林燕玲，劉杰鳳，周 天，陳俊任，李 婷，丘盛情

(廣東石油化工學(xué)院，廣東茂名 525000)

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一株紫色非硫光合細(xì)菌的分離鑒定和培養(yǎng)特性研究

林燕玲，劉杰鳳*，周 天，陳俊任，李 婷，丘盛情

(廣東石油化工學(xué)院，廣東茂名 525000)

紫色非硫細(xì)菌；光合細(xì)菌；沼澤紅假單胞菌；培養(yǎng)特性

紫色非硫細(xì)菌(Purple nonsulfer bacteria)是紅螺菌科光合細(xì)菌的通稱，因富含不同類型的類胡蘿卜素，細(xì)胞培養(yǎng)液呈紫色、紅色或棕色，故稱為紫色細(xì)菌。這類光合細(xì)菌曾被認(rèn)為不能利用硫化物作為電子供體進(jìn)行光合作用，所以稱它們?yōu)榉橇蜃仙?xì)菌。這類細(xì)菌的大多數(shù)尚可以利用低濃度的硫化物[1-2]。

紫色非硫細(xì)菌在黑暗好氧、光照厭氧等條件下能以不同的代謝方式，以有機(jī)物為光合作用的供氫體兼碳源，因而具有較強(qiáng)的分解和去除有機(jī)物的生理特性，其中不少種能耐受高濃度有機(jī)物，故在處理高濃度有機(jī)廢水中有著獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和廣泛的應(yīng)用前途[3-6]；同時(shí)，這類菌體細(xì)胞富含氨基酸種類全面的蛋白質(zhì)、輔酶Q和B族維生素等多種生理活性物質(zhì)，因而成為增加動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)生長(zhǎng)和增強(qiáng)防病抗病能力等功能的重要微生物資源[7-10]。近年來(lái)，由紫色非硫細(xì)菌固氮酶所催化的光合放氫研究也成為微生物制氫生產(chǎn)清潔能源的研究熱點(diǎn)[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料 供試泥樣采自茂名市周邊養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 富集培養(yǎng)基[14]。組成為：NH4Cl 1.0 g，NaHCO31.0 g，K2HPO40.2 g，CH3COONa 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 1.0 g，生長(zhǎng)因子10 ml，蒸餾水980 ml，微量元素液10 ml，pH 7.0。其中，生長(zhǎng)因子組成為：維生素B1 0.01 mg、乙尼克丁酸1.0 mg、對(duì)氨基苯甲酸1.0 mg、生物素0.01 mg,蒸餾水定容至100 ml；將NaHCO3配制成濃度5%水溶液；微量元素液組成為：FeCl3·6H2O 0.5 mg、CuSO4·5H2O 0.005 mg、H3BO40.1 mg、MnCl2·4H2O 0.005 mg、ZnSO4·7H2O 0.1 mg、Co(NO3)2·6H2O 0.05 mg，蒸餾水定容至100 ml。將以上3種溶液均經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

1.2.2 分離培養(yǎng)基。組成為：乙酸鈉2.0 g、谷氨酸2.0 g、KH2PO40.5 g、K2HPO40.5 g、NH4Cl 1.0 g、MgSO40.5 g、NaCl 1.0 g，用飲用井水定容至1 000 ml，pH 7.0。固體培養(yǎng)基按1.5%添加瓊脂。

1.2.3 液體培養(yǎng)基。組成為：乙酸鈉2.0 g、酵母膏2.0 g、KH2PO40.5 g、K2HPO40.5 g、NH4Cl 1.0 g、MgSO40.5 g、NaCl 1.0 g，用飲用井水定容至1 000 ml，pH 7.0～7.4。

1.3 紫色非硫細(xì)菌的富集分離 將20 ml池塘底泥懸浮液加入250 ml 透明塑料瓶中，加滿富集培養(yǎng)基，液面注入液體石蠟，隔絕空氣，置于30 ℃、60 W白熾燈光照下培養(yǎng)10～15 d，待液體培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，轉(zhuǎn)移至新配制的富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，重復(fù)2～3次。取搖勻的富集培養(yǎng)物100 μl，涂布于培養(yǎng)皿中，加入 20 ml冷卻至 40～45 ℃ 的固體分離培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，再在上面倒55～60 ℃ 的溶化態(tài)固體石蠟，制成固體石蠟雙層培養(yǎng)平板[15]，置于強(qiáng)度為 60 W 的白熾燈下照射培養(yǎng)10 d(30 ℃±4 ℃)。揭去將覆蓋在上層的固體石蠟，挑取粉紅色至紅色單菌落,倍比稀釋后以同樣方法進(jìn)行純化，純種穿刺接種培養(yǎng)，保藏備用。

1.4 紫色非硫細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種活化容器為150 mm×15 mm試管，擴(kuò)培容器為250 ml 透明塑料瓶(紫外線殺菌)，培養(yǎng)容器裝滿滅菌液體培養(yǎng)基后，按15%(108個(gè)/ml，V/V)接種量接種，30 ℃、60 W白熾燈光照下微氧培養(yǎng)，至培養(yǎng)液深紅色，OD660≥1.5。

1.5 生理特性試驗(yàn) 菌株的生理生化特性鑒定參照文獻(xiàn)[16]所述方法進(jìn)行。

1.6 測(cè)定方法 活菌體、離體光合色素吸收光譜檢測(cè)參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，即培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心得活菌體，用濃度60%蔗糖溶液制成菌體懸液；濃度60%蔗糖菌懸液以超聲波碎破，得紅色無(wú)細(xì)胞抽提液。2種懸液均用TU-180型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)掃描，波長(zhǎng)范圍200～900 nm。

1.7 紫色非硫光合細(xì)菌的鑒定 分離菌的培養(yǎng)特性、菌落及菌體形態(tài)、色素吸收光譜等分析參照文獻(xiàn)[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫色非硫光合細(xì)菌的分離純化 通過(guò)經(jīng)典紅螺菌培養(yǎng)基的固體石蠟雙層培養(yǎng)平板法分離、純化，得到多株光合細(xì)菌。通過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)其中一株菌的活性最佳，易于成活，故取該活性最好菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并將該株菌命名為 GB-1。

在固體培養(yǎng)基中厭氧光照培養(yǎng)，GB-1的菌落成圓形，表面低凸，邊緣完整，濕潤(rùn)，有光澤，呈紫紅色，半透明且易挑起(圖1)。在液體培養(yǎng)基中微好氧光照培養(yǎng)，GB-1菌液為深紅色，菌體均勻分布于菌液中。在無(wú)光照條件下培養(yǎng)，菌體雖能生長(zhǎng)，但培養(yǎng)物幾乎無(wú)色。

2.2 紫色非硫光合細(xì)菌的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征。GB-1為革蘭氏陰性菌，菌體形態(tài)多樣，多為桿狀，稍有彎曲甚至弧狀，大小不均，單個(gè)細(xì)菌的直徑為(0.5～1.0) μm×(1.2～4.5) μm，有的長(zhǎng)達(dá)10 μm,沒(méi)有形成芽孢，以形成分裂管的出芽方式繁殖，能明顯見(jiàn)到呈啞鈴狀的菌體(圖2)。這些特征與沼澤紅假單孢菌相似。

2.2.2 活細(xì)胞及離體光合色素光吸收特征。由圖3可知，該菌含有細(xì)菌葉綠素 a(375～ 382、585～ 596、798～ 806 nm處的吸收峰)及類胡蘿卜素(448～ 454、480、508～ 512 nm處的吸收峰)?；罴?xì)胞的光吸收特征進(jìn)一步表明它們屬于紫色非硫細(xì)菌。

2.2.3 生理生化特征。由表 1 可知，該菌能利用部分小分子有機(jī)物作為碳源和供氫體生長(zhǎng)，屬于能進(jìn)行光能異養(yǎng)生長(zhǎng)的光合細(xì)菌。它在以Na2S為唯一光合供氫體的培養(yǎng)基中微弱生長(zhǎng)。

查對(duì)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)，GB-1符合紅螺菌科紅假單胞菌屬的種屬特性，并且與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的沼澤紅假單胞菌特征相似，故初步鑒定該菌為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)。

表1 GB-1的生理生化特性

注：+為陽(yáng)性，-為陰性。

2.3 紫色非硫光合細(xì)菌GB-1的生長(zhǎng)特性 光照、氧、pH及鹽度是影響紫色非硫光合細(xì)菌生長(zhǎng)的重要因素。圖4～6顯示了GB-1的生長(zhǎng)特性。

由圖4可知，白熾燈光微氧環(huán)境最適宜GB-1生長(zhǎng)，測(cè)得此條件下的溫度為32～35 ℃。

由圖5可知，光合細(xì)菌GB-1適宜在低NaCl濃度(<1%)下生長(zhǎng)。隨著NaCl濃度的增加，GB-1生長(zhǎng)速率的減慢幅度較大，當(dāng)NaCl濃度為5%時(shí)生長(zhǎng)已很微弱。

由圖6可知，GB-1在弱堿性條件下的生長(zhǎng)速率比酸性條件下要快，最適生長(zhǎng)pH范圍為8.0～9.0。

3 結(jié)論

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Isolation, Identification and Cultural Character of a Strain of Purple Nonsulfur Photosynthetic Bacteria

LIN Yan-ling, LIU Jie-feng*, ZHOU Tian et al

(Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming, Guangdong 525000)

[Objective]The research aimed to obtain a new bacteria source of functional photosynthetic bacteria.[Method]A strain of purple nonsulfur photosynthetic bacteria GB-1 was isolated and purified from the sediment of fishpond in Maoming suburbs. The classification and identification of purple nonsulfur photosynthetic bacteria GB-1 was carried out by the observation of cell morphology, the cell coloring matter absorption spectrum determination and the study of physiological and biochemical characteristics. Meanwhile，the cultural character of the strain GB-1 was subsequently investigated．[Result]The strain GB-1 was identified asRhodopseudomonaspalustris. The optimum conditions for its growth were studied as follows: the best carbon source was a small molecule organic acid, growth temperature was 32-35 ℃, pH was 8-9, NaCl concentration was less than 1%, and the condition of illumination was incandescent light bulb and micro-aerobic. [Conclusion] Halotolerated ability of GB-1 were 5%. After the cultivation for 7 d，the removal rates for ammonia nitrogen and nitrite by the strain GB-1 was up to 57.71% and 47.45%, respectively. It appeared broad application prospects in the treatment of eutrophic water．

Purple nonsulfer bacteria; Photosynthetic bacteria;Rhodopseudomonaspalustris; Cultural character

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)基金項(xiàng)目(A201101B03，A201201C03)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生科技創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(234066)。

林燕玲(1992- )，女，廣東廣州人，本科生，專業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者，教授，碩士，從事應(yīng)用微生物方面的研究。

2015-04-21

S-03

A

0517-6611(2015)17-005-04