掌心向下，五指握住面團(tuán)，在面案上順一方向旋轉(zhuǎn)并向下輕壓，將面團(tuán)搓成圓球形。在27～29 ℃進(jìn)行靜置赤稱(chēng)醒發(fā)。

1.2.9.4 馕餅的烤制。將發(fā)酵好的馕面團(tuán)分割成適量大小，貼入溫度為150 ℃的環(huán)保電馕坑下進(jìn)行打馕，烘烤。避免烤制過(guò)程中人為因素造成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離 分別從烏魯木齊、阿爾泰、喀什3個(gè)地區(qū)采集了傳統(tǒng)馕面團(tuán)樣品，分離了35株面包酵母(Saccharomycescerevisiae)。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析 26S rDNA的D1/D2區(qū)序列的基礎(chǔ)上，將35株面包酵母菌測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，針對(duì)性地選擇了29株相互之間序列相似性為99%的面包酵母。用鄰近法(Neighbor-joining)對(duì)29株面包酵母進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，自展數(shù)(bootstrap)為1 000[14-15]，得到的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖2所顯示。

圖2 相似性99%的釀酒酵母的26S rDNA D1/D2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 初篩 根據(jù)29株面包酵母菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上所展示的進(jìn)化距離的不同獲得了11個(gè)獨(dú)立的大分支(圖2)，并且從每個(gè)分支中選出了代表性的一株菌，將它作為此來(lái)源馕面團(tuán)品種的代表。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1。

以下是此試驗(yàn)首次篩選的11株酵母菌在基因庫(kù)的注冊(cè)號(hào)： K1(KM401544)，K24(KP120534)，40n(KP965903)，U10 (KP120525)，K47(KM454443)，U18(KP122529)，K28(KM454439)，K29(KP120537)，K6(KM454427)，33n(KP965907)，U5(KP120522)。

表1 11株代表面包酵母的篩選

2.4 母菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)觀察 首次篩選的11株面包酵母在YEPD培養(yǎng)基上28 ℃下培養(yǎng)后其菌落形態(tài)基本上相似，顏色均為乳白色，菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，光滑，濕潤(rùn)，中部為微凸。細(xì)胞形態(tài)均為圓形，生殖方式為出芽生殖。部分菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞顯微形態(tài)如圖3所示，圖中的無(wú)色為活細(xì)胞(圖3c)，藍(lán)色為死細(xì)胞(圖3d)。

注：a.Saccharomyces cerevisiae n40(同40n)菌落形態(tài)；b.Saccharomyces cerevisiae U10菌落形態(tài)；c.Saccharomyces cerevisiae K28顯微形態(tài)；d.Saccharomyces cerevisiae U10細(xì)胞顯微形態(tài)。圖3 部分供試菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞顯微形態(tài)

2.5 復(fù)篩

2.5.1 面團(tuán)體積法測(cè)定酵母發(fā)酵力。 采用體積法對(duì)11株面包酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵性能檢測(cè)。產(chǎn)二氧化碳能力和發(fā)酵力成正比，產(chǎn)二氧化碳的能力越高說(shuō)明該菌株發(fā)酵能力越高。從圖4中可知，菌株K24、40n、U10、K47、K28、33n使面團(tuán)膨發(fā)體積相當(dāng)大，在馕面團(tuán)中的產(chǎn)氣能力高。該試驗(yàn)中獲得了發(fā)酵力高的6株面包酵母。

圖4 不同酵母的發(fā)酵力

2.5.2 面團(tuán)的pH。表2顯示的是11株菌面團(tuán)發(fā)酵前后的pH，從以上結(jié)果可知它們?cè)诿鎴F(tuán)發(fā)酵前后的pH范圍為5.20～5.78，不會(huì)導(dǎo)致馕面團(tuán)過(guò)酸過(guò)堿等現(xiàn)象，pH不會(huì)影響馕的口味。

2.5.3 醒發(fā)測(cè)定。圖5顯示11株酵母菌在面團(tuán)醒發(fā)時(shí)間為17～28 min。其中K24、K47、33n、K28、40n和U18醒發(fā)時(shí)間較短，非常適合于快速醒發(fā)，能夠提高馕餅生產(chǎn)速率。

2.6 最終篩選

2.6.1 不同酵母對(duì)馕面團(tuán)感官質(zhì)量的影響。根據(jù)上述2次篩選，試驗(yàn)獲得了發(fā)酵速度快、pH適當(dāng)、醒發(fā)時(shí)間短的5株菌(K24、K47、33n、K28、40n)。在環(huán)保的馕坑里，175 ℃下進(jìn)行打馕，并由5位評(píng)審員對(duì)馕進(jìn)行感官測(cè)試。按照表3的馕感官質(zhì)量評(píng)分尺度來(lái)進(jìn)行打分。不同面包酵母發(fā)酵的馕感官評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可看出，5株面包酵母樣品發(fā)酵的馕，感官評(píng)價(jià)總分平均值由高到低依次為K24、K47、K28、40n、33n。其中K24的分?jǐn)?shù)最高，因此該研究中K24確定為馕面團(tuán)發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)菌。

表2 11株菌在發(fā)酵面團(tuán)前后的pH

圖5 不同菌株醒發(fā)時(shí)間

表3 馕感官質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表4 不同面包酵母發(fā)酵的馕感官評(píng)價(jià)結(jié)果

注：酵母添加量 0.8%。

3 結(jié)論

該研究首次從新疆馕面團(tuán)中篩選了優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵酵母菌。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上的進(jìn)化距離，選擇了11株面包酵母菌。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上的每個(gè)大分支能夠代表常見(jiàn)面包酵母的突變株。該試驗(yàn)使用體積法對(duì)面團(tuán)發(fā)酵力進(jìn)行檢測(cè)。此法所需的設(shè)備簡(jiǎn)單、直觀且可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，然而家庭、作坊及工業(yè)化生產(chǎn)制作饅頭、馕或面包時(shí)多憑經(jīng)驗(yàn)判斷，其經(jīng)驗(yàn)的主要指標(biāo)便是面團(tuán)體積的變化。因此，面團(tuán)體積法測(cè)定酵母發(fā)酵力的研究顯得十分必要。該試驗(yàn)檢測(cè)了面團(tuán)發(fā)酵前后的pH。若馕面團(tuán)對(duì)堿不足，打出來(lái)的馕會(huì)有較濃的酸味，對(duì)堿過(guò)量，馕表面發(fā)黃易開(kāi)裂，風(fēng)味也不好[17]。因此馕面團(tuán)發(fā)酵中一定要控制pH不低于5。該試驗(yàn)中面團(tuán)培養(yǎng)范圍都在26～29 ℃，因?yàn)樵谶@個(gè)溫度上酵母的產(chǎn)氣能力大，發(fā)酵力強(qiáng)，產(chǎn)氣量比較均勻，面團(tuán)的持氣能力比較大。當(dāng)溫度超過(guò)30 ℃時(shí)，酵母的量大，產(chǎn)氣的速度過(guò)快，不利于面團(tuán)的持氣和充分膨脹，也容易引起面團(tuán)中其他雜菌的繁殖而影響面包的質(zhì)量。

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Selection of Excellent Yeast for Nang Dough in Xinjiang

Marygul Kurban, Mihribangul Abdurusul, Mehfuzem Abdurahman, Erkin Rahman*

(School of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang 830046)

[Objective] To select excellent yeast for Nang dough. [Method] Collecting samples from Urumqi, Altai, Kashi in Xinjiang, the fermentation yeast for Nang dough was separated and purified with PDA and YEPD culture medium, 26S rDNA D1/D2 regional sequence determination and phylogenetic analysis was conducted. [Result] The experiment showed that, the 29 isolates’ 26S rDNA D1/D2 sequence homology was 99% each other. The phylogenetic evolution tree was constructed on the basis of 26S rDNA D1/D2 sequence and the 11 strains which were chosen by primary screening to consider as region’s special yeast strains. For further study the fermentation activity, pH and awaking time of the 11 strains were detected and the secondary screening was completed. By the sensory test finally got a high-quality yeast strain K24 (KM454437).The Nang dough fermentation yeast obtained in this study has a high quality of fermentation. [Conclusion] The obtained yeast has high fermentation efficiency, which will provide technical basis for processing industry of Xinjiang Nang.

Nang dough; Yeast; 26S rDNA D1/D2 region; Selection

烏魯木齊市科技創(chuàng)新種子資金項(xiàng)目(21061710)； 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1203101)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060002)。

瑪依古麗·庫(kù)爾班(1988-)，女，維吾爾族，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，研究方向：資源微生物。*通訊作者，教授，博士，從事資源微生物研究。

2015-04-20

S 509.9

A

0517-6611(2015)17-302-04